澳洲堅(jiān)果抗氧化肽的分離純化及肽段鑒定

付鎵榕，馬尚玄，魏元苗，徐文婷，郭剛軍, ，賀熙勇

（1.云南省熱帶作物科學(xué)研究所，云南景洪 666100；2.云南省澳洲堅(jiān)果農(nóng)業(yè)工程研究中心，云南景洪 666100）

澳洲堅(jiān)果（Macadamia integrifolia）為山龍眼科、澳洲堅(jiān)果屬的常綠喬木果樹(shù)，原產(chǎn)于澳大利亞昆士蘭東南部和新南威爾士東北部沿岸的亞熱帶雨林地區(qū)，別稱夏威夷果、澳洲核桃等，是一種珍貴的可食用干果，被譽(yù)為“干果皇后”、“世界堅(jiān)果之王”，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1]。近年來(lái)，澳洲堅(jiān)果產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅猛，2020 年末我國(guó)澳洲堅(jiān)果種植面積為26.61 萬(wàn)hm2，云南省澳洲堅(jiān)果種植面積為23.53 萬(wàn)hm2，產(chǎn)量（殼果，含水量10%）為7.50 萬(wàn)t[2]。澳洲堅(jiān)果果仁蛋白質(zhì)豐富，含量達(dá)8%～20%[3]，總氨基酸含量平均為81.82 mg/g，種類齊全，共富含17 種氨基酸，其中包括7 種人體必需氨基酸[4]，對(duì)其進(jìn)行深加工制備功能性多肽能有效提高其利用率及經(jīng)濟(jì)價(jià)值[5]。

蛋白質(zhì)在蛋白酶的作用下分解成多肽，氨基酸的組成和肽序列會(huì)影響其生物活性，從而賦予其降血壓、抗氧化和抑菌等不同的生物活性[6-8]。目前，利用生物酶法制備澳洲堅(jiān)果多肽，研究其抑菌活性、抗氧化活性的研究已有一些報(bào)道[8-9]，但對(duì)澳洲堅(jiān)果抗氧化肽的分離純化，結(jié)構(gòu)鑒定相關(guān)研究未見(jiàn)報(bào)道。利用葡聚糖凝膠可以將多肽根據(jù)分子量的大小進(jìn)行分離，且具有分離條件溫和、對(duì)樣品活性影響較小、可再生等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用在蛋白質(zhì)水解物的分離中[10]，LC-MS/MS 技術(shù)能準(zhǔn)確定量定性分析復(fù)雜混合物，在多肽結(jié)構(gòu)鑒定中應(yīng)用廣泛[11]。課題組前期對(duì)制備澳洲堅(jiān)果抗氧化肽的蛋白酶進(jìn)行了篩選，采用超濾對(duì)抗氧化肽進(jìn)行分級(jí)并用大孔樹(shù)脂進(jìn)行除雜，篩選得到分子量小于1000 Da 的組分具有最佳的抗氧化活性[12]。本研究采用葡聚糖凝膠柱層析的方法對(duì)分子量小于1000 Da 的澳洲堅(jiān)果抗氧化肽進(jìn)行分離純化處理，通過(guò)測(cè)定DPPH、羥基、ABTS+自由基清除能力與還原能力評(píng)價(jià)各級(jí)純化肽的抗氧化能力；將抗氧化活性最強(qiáng)的組分采用LC-MS/MS 進(jìn)行鑒定，得到多肽的氨基酸系列，進(jìn)行抗氧化活性、安全性、水溶性分析，為澳洲堅(jiān)果的開(kāi)發(fā)利用及澳洲堅(jiān)果抗氧化肽的深度研究提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

