富含植物乳桿菌的普洱熟茶品質分析

伯年國，劉琨毅，李若愚，王藤，梁正維，沙艮，陳思琴，陳紅艷，馬燕 ，趙明

（1.云南農業(yè)大學 茶學院，食品科學技術學院，云南 昆明 650201；2.云南農業(yè)大學 云南省藥用植物生物學重點實驗室，西南中藥材種質創(chuàng)新與利用國家地方聯合工程研究中心，云南 昆明 650201；3.宜賓職業(yè)技術學院 五糧液技術與食品工程學院，四川 宜賓 644100）

植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）不僅是一種存在于發(fā)酵乳制品、谷物等食品中的乳酸菌[1-2]，而且是一種具有調節(jié)免疫功能與腸道功能等生理功效的微生物[3-4]。植物乳桿菌可以提高食品風味、改善食品品質，因此廣泛應用于發(fā)酵食品的生產[5]。例如，Ge 等[6]利用植物乳桿菌與釀酒酵母共同發(fā)酵小麥面條，結果表明，共同發(fā)酵改善了小麥面條的面筋網絡結構，提升了小麥面的風味。王紫琳等[7]利用植物乳桿菌發(fā)酵雪蓮果，開發(fā)了一款特色雪蓮果植物發(fā)酵飲料。馬曉娟等[8]研究發(fā)現，經植物乳桿菌發(fā)酵后枸杞漿的風味得到明顯改善，抗氧化活性顯著提升。鄧成林等[9]利用植物乳桿菌發(fā)酵綠茶飲料顯著提升了其風味及口感，增強了綠茶飲料的抗氧化活性。馮雪娜等[10]利用植物乳桿菌發(fā)酵紅茶飲料，發(fā)現發(fā)酵后紅茶飲料的揮發(fā)性風味物質增加，營養(yǎng)成分更加豐富，極大提升了口感。因此，植物乳桿菌是一種益生菌，可以維持人體腸道菌群的穩(wěn)態(tài)，增強腸道免疫系統，同時也是一種能提高發(fā)酵食品品質的發(fā)酵劑。

普洱熟茶是以云南大葉種茶樹[（Camelliasinensisn.）var.assamiea（Masters）Kitmaura]的一芽二葉或三葉制成的曬青茶為原料，經微生物后發(fā)酵而成的茶產品[11]。微生物發(fā)酵是普洱熟茶加工的關鍵步驟[12]，不僅形成了普洱熟茶滋味醇和、湯色紅褐、陳香顯著的風味[13]，而且決定了普洱熟茶具有降脂減肥、抗氧化、抗腫瘤、保護神經損傷、抑制α-葡萄糖苷酶等功能[14-16]。已有研究表明植物乳桿菌參與了普洱熟茶發(fā)酵。郝彬秀等[17]總結了參與普洱熟茶發(fā)酵的微生物，發(fā)現霉菌（黑曲霉、米曲霉、青霉等）、酵母（Blastobotrysadeninivorans、釀酒酵母等）、細菌（凝結芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌等）是主要微生物。Bian 等[18]研究發(fā)現，普洱熟茶發(fā)酵過程中乳酸桿菌科、嗜熱霉屬、芽孢桿菌科等細菌可以將不溶性多糖分解并生成具有多種生物活性的2 型單糖和影響茶葉滋味的羧酸。李晨晨等[19]研究發(fā)現普洱熟茶發(fā)酵過程中存在大量嗜熱細菌，例如植物乳桿菌、凝結芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、乳酸片球菌等細菌。發(fā)酵中存在植物乳桿菌，表明普洱熟茶具有開發(fā)為富含益生菌產品的潛力。

強化發(fā)酵（enhanced fermentation，EF）是將一種外源微生物接入到未經滅菌的原料中進行發(fā)酵，進而提高發(fā)酵產品品質的一種方式[20]。前期通過接種產黃青霉P1、地衣芽孢桿菌L1、接種傘枝犁頭霉A1、阿曲霉A1 強化發(fā)酵普洱熟茶，發(fā)現接菌發(fā)酵提高了茶褐素和可溶性糖含量，降低了兒茶素、兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素、沒食子兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯和表沒食子兒茶素含量，茶湯的甜味和厚重感分數增加，苦味、澀味和酸味分數降低提升了茶葉品質[21-24]。本研究從普洱熟茶中分離鑒定得到的植物乳桿菌接種于普洱熟茶發(fā)酵中進行強化發(fā)酵，分析發(fā)酵樣品的感官品質特征、化學成分及微生物群落結構，以期應用該菌生產出一款富含植物乳桿菌的普洱熟茶。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

