基于高通量測(cè)序探究空間電場(chǎng)對(duì)帶魚保鮮過程中微生物群落的影響

汪倩，謝超 ，鄭霖波，鄭煒

（1.浙江海洋大學(xué) 食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 舟山 316000；2.舟山市常青海洋食品有限公司，浙江 舟山 316000）

帶魚（Trichiuruslepturus）體帶狀，側(cè)扁。舟山帶魚是冷水帶魚，個(gè)頭小，肉質(zhì)細(xì)膩嫩滑，營養(yǎng)價(jià)值高，含有豐富的鎂元素，對(duì)心血管系統(tǒng)有很好的保護(hù)作用，有利于預(yù)防高血壓、心肌梗塞等心血管疾病。然而，帶魚在捕撈后極易死亡，其屬中脂魚類，不飽和脂肪酸含量高，易受微生物和內(nèi)源性蛋白酶的影響而產(chǎn)生胺類和醛類物質(zhì)，發(fā)生腐敗變質(zhì)[1-2]，因此，探明帶魚貯藏期間的微生物菌群多樣性是控制細(xì)菌繁殖、延長(zhǎng)帶魚貨架期的基礎(chǔ)。

空間電場(chǎng)技術(shù)是新興的食品綠色冷加工技術(shù)，研究前景十分廣闊。電場(chǎng)保鮮是一種物理保鮮手段，能夠在很大程度上保留食品的天然感官品質(zhì)。目前電場(chǎng)保鮮裝置主要分為低壓靜電場(chǎng)、低壓變頻電場(chǎng)等，研究主要集中于果蔬、禽肉、瘦肉等方面。陳文波等[3]的研究表明，低壓靜電場(chǎng)可抑制微生物生長(zhǎng)，可通過低壓靜電處理延長(zhǎng)白切雞貨架期。岑劍偉等[4]研究空間電場(chǎng)對(duì)羅非魚的冷藏保鮮效果，發(fā)現(xiàn)高壓靜電場(chǎng)結(jié)合冰溫氣調(diào)組合條件可保持新鮮魚片的品質(zhì)，貨架期也得到有效延長(zhǎng)，為冰鮮羅非魚魚片產(chǎn)品在國內(nèi)超市流通提供可行的技術(shù)條件。

高通量測(cè)序技術(shù)具有通量高、檢測(cè)范圍廣、精準(zhǔn)等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用在海捕魚類、土壤、水體、醫(yī)療等領(lǐng)域。已有較多研究使用高通量測(cè)序?qū)ξ⑸锞浣M成進(jìn)行分析[5-6]，但空間電場(chǎng)結(jié)合低溫對(duì)帶魚微生物群落影響鮮見報(bào)道。本文基于高通量測(cè)序技術(shù)，在進(jìn)行微生物信息分析、菌落總數(shù)等品質(zhì)指標(biāo)測(cè)定的基礎(chǔ)上，對(duì)貯藏至20 d 的帶魚微生物群落堿基信息測(cè)序，產(chǎn)生的堿基序列通過操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）群落聚類及相關(guān)分析、多樣性分析、相關(guān)性分析等手段分析后，旨在獲得影響帶魚保鮮效果的微生物群落組成和發(fā)育信息，探究不同電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)帶魚微生物群落組成的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮舟山帶魚：舟山市普陀海匯水產(chǎn)有限公司。E.Z.N.A?Mag-Bind Soil DNA Kit 試劑：艾森生物（杭州）有限公司；Qubit3.0 DNA 試劑盒：美國Life Technologies 公司；Hieff NGS?DNA 分選磁株、2×Hieff?Robust PCR Master Mix 試劑：翌圣生物科技（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

商用型空間電場(chǎng)發(fā)生器（BX-2000）、電場(chǎng)板：浙江馳力科技股份有限公司；INGENIUS 凝膠成像系統(tǒng)：上海復(fù)日科技有限公司；臺(tái)式離心機(jī)（CF - 16RN0）：Thermo Fisher 公司；數(shù)字萬用表（208107）：福祿克測(cè)試儀器（上海）有限公司；熒光計(jì)（Q32866 Qubit 3.0）：美國Invitrogen 生物技術(shù)有限公司；MiSeq 測(cè)序平臺(tái)：美國Illumina 公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