液壓壓榨澳洲堅(jiān)果粕 西雙版納云墾澳洲堅(jiān)果科技開(kāi)發(fā)有限公司；復(fù)配蛋白酶（20 萬(wàn)U/g）南寧東恒華道生物科技有限責(zé)任公司；DA201-C 大孔樹(shù)脂 鄭州和成新材料科技有限公司；Sephadex G-15 葡聚糖凝膠 合肥博美生物科技有限公司；還原型谷胱甘肽 上海金穗生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,2’-聯(lián)氮-雙（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二胺鹽（ABTS+）、甲酸（質(zhì)譜級(jí)）、碳酸氫銨（質(zhì)譜級(jí)）、二硫蘇糖醇、碘乙酰胺 美國(guó)Sigma 公司；乙腈 美國(guó)Thermo 公司；氫氧化鈉、三氯乙酸、無(wú)水乙醇等 分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

Easy-nLC 1200 納升級(jí)超高效液相色譜儀、電噴霧組合型離子阱Orbitrap 質(zhì)譜儀 美國(guó)Thermo公司；Acclaim PepMap RPLC C18色譜柱（1.9 μm，100? 德國(guó)Dr.Maisch GmbH；RV10 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 艾卡儀器設(shè)備有限公司；真空離心濃縮儀 德國(guó)Eppendorf 公司；Microfuge 22R 型低溫高速離心機(jī) 美國(guó)Beckman Coulter 公司；ME204E 型電子分析天平、FiveEasy 型pH 計(jì) 梅特勒-托利多儀器有限公司；UV754N 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海精風(fēng)儀器有限公司；TGL-16C 型離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；TD5A-WS 型臺(tái)式離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；DBS-160 型部分收集器 上海嘉鵬科技有限公司；BPH-9042 型恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；玻璃層析柱（φ1.0 cm×60 cm）北京瑞達(dá)恒輝科技發(fā)展有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 澳洲堅(jiān)果多肽的制備 參照課題組前期試驗(yàn)制備分子量小于1000 Da 的澳洲堅(jiān)果抗氧化肽，將液壓壓榨的澳洲堅(jiān)果果粕進(jìn)行粉碎過(guò)60 目篩（孔徑0.25 mm），果粕粉與去離子水按照1:10 比例混合，沸水浴10 min 后冷卻至55 ℃，加酶量1000 U/g，酶解pH7.5，55 ℃酶解3 h 后沸水浴15 min 滅酶，冷卻至室溫后4000 r/min 離心20 min，取上清液調(diào)pH 至4.6（澳洲堅(jiān)果蛋白等電點(diǎn)）靜置30 min，4000 r/min 離心10 min，取上清液調(diào)pH 至7.0，過(guò)1000 Da超濾膜，將分子量小于1000 Da 的多肽液用DA201-C 大孔樹(shù)脂除雜（上樣流速1 mL/min、上樣濃度15 mg/mL，上樣體積200 mL；水洗脫流速2 mL/min，水洗脫體積400 mL；400 mL 75%乙醇解吸，流速為2 mL/min），得到分子量小于1000 Da 的澳洲堅(jiān)果多肽，備用。

1.2.2 葡聚糖凝膠Sephadex G-15 分離純化 將1.2.1 中制備的澳洲堅(jiān)果抗氧化肽進(jìn)行葡聚糖凝膠分離純化。參照姚軼俊等[13]的實(shí)驗(yàn)方法，采取自然沉降法裝柱，用蒸餾水平衡后上樣，上樣濃度為15 mg/mL，上樣量為2 mL，洗脫流速為0.3 mL/min，用蒸餾水進(jìn)行洗脫，3 mL 收集為一管，在280 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度，分別收集各洗脫峰，測(cè)定各洗脫峰的抗氧化活性。

1.2.3 多肽濃度的測(cè)定 采用雙縮脲法進(jìn)行測(cè)定，參照郭剛軍等[14]的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白為標(biāo)樣制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出吸光值為縱坐標(biāo)（Y），酪蛋白質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）的回歸方程為Y=0.0461X+0.0053（R2=0.9995）。