曬青毛茶（一芽三葉）原料：普洱市茶葉科學研究所；沒食子酸（gallic acid，GA）、表沒食子兒茶素（epigallocatechin，EGC）、表兒茶素沒食子酸酯（epicatechin-3-gallate，ECG）、兒茶素（catechin，C）、表兒茶素（epicatechin，EC）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocahechin-3-gallate，EGCG）、兒茶素沒食子酸酯（catechin-3 - gallate，CG）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（gallocahechin-3-gallate，GCG）、沒食子兒茶素（gallocatechin，GC）、咖啡堿（caffeine，CA）、鞣花酸（ellagic acid，EA）、木犀草素（luteolin，Lut）、楊梅素（myricetin，Myr）、槲皮素（quercetin，Que）、山奈酚（kaempferol，Kea）、茶堿（theophylline，Theo）、花旗松素（taxifolin，Tax）、蘆丁（rutin，Rut）標準品：成都曼思特生物科技有限公司；細菌DNA提取試劑盒：北京諾禾致源科技股份有限公司；甲醇、乙腈（均為分析純）：美國TEDIA 試劑公司；磷酸、鹽酸（均為分析純）：成都市科龍化工試劑廠；MRS 肉湯培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；DNA 聚合酶（2×Rapid Taq Master Mix）：南京諾唯贊生物科技公司。

1.2 儀器與設備

756CRT 型紫外可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；CP214 型電子分析天平：上海奧豪斯儀器有限公司；CT15RE 型離心機：日本日立公司；101A-2型電熱鼓風恒溫干燥箱：上海市崇明實驗儀器廠；CS-2000 型高速多功能粉碎機：武義海納電器有限公司；SW-CJ-1B 型超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；1200 型高效液相色譜[配有TSKgel ODS-80TM 色譜柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）]：美國安捷倫公司；Trident 960 型基因擴增儀：上海力新儀器有限公司；DW-86L626 型醫(yī)用低溫保存箱：青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司；YS6060 型色差儀：深圳市三恩時科技有限公司；XB.K.25 型血球計數板：上海求精生化試劑儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 植物乳桿菌PET003 分離鑒定

對從普洱熟茶中分離純化得到的菌株進行了形態(tài)學觀察，并進行16S rRNA 基因序列測序分析。

1.3.2 植物乳桿菌PET003 強化發(fā)酵普洱熟茶試驗

參照文獻[21-24]的方法，稱取30 kg 曬青毛茶，量取茶樣質量30% 的純凈水進行潮水靜置一夜。將茶葉裝入發(fā)酵筐（50 cm×40 cm×60 cm），每隔5 d 翻堆一次，25 d 后發(fā)酵完成。前期研究發(fā)現第20 天時接菌發(fā)酵的普洱熟茶品質最好，因此，本研究在第20 天時取出5 kg 茶葉，接入茶葉質量0.1% 的植物乳桿菌PET003發(fā)酵劑置于底層。用紗布將其與其他未接菌的隔開一同靜置發(fā)酵，25 d 時結束發(fā)酵。采用5 點取樣法取樣，-80 ℃貯藏備用；將未接入植物乳桿菌PET003 的樣品命名為CK，接入植物乳桿菌PET003 強化發(fā)酵的樣品命名為EF，每組樣品進行3 個重復。

1.3.3 高通量測序分析微生物多樣性

使用細菌DNA 提取試劑盒來提取茶樣中的細菌DNA，并利用DNA 聚合酶與引物338F 和806R 進行聚合酶鏈式反應，反應產物在北京諾禾致源科技股份有限公司進行基因測序。

1.3.4 乳桿菌菌落計數

采用GB 4789.35—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》檢測方法對茶樣中乳桿菌屬進行計數。