以同一批次新鮮舟山帶魚作為試驗(yàn)原料，挑選魚體大小均勻、魚肉飽滿有彈性、魚皮顏色鮮亮、魚眼明亮無渾濁、品質(zhì)完好無破損的個(gè)體運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室后進(jìn)行清洗、分裝。

對(duì)照組（CG）：使用無菌水及無菌紗布進(jìn)行沖洗以及過濾，將帶魚放入無電場(chǎng)的環(huán)境下，-4 ℃微凍保鮮，樣品標(biāo)記為Y1。

試驗(yàn)組（TG）：-4 ℃下將帶魚樣品放入2、3 kV/m的電場(chǎng)強(qiáng)度下進(jìn)行處理，魚體距離電場(chǎng)板均為15 cm，電場(chǎng)頻率為50 Hz，樣品標(biāo)記為Y2、Y3。

選擇對(duì)照組和試驗(yàn)組的樣品分別于0~20 d 內(nèi)定期取菌體沉淀物進(jìn)行微生物菌群研究，判定其鮮度變化。在貯藏第20 天時(shí)取出帶魚樣本，使用高通量測(cè)序?qū)~微生物群落進(jìn)行提取與進(jìn)一步分析。

1.3.2 菌落總數(shù)的測(cè)定

帶魚菌落總數(shù)測(cè)定依照GB 4789.2—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》[7]進(jìn)行。

1.3.3 樣品微生物提取

準(zhǔn)確稱取10.0 g 帶魚樣本，加入90 mL 無菌生理鹽水，然后采用無菌紗布過濾并用無菌水淋洗后，于離心機(jī)進(jìn)行離心處理（12 000 r/min、10 min）。取下層沉淀物進(jìn)行分析，每個(gè)樣本做3 次平行試驗(yàn)[8]。

1.3.4 DNA 抽取

參照基因組DNA 提取試劑盒說明，提取帶魚微生物中總基因組DNA，在瓊脂糖凝膠電泳處理下檢測(cè)樣本中的基因組DNA 以及純度，瓊脂糖凝膠電泳的體積分?jǐn)?shù)為1%[9-10]。之后使用生物信息學(xué)分析并進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.3.5 微生物群落分析

通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物擴(kuò)增，對(duì)樣本的數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析以及拼接劃分，收集各種序列進(jìn)行進(jìn)一步分析，對(duì)各個(gè)級(jí)別的菌落結(jié)構(gòu)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，經(jīng)過處理后，對(duì)菌落分布以及變化進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析以及可視化處理。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)3 次。獲得的數(shù)據(jù)采用Excel 2013 與SPSS 18.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 空間電場(chǎng)對(duì)菌落總數(shù)的影響

不同處理?xiàng)l件對(duì)帶魚菌落總數(shù)的影響見圖1。

圖1 不同處理?xiàng)l件對(duì)帶魚菌落總數(shù)的影響Fig.1 Effects of different treatment conditions on the total colonies of Trichiurus lepturus

由圖1 可知，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，整個(gè)貯藏期內(nèi)帶魚菌落總數(shù)呈明顯增長(zhǎng)的趨勢(shì)，組內(nèi)存在顯著差異（P<0.05），電場(chǎng)組與無電場(chǎng)組增長(zhǎng)趨勢(shì)較為相似。貯藏10~20 d 時(shí)，對(duì)照組（CG）的菌落總數(shù)一直高于試驗(yàn)組（TG），貯藏0~5 d 時(shí)菌落總數(shù)無顯著差異（P>0.05）。

帶魚在貯藏過程中，魚體中的微生物生長(zhǎng)對(duì)帶魚魚體產(chǎn)生一定的分解作用并生成各種物質(zhì)從而影響帶魚的鮮度，所以菌落總數(shù)是判斷魚鮮度的重要指標(biāo)之一。帶魚樣本的最初菌落總數(shù)值為3.99 lg（CFU/g），這主要是由魚體中自身攜帶的內(nèi)源性微生物與船舶捕撈以及車輛運(yùn)輸過程中從外界環(huán)境中接觸的外源性微生物作用導(dǎo)致。在貯藏期間電場(chǎng)組的菌落總數(shù)始終低于無電場(chǎng)組，說明空間電場(chǎng)作用能夠?qū)~中部分微生物的生長(zhǎng)繁殖起到抑制作用。根據(jù)GB 4789.2—2016的規(guī)定，當(dāng)菌落總數(shù)數(shù)值大于6.00 lg（CFU/g）時(shí)帶魚已經(jīng)變質(zhì)不可食用。3 組帶魚菌落總數(shù)均隨著時(shí)間延長(zhǎng)而增長(zhǎng)，貯藏第5 天到第20 天時(shí)，3 kV/m 的菌落總數(shù)始終高于2 kV/m 組的菌落總數(shù)。在貯藏至第20 天時(shí)，2 kV/m 組菌落總數(shù)最低，為5.27 lg（CFU/g），說明在貯藏期間2 kV/m 電場(chǎng)較3 kV/m 電場(chǎng)更能抑制微生物的生長(zhǎng)繁殖，應(yīng)進(jìn)一步對(duì)電場(chǎng)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，研究不同電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)帶魚保鮮過程中不同貯藏時(shí)間微生物菌落總數(shù)的抑制效果。