將多肽液與等體積10%的三氯乙酸（TCA）混合，靜置30 min，在4000 r/min 下離心20 min，以除去不溶性的蛋白質(zhì)和長(zhǎng)肽鏈，取1 mL 上清液，加4 mL 雙縮脲試劑，混勻后在室溫下放置30 min，540 nm 處測(cè)定吸光值（A），按照公式計(jì)算多肽濃度。

式中：A 為吸光值（1 mL 上清液+4 mL 雙縮脲）。

1.2.4 澳洲堅(jiān)果多肽的抗氧化活性測(cè)定 參照前期試驗(yàn)方法[12]測(cè)定谷胱甘肽和不同濃度多肽液的DPPH、羥基、ABTS+自由基清除能力與還原能力，計(jì)算得出回歸方程及相關(guān)系數(shù)r（r值越接近1，相關(guān)性越好），利用回歸方程計(jì)算半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50），即清除率達(dá)到50%時(shí)對(duì)應(yīng)的樣品濃度，IC50越小，抗氧化能力越強(qiáng)。

1.2.5 抗氧化肽鑒定與分析 將1.2.4 選出的最優(yōu)組分進(jìn)行LC-MS/MS 鑒定。色譜條件：50 μm×15 cm自制柱，填充反相Acclaim PepMap RPLC C18（1.9 μm，100?）；裝樣量：5 μL；流動(dòng)相：A：0.1%甲酸水溶液；B：乙腈中0.1%甲酸；總流量：600 nL/min；LC 線性梯度：4%～8% B2 min，8%～28% B43 min，28%～40% B10 min，40%～95% B1 min，95%～95% B10 min。質(zhì)譜條件：采用電噴霧-組合型離子阱Orbitrap 質(zhì)譜儀噴淋電壓：2.2 kV，毛細(xì)管溫度：270 ℃。

利用Byonic 對(duì)原始MS 文件進(jìn)行分析，基于Uniprot_Bos_taurus 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.uniprot.org）進(jìn)行蛋白質(zhì)和肽段鑒定及定量分析。參照Lafarga等[15]的預(yù)測(cè)方法，采用ToxinPred（https://webs.iiitd.edu.in/raghava/toxinpred/design.php）預(yù)測(cè)毒性；采用Innovagen（http://www.innovagen.com/proteomicstools）預(yù)測(cè)水溶性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。采用Microsoft Excel 2019 進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入、處理與計(jì)算回歸方程；采用SPSS 27.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間差異用多重比較分析（LSD）、單因素方差分析（One-way ANOVA）進(jìn)行處理，P＜0.05 表示差異顯著；用皮爾森法（Pearson’s）進(jìn)行相關(guān)性分析，P＜0.01 為極顯著性相關(guān)。使用Origin 2021 對(duì)進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 澳洲堅(jiān)果多肽的葡聚糖凝膠分離純化

超濾只是一個(gè)壓力驅(qū)動(dòng)的膜分離過(guò)程，很難分離出分子量精確的多肽，進(jìn)一步采用葡聚糖凝膠分離進(jìn)行純化，可以獲得更精確的組分[16]。葡聚糖凝膠柱根據(jù)分子量大小對(duì)多肽進(jìn)行分離，在蛋白質(zhì)水解物的分離中應(yīng)用廣泛[9]。分子量小于1000 Da 的澳洲堅(jiān)果抗氧化肽經(jīng)Sephadex G-15 凝膠柱分離出3 個(gè)分子量大小不同的組分，結(jié)果如圖1 所示，標(biāo)記為G1、G2、G3。在葡聚糖凝膠分離純化中分子量大的組分在凝膠柱中保留時(shí)間短，分子量小在凝膠柱中保留時(shí)間長(zhǎng)[17]，由圖1 可知G1 分子量最大，G3 分子量最小。