1.3.5 茶葉化學成分測定

參照GB/T 8305—2013《茶水浸出物測定》、GB/T 8314—2013《茶游離氨基酸總量的測定》、GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》的方法分別測定水浸出物（water extracts，WE）、游離氨基酸（free amino acids，FAA）、茶多酚（tea polyphenols，TP）的含量。采用蒽酮硫酸法[21]測定可溶性糖（soluble sugars，SS），采用萃取比色法[25]測定茶紅素（thearubigins，TR）、茶黃素（theaflavins，TF）及茶褐素（theabrownins，TB）的含量。采用高效液相色譜法定量茶樣中兒茶素組分含量[26]。

1.3.6 茶樣感官審評

5 位具有評茶資格的人員（3 女2 男），根據GB/T 23776—2018《茶葉感官審評方法》對茶葉樣品進行感官審評。

1.3.7 定量描述分析

使用定量描述分析法對茶湯的滋味特征進行評價，其中包括苦味、澀味、酸味、甜味和醇厚感這5 個屬性。每個屬性的評分范圍從0~9，其中0 表示較弱，9 表示較強[27]。同時，使用YS6060 型色差儀來測定茶湯的顏色。

1.4 數據處理

使用IBM SPSS Statistics 22.0 軟件進行數據處理和統計分析，數值以平均值加減標準差的形式表示。采用GraphPad Prism 8 軟件進行主成分分析。使用TBtools 1.09854 繪制歸一化后的數據的聚類熱圖。

2 結果與分析

2.1 植物乳桿菌的分離鑒定結果

菌株PET003 的菌落形態(tài)及微觀特征見圖1 與圖2。

圖1 菌株PET003 的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of strain PET003

圖2 菌株PET003 的革蘭氏染色顯微觀察Fig.2 Gram staining microscopic observation of strain PET003

由圖1 可知，將菌株接種到MRS 培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d 后，菌落形態(tài)呈圓形、乳白色、表面光滑凸起、邊緣整齊、不透明的菌落。由圖2 可知，經革蘭氏染色后均為紫色，呈桿狀或棒狀，單個或成鏈狀。

將菌株測序所得序列與NCBI 數據庫進行比對，選擇模式物種進行建樹分析，結果如圖3 所示。菌株PET003 與LactiplantibacillusplantarumATCC_14917 聚為一支，因此將PET003 鑒定為植物乳桿菌。

圖3 細菌16S rRNA 基因序列系統發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of bacterial 16S rRNA gene sequence

2.2 發(fā)酵樣品植物乳桿菌數量

各茶樣植物乳桿菌菌落數見表1。

表1 各茶樣植物乳桿菌菌落數Table 1 Lactiplantibacillus plantarum colony number in tea samples

由表1 可知，應用平板計數法分析接菌發(fā)酵樣的菌落為2.07×106CFU/g，顯著高于對照樣（6.00×105CFU/g，P<0.05）。由此可知接入植物乳桿菌強化發(fā)酵過程中，植物乳桿菌可以存活，并作用于發(fā)酵過程，更重要的是，干燥后存在大量植物乳桿菌，表明開發(fā)了一款富含植物乳桿菌的普洱熟茶。

研究發(fā)現，在傳統發(fā)酵過程中，細菌的片球菌屬、芽孢桿菌屬、短狀桿菌屬、歐文氏菌屬、特布爾西菌屬、乳桿菌屬占優(yōu)勢地位，同時乳桿菌屬呈現出在第一、二次翻堆時增加隨后開始減少、出堆時增加的趨勢[28]。因此，植物乳桿菌在普洱熟茶出堆后還大量存在。本研究為了進一步研究接入植物乳桿菌PET003 強化發(fā)酵普洱熟茶出堆樣中乳酸菌的生長情況，應用Illumina MiSeq 測序技術，測定16S rRNA 基因序列，對操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）進行鑒定，結果見圖4。發(fā)酵樣品細菌目水平群落結構如圖5所示。

圖4 EF 與CK 乳桿菌屬（Lactobacillus）DNA 序列片段數柱狀圖Fig.4 Column graph of Lactobacillus reads in tea samples with enhanced fermentation（EF）and control fermentation（CK）

圖5 EF 與CK 細菌目水平群落結構圖Fig.5 Community structure of bacteria in tea samples with enhanced fermentation（EF）and control fermentation（CK）