2.2 樣品測(cè)序數(shù)據(jù)分析

樣品測(cè)序數(shù)據(jù)分析結(jié)果見表1~表3。

表1 不同電場(chǎng)強(qiáng)度處理下帶魚序列數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Table 1 Sequencing data of Trichiurus lepturus treated under electric fields at different intensities

表2 OTU 序列數(shù)統(tǒng)計(jì)Table 2 Number of OTU sequences of Trichiurus lepturus

表3 OTU 分類學(xué)信息Table 3 OTU taxonomy information

MiSeq 測(cè)序會(huì)產(chǎn)生大量的16S 序列，OTU 是在遺傳生物學(xué)和統(tǒng)計(jì)系統(tǒng)學(xué)研究中，為方便分析而人為對(duì)微生物菌群分類添加的標(biāo)志。由表1 中數(shù)據(jù)可以得出，帶魚樣本的有效序列、堿基數(shù)目和平均序列長(zhǎng)度大致相同，表明電場(chǎng)強(qiáng)度越大，檢測(cè)出的有效序列與堿基數(shù)目越少。

表2 中為所有優(yōu)化序列與OTU 代表序列對(duì)比，選取與代表性序列相似性大于97% 的序列及其輸出名，可得到不同樣品間的OTU 和序列數(shù)目的差異，需結(jié)合物種注釋加以分析。OTU 物種的注釋表明，帶魚在空間電場(chǎng)與-4 ℃結(jié)合處理貯藏條件下帶魚微生物群落均為細(xì)菌，并未發(fā)現(xiàn)真菌群落。門水平上，舟山新鮮帶魚樣品總細(xì)菌組成主要以變形菌門與厚壁菌門為主。綱水平上，丙型變形菌綱（Gammaproteobacteria）為優(yōu)勢(shì)菌綱，丙型變形菌綱分布廣泛，各組樣品均有OTU聚類[11-13]?？扑奖憩F(xiàn)出了較高的豐度，聚類結(jié)果為希瓦氏菌科（Shewanellaceae）、假單胞菌科（Pseudomonadaceae）、鞘脂桿菌科（Sphingobacteriaceae）、微球菌科（Micrococcaceae）、莫拉氏菌科（Moraxellaceae）、草酸桿菌科（Oxalobacteraceae）、李斯特菌科（Listeriaceae）、柄桿菌科（Caulobacteraceae）。在屬水平上，擬桿菌屬（Bacteria）、嗜冷菌屬（Psychrobacter）一直占據(jù)優(yōu)勢(shì)，在舟山帶魚冷藏期間豐度呈上升趨勢(shì)，在帶魚腐敗變質(zhì)中起重要作用。此次OTU 分析中屬類有嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、肉桿菌屬（Carnobacterium）。