圖1 澳洲堅(jiān)果多肽的G-15 凝膠柱層析洗脫曲線Fig.1 Elution profile of macadamia nut polypeptides in Sephadex G-15 column

2.2 澳洲堅(jiān)果多肽組分抗氧化活性

葡聚糖凝膠是利用分子篩原理，可以根據(jù)截留分子量的大小不同對(duì)物質(zhì)分離，且分離條件溫和，對(duì)樣品活性影響較小并且可重復(fù)利用，被廣泛應(yīng)用于活性物質(zhì)的分離，尤其是蛋白和多肽的分離[12,18]。利用多重抗氧化評(píng)估體系（DPPH、ABTS+、羥基自由基清除率、還原能力）對(duì)不同分子量大小的三個(gè)澳洲堅(jiān)果多肽組分進(jìn)行抗氧化活性研究，以谷胱甘肽溶液作為對(duì)照，結(jié)果如圖2～圖5 所示，并分析各組分抗氧化活性回歸方程及IC50值，結(jié)果如表1～表4 所示。

表1 澳洲堅(jiān)果多肽不同組分對(duì)DPPH 自由基清除能力的回歸方程分析Table 1 Analysis by regression equation of different components of macadamia nut polypeptides on DPPH radical scavenging ability

圖2 澳洲堅(jiān)果多肽不同組分對(duì)DPPH 自由基清除能力的影響Fig.2 Effects of different components of macadamia nut polypeptides on DPPH radical scavenging ability

2.2.1 不同組分澳洲堅(jiān)果多肽對(duì)DPPH 自由基的清除作用 DPPH 自由基清除率廣泛應(yīng)用于研究物質(zhì)的體外抗氧化活性[19-20]。由圖2 及表1 可見(jiàn)，3 個(gè)澳洲堅(jiān)果多肽組分及谷胱甘肽對(duì)DPPH 自由基均有清除作用，且清除率隨著樣品濃度的增加而增強(qiáng)，有較好的量-效關(guān)系。在相同濃度下，G3 的清除能力顯著（P＜0.05）優(yōu)于G1、G2，且均低于谷胱甘肽。在濃度0.2 mg/mL 時(shí)，G3 的清除率最優(yōu)為27.67%±1.08%，其后依次為G2（10.55%±1.04%）、G1（7.20%±0.14%）。隨著濃度的增加，各組分的清除率增加速率不同，當(dāng)濃度達(dá)到0.6、0.8 mg/mL 時(shí)，G1、G2 的清除率無(wú)顯著性差異（P＞0.05），當(dāng)濃度達(dá)到1.0 mg/mL時(shí)，G3 的清除率最優(yōu)為67.27%±0.28%，其次為G1（32.43%±0.56%）、G2（31.26%±0.48%）。從評(píng)價(jià)樣品對(duì)DPPH 自由基清除能力的IC50值來(lái)看，不同分子量多肽及谷胱甘肽對(duì)DPPH 自由基清除能力大小順序?yàn)椋汗入赘孰模↖C500.01 mg/mL）＞G3（IC500.50 mg/mL）＞G1（IC503.65 mg/mL）＞G2（IC505.23 mg/mL），不同多肽組分對(duì)DPPH 自由基的清除能力不同。參考圖1 中的出峰位置，G3 出峰位置靠后，多肽的分子量小，這與不同分子量的核桃、紅花籽、綠豆多肽的抗氧化活性研究結(jié)果相同，分子量較小的多肽抗氧化活性顯著高于分子量較大的多肽[21-23]。在本研究中，G1 對(duì)DPPH自由基的清除能力優(yōu)于G2，可能是G1 具有較多電子致密的側(cè)鏈基團(tuán)，疏水性較強(qiáng)，更易于與DPPH 自由基結(jié)合，有助于提高其抗氧化活性，這與齊希光等[24]發(fā)現(xiàn)黑籽瓜種子中高分子量多肽具有電子致密的側(cè)鏈基團(tuán)和較高的疏水性，更易于與DPPH 自由基結(jié)合的結(jié)果相符。

