基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析綠鰭馬面鲀腦組織響應(yīng)密度脅迫的分子機(jī)制

段曉晨，程起群

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306)

綠鰭馬面鲀(Thamnaconusseptentrionalis)，隸屬于鲀形目(Tetraodontiformes)，單角鲀科(Monacanthidae),馬面鲀屬，又稱馬面魚、剝皮魚等，是我國(guó)沿海較為常見的經(jīng)濟(jì)魚類[1]。經(jīng)過近40年的高強(qiáng)度開發(fā)，綠鰭馬面鲀資源量迅速衰減，目前已不能充分滿足市場(chǎng)需求[2]。以“養(yǎng)”代“捕”，是緩解野生資源壓力、保障綠鰭馬面鲀市場(chǎng)供給的有效途徑。2011年，綠鰭馬面鲀的人工繁育技術(shù)取得突破[3]，之后開始應(yīng)用于工廠化養(yǎng)殖。

密度過高是水產(chǎn)養(yǎng)殖活動(dòng)中的重要限制因子[4]，密度脅迫會(huì)使種群內(nèi)對(duì)空間、食物和氧氣等資源的競(jìng)爭(zhēng)加劇，基因表達(dá)和適應(yīng)能力受到影響[5]。如SUN等[6]的研究表明，擁擠可以顯著誘導(dǎo)魚的免疫反應(yīng)，而長(zhǎng)期處于密度脅迫下會(huì)損害魚類的免疫能力；QIANG等[7]的研究顯示，高密度條件會(huì)改變肌肉脂肪酸的組成，刺激脂質(zhì)代謝酶顯著上調(diào)。LIU等[8]發(fā)現(xiàn)，高密度養(yǎng)殖導(dǎo)致多種消化酶的活性顯著降低，進(jìn)而影響生物的免疫能力。目前，關(guān)于綠鰭馬面鲀腦組織對(duì)密度脅迫的分子響應(yīng)機(jī)制尚不明確。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)是揭示生物體內(nèi)分子機(jī)制的重要手段[9]，應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)可以對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物進(jìn)行高通量測(cè)序，通過測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)情況分析和基因功能注釋，明確特定條件下相關(guān)基因的表達(dá)情況[10]，目前轉(zhuǎn)錄組分析被普遍應(yīng)用到水產(chǎn)動(dòng)物的生物學(xué)研究中。NORIKO等[11]發(fā)現(xiàn)，背景顏色不僅影響平均紅細(xì)胞血紅蛋白量(mean corpuscular hemoglobin，MCH)水平，而且影響大腦中的促性腺激素釋放激素II(chicken-type gonadotropin-releasing hormone II，cGnRH-II)水平，并表明cGnRH-II可能在調(diào)節(jié)比目魚大腦中的 MCH 神經(jīng)功能、食物攝入方面發(fā)揮作用。周江等[12]研究發(fā)現(xiàn)，星斑川鰈(Platichthysstellatus)腦組織中除促卵泡激素(follicle-stimulating hormone, FSH)外，促性腺激素(gonadotropins hormone, GnH)、促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone, GnRH)以及催乳素釋放肽受體(prolactin-releasing peptide-receptor, PrRPR)等均在卵巢退化期時(shí)期個(gè)體的腦組織中上調(diào)表達(dá)。劉怡南等[13]發(fā)現(xiàn)，igdcc3、prlh、mch、pitx2等基因在七彩神仙魚(Symphysodonharaldi)的腦組織中呈性別差異表達(dá)，可能在該魚腦組織類固醇激素形成及配子發(fā)生的調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重要作用。

本研究利用 Illumina 平臺(tái)對(duì)綠鰭馬面鲀的腦組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，再對(duì)測(cè)序所得數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控、比對(duì)、差異性分析，然后再進(jìn)行GO(Gene Ontology)富集分析、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析、趨勢(shì)分析，以期找到綠鰭馬面鲀腦組織響應(yīng)密度脅迫的差異表達(dá)基因和關(guān)鍵通路,為了解綠鰭馬面鲀響應(yīng)密度脅迫的分子機(jī)制及綠鰭馬面鲀的集約化養(yǎng)殖提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用綠鰭馬面鲀?nèi)∽灾袊?guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所贛榆研究中心，系人工自繁。選取體質(zhì)健壯、規(guī)格較為一致且平均體質(zhì)量為(9.5± 0.5)g的個(gè)體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)前，將綠鰭馬面鲀放在水容量40 m3的室內(nèi)水泥池中暫養(yǎng)一周，密度為50尾·m-3，將此池樣本作為對(duì)照組；實(shí)驗(yàn)時(shí)，從大池將魚分至水容量1 m3的聚乙烯微流水養(yǎng)殖桶中，設(shè)置2個(gè)密度試驗(yàn)組，即100尾·m-3的中密度組和500尾·m-3的高密度組，每個(gè)密度設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