2.3 多樣性指數(shù)分析

Alpha 指數(shù)稀釋性曲線見圖2。

圖2 Alpha 指數(shù)稀釋性曲線Fig.2 Rarefaction curve of alpha index

Miseq 測(cè)序后的OTU 聚類能夠表征微生物群落的具體信息，從圖2 中可以看出，當(dāng)樣本讀取次數(shù)超過30 000 時(shí)各組樣本曲線接近平緩，說明測(cè)序合理，進(jìn)一步增加測(cè)序數(shù)量不會(huì)帶來更多的OTU 聚類，進(jìn)而影響試驗(yàn)結(jié)果與分析[14]。當(dāng)讀取次數(shù)小于10 000 時(shí)，隨著抽樣數(shù)量的增加，樣本中檢測(cè)出的OTU 數(shù)量快速上升，當(dāng)讀取次數(shù)大于10 000 之后，隨著讀取次數(shù)的增加，樣本中所檢測(cè)出的OTU 數(shù)量緩慢上升并且逐漸趨于穩(wěn)定，但從整體來看Y2 所檢測(cè)出的樣本中OTU 數(shù)量要高于Y1 與Y3，并且Y1 中隨著讀取次數(shù)上升所檢測(cè)出的樣本OTU 數(shù)量要大于Y3，當(dāng)讀取次數(shù)大于20 000 后樣本中所檢測(cè)出OTU 數(shù)量在2 kV/m 電場(chǎng)組中最高而3 kV/m 電場(chǎng)組中最低，說明電場(chǎng)強(qiáng)度的大小對(duì)從樣本中檢測(cè)OTU 有較大的影響。

2.4 菌群組成分析

不同電場(chǎng)強(qiáng)度下屬水平上群落豐度表現(xiàn)熱圖見圖3。

圖3 不同電場(chǎng)強(qiáng)度下屬水平上群落豐度表現(xiàn)熱圖Fig.3 Heat map of abundance of microbial genera under different electric field intensities

群落豐度表現(xiàn)熱圖用顏色對(duì)比來反映數(shù)據(jù)的信息情況，可以直觀顯示樣本中菌落含量的變化。由圖3可以看出，在施加外部空間電場(chǎng)的處理下，帶魚中菌落組成發(fā)生了明顯的改變。施加空間電場(chǎng)后帶魚中變形桿菌（Proteobacteria）的群落豐度減少，說明在一定程度上施加外部空間電場(chǎng)能夠抑制變形桿菌的生長(zhǎng)繁殖，但Y2 和Y3 之間差異不明顯，說明電場(chǎng)強(qiáng)度的大小對(duì)抑制變形桿菌生長(zhǎng)繁殖影響不明顯，需要進(jìn)一步進(jìn)行研究。厚壁菌（Firmicutes）的群落豐度在施加空間電場(chǎng)之后變大，說明空間電場(chǎng)對(duì)厚壁菌的影響不明顯?？赡苁怯捎诳臻g電場(chǎng)抑制了其他菌種的生長(zhǎng)繁殖，導(dǎo)致對(duì)電場(chǎng)不敏感的厚壁菌生長(zhǎng)繁殖速度加快。放線菌（Actinobacteria）在施加電壓變頻電場(chǎng)之后菌落豐度降低，并且Y3 的降低幅度大于Y2，說明空間電場(chǎng)對(duì)放線菌的生長(zhǎng)繁殖具有一定的抑制作用并且隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的增大抑制的作用愈發(fā)明顯。除以上3 種主要菌群外，空間電場(chǎng)對(duì)其他菌群也有一定的抑制效果，并且隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的增大抑制效果明顯[15-19]。說明空間電場(chǎng)能夠抑制變形桿菌以及放線菌的生長(zhǎng)繁殖，但厚壁菌對(duì)空間電場(chǎng)可能不敏感。

2.5 樣本群落結(jié)構(gòu)

不同電場(chǎng)強(qiáng)度下微生物群落結(jié)構(gòu)見圖4，共線性關(guān)系見圖5。

圖4 不同電場(chǎng)強(qiáng)度下微生物群落結(jié)構(gòu)Fig.4 Microbial community structures under different electric field intensities

圖5 共線性關(guān)系Fig.5 Collinearity diagram

由圖4 可知，在施加空間電場(chǎng)并在-4 ℃環(huán)境中貯藏，帶魚樣本中的優(yōu)勢(shì)微生物為嗜冷菌（Psychrobacter），Y1、Y2、Y3 組中嗜冷菌占比微生物群落結(jié)構(gòu)均達(dá)到了80% 以上，說明嗜冷菌比較適應(yīng)-4 ℃貯藏環(huán)境。在施加空間電場(chǎng)之后嗜冷菌的含量均發(fā)生了下降，2 kV/m 組下降的幅度要略大于3 kV/m 組，說明空間電場(chǎng)在一定程度上能夠抑制嗜冷菌的生長(zhǎng)繁殖，而且2 kV/m 的電場(chǎng)參數(shù)對(duì)嗜冷菌的抑制效果要優(yōu)于3 kV/m。從圖5 可以看出，在施加空間電場(chǎng)之后厚壁菌（Firmicutes）的相對(duì)豐度升高，說明空間電場(chǎng)對(duì)厚壁菌生長(zhǎng)繁殖影響不明顯，可能是由于空間電場(chǎng)抑制了嗜冷菌的生長(zhǎng)繁殖導(dǎo)致厚壁菌有更多的空間進(jìn)行繁衍，從而使厚壁菌的相對(duì)豐度上升[20-23]。放線菌（Actinobacteria）對(duì)空間電場(chǎng)比較敏感，隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的增加，放線菌的相對(duì)豐度逐漸降低，說明空間電場(chǎng)對(duì)放線菌的生長(zhǎng)繁殖具有一定的抑制效果。