由圖4、圖5 可知，強化發(fā)酵樣品中歸為乳桿菌屬（Lactobacillus）的DNA 序列片段數顯著增加（P<0.05），表明接菌發(fā)酵增加了植物乳桿菌的數量。接菌發(fā)酵樣品的優(yōu)勢細菌主要是微球菌（Micrococcales）（62%）、Staphylococcales（13%）、乳桿菌目（Lactobacillales）（10%）。傳統發(fā)酵樣品的優(yōu)勢細菌主要是微球菌目（Micrococcales）（46%）、鞘脂桿菌目（Sphingobacteriales）（16%）、假單胞菌目（Pseudomonadales）（13%）。比較發(fā)現，接入植物乳桿菌PET003 發(fā)酵顯著增加了乳桿菌目（Lactobacillales）、微球菌目（Micrococcales）的相對豐富度。而植物乳桿菌屬于乳桿菌目（Lactobacillales），因此接入植物乳桿菌PET003 發(fā)酵改變了普洱熟茶發(fā)酵微生物群落結構，增加了植物乳桿菌的數量。

2.3 發(fā)酵茶葉品質

為評估發(fā)酵茶樣品質，對樣品進行審評結果見表2、圖6~圖8。

表2 傳統發(fā)酵（CK）與強化發(fā)酵（EF）感官審評結果Table 2 Sensory evaluation results of tea samples with enhanced fermentation（EF）and control fermentation（CK）

圖6 CK 的感官審評照片Fig.6 Sensory evaluation photos of control

由圖6、圖7 可知，樣品茶湯均呈紅褐色，但接菌發(fā)酵后茶湯顏色更深。由圖8 可知，接菌發(fā)酵樣的甜味（4.82±0.17）、醇厚感（6.82±0.19）顯著高于傳統發(fā)酵（P<0.05），澀味（1.19±0.15）、酸味（0.31±0.02）顯著低于傳統發(fā)酵（P<0.05），滋味更加醇厚順滑、陳香持久無堆味。

圖7 EF 的感官審評照片Fig.7 Sensory evaluation photos of enhanced fermentation

圖8 發(fā)酵樣茶湯的滋味特征Fig. 8 Taste characteristics of fermented tea soup

應用色差儀測定茶湯色差值的結果見圖9。

圖9 發(fā)酵樣品茶湯的顏色參數Fig.9 Color parameters of tea soup of fermented tea sample

由圖9 可知，EF 的L* 值（36.13±0.00）、a* 值（45.92±0.05）和b* 值（57.79±0.18）顯著高于CK（P<0.05），結果與審評結果相符。因此接入植物乳桿菌發(fā)酵增加了茶湯湯色。

茶樣特征成分的結果見表3。

表3 發(fā)酵茶樣特征成分含量Table 3 Contents of characteristic components of fermented tea samples

由表3 可知，EF 樣品的可溶性糖（5.11±1.02）%、茶褐素（14.41±0.33）%、茶多酚（7.57±1.63）%、兒茶素（0.15±0.03）mg/g、兒茶素沒食子酸酯（0.12±0.00）mg/g、咖啡堿（52.92±0.12） mg/g、沒食子兒茶素（34.50±0.22）mg/g 和表兒茶素（0.13±0.04）mg/g 含量均顯著高于CK（P<0.05）。有研究表明，可溶性糖、茶褐素、游離氨基酸、簡單兒茶素含量與茶湯甜度和厚度呈正相關[29]，因此，該結果與感官審評EF 茶湯色澤紅褐，滋味的甜度與醇厚感高于CK 相符，與代祥青等[30]的研究結果一致。因此，植物乳桿菌PET003 強化發(fā)酵提高了普洱熟茶的風味品質。

3 結論

本研究從普洱熟茶中分離得到的植物乳桿菌PET003 在發(fā)酵第20 天時接種于茶樣中進行強化發(fā)酵，發(fā)酵后樣品的乳桿菌目（Lactobacillales）、微球菌目（Micrococcales）和植物乳桿菌屬的DNA 序列片段數量增加，含2.07×106CFU/g 的植物乳桿菌。接菌發(fā)酵后茶樣中可溶性糖、茶褐素、游離氨基酸、咖啡堿、兒茶素、表兒茶素、沒食子兒茶素、兒茶素沒食子酸酯的含量顯著高于對照茶樣，顯著提升了茶葉的品質。因此，本研究開發(fā)了一種富含植物乳桿菌，且感官品質優(yōu)良的普洱熟茶。