2.2.2 不同組分澳洲堅(jiān)果多肽對(duì)羥基自由基的清除作用 羥基自由基是廣泛存在于生物體內(nèi)的一種自由基，是氧自由基中最活潑的自由基，羥基自由基會(huì)引起生物體損傷，羥基自由基清除率是反映物質(zhì)抗氧化作用的重要指標(biāo)[25]。從圖3 及表2 可以看出，3 個(gè)澳洲堅(jiān)果多肽組分及谷胱甘肽對(duì)羥基自由基有較強(qiáng)的清除能力，且清除率與其濃度呈正相關(guān)。G3 對(duì)羥基自由基的清除率最大，在濃度2.0 mg/mL 時(shí)，G3的清除率最優(yōu)為18.82%±0.14%，G1、G2 的清除率較低分別為6.79%±1.47%、7.99%±0.69%，且兩者之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。隨著濃度的增加，清除率的增加速率大小順序?yàn)镚3、G2、G1、谷胱甘肽。當(dāng)濃度達(dá)到10.0 mg/mL，3 個(gè)組分的清除率均高于谷胱甘肽且具有顯著性差異（P＜0.05），G3 的清除率最優(yōu)為67.71%±0.48%。從評(píng)價(jià)樣品對(duì)自由基清除能力的IC50值來(lái)看，不同分子量多肽及谷胱甘肽對(duì)羥基自由基清除能力大小順序?yàn)椋篏3（IC506.18 mg/mL）＞G2（IC5012.92 mg/mL）＞G1（IC5037.77 mg/mL）＞谷胱甘肽（IC5054.78 mg/mL），不同多肽組分對(duì)羥基自由基的清除能力不同，可能是因?yàn)镚3 分子量較小可阻斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，促使自由基轉(zhuǎn)化成更加穩(wěn)定的物質(zhì)，表現(xiàn)出更好的羥基自由基清除能力[26]。

表2 澳洲堅(jiān)果多肽不同組分對(duì)羥基自由基清除能力的回歸方程分析Table 2 Regression equation analysis of different components of macadamia nut polypeptides on hydroxyl radical scavenging ability

圖3 澳洲堅(jiān)果多肽不同組分對(duì)羥基自由基清除能力的影響Fig.3 Effects of different components of macadamia nut polypeptides on hydroxyl radical scavenging ability

2.2.3 不同組分澳洲堅(jiān)果多肽對(duì)ABTS+自由基的清除作用 ABTS+自由基清除率廣泛運(yùn)用于體外抗氧化活性的評(píng)價(jià)，該方法具有操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)迅速、靈敏度高等特點(diǎn)[27-28]。由圖4 及表3 可見(jiàn)，3 個(gè)澳洲堅(jiān)果多肽組分及谷胱甘肽對(duì)ABTS+自由基的清除能力均隨樣品質(zhì)量濃度的增加而增大。不同組分對(duì)ABTS+的清除率具有顯著性差異（P＜0.05），G3、谷胱甘肽的清除率高于G1、G2。濃度為0.2、0.4 mg/mL時(shí)，3 個(gè)多肽組分的清除率均低于谷胱甘肽。隨著濃度的增加，清除率的增加速率大小順序?yàn)镚1、G2、G3、谷胱甘肽。當(dāng)濃度達(dá)到0.6 mg/mL 時(shí)，G3 的清除率為94.35±0.08%，高于谷胱甘肽的清除率91.37%±0.08%；當(dāng)濃度達(dá)到1.0 mg/mL 時(shí)，G3 的清除率為94.27%±0.00%與谷胱甘肽94.56%±0.41%無(wú)顯著性差異（P＞0.05），優(yōu)于其它評(píng)價(jià)樣品，G1 與G2 的清除率分別為89.55%±0.70%、84.57%±0.17%，兩者之間差異性顯著（P＜0.05）。從評(píng)價(jià)樣品對(duì)自由基清除能力的IC50值來(lái)看，不同分子量多肽及谷胱甘肽對(duì)ABTS+自由基清除能力大小順序?yàn)椋汗入赘孰模↖C500.00003 mg/mL）＞G3（IC500.02 mg/mL）＞G1（IC500.31 mg/mL）＞G2（IC500.36 mg/mL），G3 對(duì)ABTS+自由基的清除能力最強(qiáng)，可能是分子量小的多肽的親水性較好，而ABTS+自由基是一種親水性自由基，小分子肽更易與ABTS+自由基發(fā)生反應(yīng)，從而表現(xiàn)出更好的ABTS+自由基清除能力，這與油茶餅粕多肽分子量較小的組分抗氧化活性更強(qiáng)的研究結(jié)果相同[29]。G1 的清除能力優(yōu)于G2，這可能是受到氨基酸序列與組成的影響[30]。