2.6 相關(guān)性分析

樣本距離熱圖見圖6，主成分分析見圖7。

圖6 樣本距離熱圖Fig.6 Heat map of sample distance

圖7 主成分分析Fig.7 Principal component analysis

樣本組之間的相關(guān)性檢驗(yàn)是驗(yàn)證試驗(yàn)可靠以及樣本合理的重要標(biāo)準(zhǔn)之一，越接近0，分離度越小，相關(guān)性越好[24]。從圖6 可以看出，Y1 與Y2、Y3 之間的分離度分別為0.10 與0.11，Y2 與Y3 的分離度為0.06，說明電場(chǎng)組（Y2、Y3）與Y1 相比分離度較小，相關(guān)性較大。

成分分析是通過分析數(shù)據(jù)，使用方差分析分析不同樣本之間的距離及差異。使用百分比判斷差異度，兩點(diǎn)之間越近，說明具有相似的菌群組成[25]。由圖7可知，電場(chǎng)組Y2 與Y3 樣本具有較大差異，而無電場(chǎng)組Y1 與兩組電場(chǎng)組距離較遠(yuǎn)差異明顯，說明施加空間電場(chǎng)，對(duì)微生物菌群具有一定影響，并且電場(chǎng)強(qiáng)度的大小對(duì)微生物菌群也有部分影響。

3 結(jié)論

以舟山帶魚為研究對(duì)象，采用Illumina Miseq 高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)不同電場(chǎng)強(qiáng)度下貯藏至20 d 的帶魚微生物群落堿基信息測(cè)序，研究不同電場(chǎng)強(qiáng)度下帶魚樣品中菌群組成及微生物變化情況。通過OTU 聚類、多樣性指數(shù)分析、菌群組成分析、樣本菌落結(jié)構(gòu)分析、相關(guān)性分析手段，探究空間電場(chǎng)對(duì)帶魚微生物組成的變化。OTU 聚類屬主要有希瓦氏菌屬（Shewanella）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、工地桿菌屬（Pedobacter）、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、紫色桿菌屬（Janthinobacterium）、索絲菌屬（Brochothrix）、嗜冷菌屬（Psychrobacter）、柄桿菌屬（Caulobacter），根據(jù)菌屬相對(duì)豐度結(jié)果和經(jīng)驗(yàn)，推測(cè)嗜冷菌屬（Psychrobacter）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、紫色桿菌屬（Janthinobacterium）是帶魚微生物腐敗主要致腐菌。結(jié)果表明，新鮮舟山帶魚樣品以嗜冷菌屬、棲熱菌屬與假交替單胞菌為主，相對(duì)豐度分別為23.24%、24.27% 和17.98%；其中嗜冷菌屬作為主要優(yōu)勢(shì)腐敗菌在帶魚腐敗過程中起重要作用。對(duì)照組Y1 的OTU 多樣性高，有多個(gè)獨(dú)有OTU 聚類菌屬，電場(chǎng)處理組Y2、Y3 也有多個(gè)獨(dú)有菌屬，但均無致腐性和致病性。綜上所述，空間電場(chǎng)保鮮技術(shù)在帶魚低溫貯藏過程中能夠有效抑制腐敗菌的滋生，延緩帶魚的腐敗變質(zhì)，有利于帶魚品質(zhì)控制；同時(shí)，Miseq 基因組測(cè)序技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)產(chǎn)品貯藏期間腐敗菌的快速檢測(cè)。上述相關(guān)技術(shù)能夠?yàn)樗a(chǎn)品貯藏保鮮和質(zhì)量安全監(jiān)測(cè)領(lǐng)域提供理論依據(jù)，具有較好的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景。