表3 澳洲堅(jiān)果多肽不同組分對(duì)ABTS+自由基清除能力的回歸方程分析Table 3 Regression equation analysis of different components of macadamia nut polypeptides on ABTS+ radical scavenging ability

圖4 澳洲堅(jiān)果多肽不同組分對(duì)ABTS+自由基清除能力的影響Fig.4 Effect of different components of macadamia nut polypeptides on ABTS+ radical scavenging ability

2.2.4 不同組分澳洲堅(jiān)果多肽還原能力分析 還原能力是指物質(zhì)提供電子的能力，吸光值越大還原能力越強(qiáng)[31]。從圖5 及表4 可以看出，不同分子量的澳洲堅(jiān)果多肽及谷胱甘肽均具有還原能力，還原能力與濃度呈正相關(guān)。G3 組分的還原能力優(yōu)于G1、G2 及谷胱甘肽。在濃度2.0 mg/mL 時(shí)，G3 的還原能力為0.493±0.00，優(yōu)于其它評(píng)價(jià)樣品，G1 還原能力最弱為0.130±0.02。隨著濃度的增加，還原能力的增加速率大小順序?yàn)镚3、谷胱甘肽、G1、G2。當(dāng)濃度達(dá)到10.0 mg/mL 時(shí)，G3 的還原能力最優(yōu)為1.701±0.04，G1、G2 的還原能力分別為0.581±0.01、0.548±0.00，兩者之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。從評(píng)價(jià)樣品對(duì)自由基清除能力的IC50值來(lái)看，不同分子量多肽及谷胱甘肽還原能力大小順序?yàn)椋篏3（IC502.19 mg/mL）＞谷胱甘肽（IC504.35 mg/mL）＞G1（IC508.09 mg/mL）＞G2（IC508.63 mg/mL），澳洲堅(jiān)果蛋白結(jié)構(gòu)中具有還原能力較強(qiáng)的基團(tuán)，經(jīng)過(guò)酶解被分散到低相對(duì)分子量的多肽中，經(jīng)超濾、葡聚糖凝膠分離后，分子量低的肽段被富集，肽段越短使具有較多電子的基團(tuán)暴露越充分，因而使G3 表現(xiàn)出最強(qiáng)的還原能力，這與松仁、核桃等植物蛋白的研究結(jié)果相同[17,21]。

表4 澳洲堅(jiān)果多肽不同組分還原能力的回歸方程分析Table 4 Regression equation analysis of different components of macadamia nut polypeptides on reducing power

圖5 澳洲堅(jiān)果多肽不同組分對(duì)還原能力的影響Fig.5 Effect of different components of macadamia nut polypeptides on reducing power

2.3 澳洲堅(jiān)果多肽組分與抗氧化活性相關(guān)性分析

用皮爾森法（Pearson’s）對(duì)不同澳洲堅(jiān)果多肽組分與抗氧化活性指標(biāo)的IC50值進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果如表5 所示，澳洲堅(jiān)果多肽不同組分與羥基自由基清除能力（r=0.953，P＜0.01）、還原能力（r=0.823，P＜0.01）之間存在極顯著相關(guān)，與ABTS+自由基清除能力（r=0.796，P＜0.01）之間存在顯著相關(guān)，與DPPH 自由基清除能力（r=0.651，P＞0.05）無(wú)顯著性相關(guān)。結(jié)合2.2 中的分析可知分子量最小的G3 組分抗氧化活性最好，多肽的抗氧化活性受其分子量的影響，這可能是分子量小的多肽空間位阻較小，活性基團(tuán)（巰基、酚羥基）暴露更充分，能更好的與自由基發(fā)生反應(yīng)，表現(xiàn)出更好的抗氧化活性[21-22]。

表5 澳洲堅(jiān)果多肽組分與抗氧化活性的相關(guān)性分析Table 5 Correlation analysis between antioxidant activities and polypeptide components of macadamia nut

葡聚糖凝膠柱層析分離得到的3 個(gè)組分對(duì)DPPH、ABTS+、羥基自由基清除率、還原能力均隨濃度的增加而增強(qiáng)，在相同濃度條件下G3 組分的抗氧化活性最強(qiáng)，且G3 組分的羥基自由基清除率、還原能力均高于同濃度的谷胱甘肽溶液。各項(xiàng)抗氧化評(píng)估指標(biāo)的IC50值均為G3 組分最優(yōu)，且ABTS+、羥基自由基清除率及還原能力的IC50值優(yōu)于谷胱甘肽。以上結(jié)果表明純化肽具有更好的清除自由基的能力和還原力，抗氧化活性G3＞G2＞G1。肽的抗氧化活性與其分子量之間存在相關(guān)性，其活性可能隨著肽分子量的降低而增加，而抗氧化肽的自由基清除作用可能與氨基酸的組成和序列有關(guān)[32]。因此，選擇G3 組分進(jìn)行多肽結(jié)構(gòu)鑒定研究。

2.4 抗氧化肽的鑒定

采用LC-MS/MS 法檢測(cè)G3 分子量以鑒定氨基酸的序列，掃描的范圍為300～1800 Da，總離子流色譜圖見(jiàn)圖6。質(zhì)譜采集的raw 文件，經(jīng)過(guò)軟件Byonic數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，得到46 條肽段，這些肽段長(zhǎng)度均小于10 個(gè)氨基酸，按匹配值得分高于200 分的9 條肽段進(jìn)行分析，結(jié)果如表6 所示，得分代表著該肽段的可信度，相對(duì)豐度值代表著該肽段在被分析組分中的含量。自然界中，某些多肽具有毒性并且會(huì)致死，如鵝膏毒肽類、微囊藻肽類、蝎毒肽類等[33]。因此，有必要對(duì)澳洲堅(jiān)果蛋白源的抗氧化肽進(jìn)行安全性評(píng)估，結(jié)果如表6 所示，基于氨基酸序列預(yù)測(cè)9 個(gè)肽段無(wú)毒性，安全性較高，可進(jìn)行肽的人工合成，進(jìn)行細(xì)胞或者動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，研究其在食品、醫(yī)藥等行業(yè)的應(yīng)用。

表6 G3 組分的肽序列分析Table 6 Peptide sequence analysis of G3 the polypeptide component

圖6 G3 組分總離子流色譜圖Fig.6 Total ion chromatogram of the G3 polypeptide component

大量研究表明，多肽的氨基酸序列、分子量和疏水性對(duì)其抗氧化活性影響巨大[34]，疏水性氨基酸在反應(yīng)體系中的提高肽段在脂質(zhì)體系中的溶解度，加強(qiáng)肽段與脂溶性自由基如DPPH 自由基的相互作用[35]。Ma 等[36]認(rèn)為含有2～10 個(gè)氨基酸的寡肽比其他大多數(shù)多肽或者蛋白質(zhì)具有更高抗氧化潛力，劉輝等[37]發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)抗氧化活性的多肽分子量低于6000 Da，含有2～20 個(gè)氨基酸。本研究鑒定的活性肽分子量較低（631～920 Da），由3～7 個(gè)氨基酸殘基組成，這與論文報(bào)道的研究結(jié)果一致。

Agrawal 等[35]從珍珠粟蛋白水解物分離出的較好抗氧化活性的多肽SDRDLLGPNNQYLPK，認(rèn)為該肽具有抗氧化能力與肽序列中含有的疏水性氨基酸Gly，Leu 和Pro 有關(guān)。Ranathunga 等[38]發(fā)現(xiàn)，星康吉鰻蛋白水解物中純化的抗氧化肽由55%的疏水殘基組成肽中的疏水性氨基酸對(duì)其抗氧化作用有很大貢獻(xiàn)。由表6 可見(jiàn)有6 條肽段的疏水性氨基酸占比達(dá)到60%以上，說(shuō)明HLLPK、KEFFP、KEFFPA、SWIIN、HFP、SIFFPGPR 肽段賦予了G3 組分較好的抗氧化活性。經(jīng)預(yù)測(cè)各多肽的水溶性不同，其中SWIIN、HFP、SIFFPGPR 難溶于水，水溶性好的HLLPK、KEFFP、KEFFPA 肽段更利于進(jìn)行抗氧化劑、保健品等的開(kāi)發(fā)利用，其二級(jí)質(zhì)譜圖如圖7所示。

圖7 抗氧化肽的二級(jí)譜圖Fig.7 Tandem mass spectra of antioxidant peptides

多肽的N 端以酸性氨基酸殘基為主，C 末端為堿性氨基酸殘基[39]。Trp 含有氨基，His 含有咪唑環(huán)，Tyr、Phe 含有酚羥基，Met、Cys 含有巰基，這些帶有特征基團(tuán)的氨基酸殘基存在于肽段中時(shí)，能有效增強(qiáng)其自由基清除活性[40]。肽結(jié)構(gòu)中的疏水性氨基酸也與其抗氧化活性密切相關(guān)。Met 具有金屬螯合能力，Pro、Leu 可提供質(zhì)子用于中和活性自由基[41]。相同的疏水性氨基酸同時(shí)出現(xiàn)（如Ala-Ala，Leu-Leu 和Pro-Pro 等）能賦予較強(qiáng)的自由基清除活性[35]。以上分析結(jié)果表明HLLPK、KEFFP、KEFFPA 肽段疏水性氨基酸占比高，氨基酸數(shù)量、結(jié)構(gòu)及分子量符合抗氧化多肽的特征，且具備較好的水溶性有利于產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用。

3 結(jié)論

分子量小于1000 Da 的澳洲堅(jiān)果多肽經(jīng)Sephadex G-15 凝膠柱分離，得到G1、G2、G3 三個(gè)組分，其中G3 組分的抗氧化活性最強(qiáng)，DPPH、羥基、ABTS+自由基清除能力及還原能力的IC50值分別為0.5、6.18、0.02、2.19 mg/mL。G3 組分經(jīng)LCMS/MS 鑒定、分析，得到3 種澳洲堅(jiān)果抗氧化肽序列為HLLPK、KEFFP、KEFFPA，其分子量分別為606.84、666.83、737.92 Da，疏水性氨基酸占比分別為60%、60%、66.67%。本研究結(jié)果可以為澳洲堅(jiān)果抗氧化肽的人工合成、細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供參考和依據(jù)，以期篩選獲得功能活性較強(qiáng)的抗氧化肽，研究其作為天然抗氧化劑在食品、藥品或化妝品中的應(yīng)用。