實(shí)驗(yàn)過程中，水溫保持(17±1)℃，pH為8.20±0.90，采用微流水飽和充氣養(yǎng)殖，溶氧保持在(6.7±0.4)mg·L-1，換水率120%。每日于8∶00、12∶00、15∶00分別投餌1次，總投餌量為魚平均體質(zhì)量的3%。實(shí)驗(yàn)周期50 d。

1.2 組織樣本采集

首先，取對(duì)照組大池中的綠鰭馬面鲀腦組織；然后，在實(shí)驗(yàn)開始后的第25天和第50天時(shí)，分別在兩個(gè)密度試驗(yàn)組的養(yǎng)殖桶中取3尾魚，用丁香酚對(duì)實(shí)驗(yàn)魚進(jìn)行麻醉、致暈、致死，然后將魚撈起放置于干凈的解剖盤中，用酒精擦拭魚體表面，隨后用解剖剪剪開魚腦上方的骨骼，用鑷子取出腦組織。腦組織取出后，快速切成厚度<0.5 cm的任意片狀，迅速浸入10倍體積 RNAwait 液(Solarbio)中，然后按照RNAwait液的使用說明，將其4 ℃暫存一晝夜，再放置于-20 ℃冰箱冷凍保存，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后期實(shí)驗(yàn)。為便于后續(xù)的敘述，各組代號(hào)的含義如下：1)CB指對(duì)照組的腦組織；2)D1B指第25天時(shí)100尾·m-3的腦組織；3)D2B指第25天時(shí)500尾·m-3的腦組織；4)d1B指第50天時(shí)100 尾·m-3的腦組織；5)d2B指第50天時(shí)500尾·m-3的腦組織。

1.3 RNA的提取與檢測(cè)、文庫構(gòu)建及測(cè)序

取出冷凍的綠鰭馬面鲀腦組織，采用Trizol法對(duì)腦組織進(jìn)行RNA提取，檢測(cè)合格后得到該魚腦組織的總RNA。通過帶有Oligo(dT)的磁珠富集具有polyA尾巴的真核mRNA后，用緩沖液把mRNA打斷。以片段化的mRNA為模版、隨機(jī)寡核苷酸為引物，在M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶體系中合成cDNA第一條鏈，隨后用RNaseH降解RNA鏈，并在DNA polymerase I 體系下,以dNTPs為原料合成cDNA第二條鏈。純化后的雙鏈cDNA經(jīng)過末端修復(fù)、加A尾并連接測(cè)序接頭，用AMPure XP beads篩選200 bp左右的cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并再次使用AMPure XP beads純化PCR產(chǎn)物，最終獲得文庫。構(gòu)建好的文庫利用Illumina HiSeq平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.4 測(cè)序數(shù)據(jù)組裝及基因功能注釋

將測(cè)序獲得的原始數(shù)據(jù)(raw reads)利用fastp[14]進(jìn)行質(zhì)控、去除含接頭reads、去除含N比例大于10%的reads、去除全部都是A堿基的reads、去除低質(zhì)量reads(質(zhì)量值Q≤20的堿基數(shù)占整條read的50%以上)。得到高質(zhì)量干凈序列(clean reads)進(jìn)行后續(xù)分析。將質(zhì)控后的過濾數(shù)據(jù)利用HISAT2軟件與綠鰭馬面鲀的參考基因組進(jìn)行比對(duì)[15]，以便進(jìn)行后續(xù)的基因表達(dá)和差異分析。

1.5 基因表達(dá)和差異分析

本研究采用 FPKM(expected number of fragments per kilobase of transcript sequence per millions base pairs sequenced)方法計(jì)算基因的表達(dá)量[16]。再用DESeq2[17]軟件包篩選差異表達(dá)基因, 篩選閥值為Fold change>2和Q值<0.05，且Q值越小基因表達(dá)量差異越顯著[18]。最后，進(jìn)行差異表達(dá)基因的GO和 KEGG富集分析(false discovery rate, FDR< 0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 腦轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)

運(yùn)用 Illumina HiSeq 高通量測(cè)序平臺(tái)分別對(duì)不同密度組綠鰭馬面鲀腦組織進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，共得到100.3 Gb RawData，過濾后得到98.9 Gb CleanData。堿基質(zhì)量及組成分析顯示，每組GC含量區(qū)間為48.46%～50.38%，各樣品Q20的堿基質(zhì)量值比例均不小于96.67%，各樣品Q30的堿基質(zhì)量值比例均不小于91.36%(表1)。

表1 綠鰭馬面鲀腦轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2.2 基因表達(dá)量總體分布

對(duì)照組和密度脅迫組綠鰭馬面鲀腦組織間比較能反映它們?cè)诨虮磉_(dá)水平上的基本差異(圖1-a～d)。圖1中所示每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)基因，橫坐標(biāo)表示兩個(gè)分組間的差異倍數(shù)對(duì)數(shù)值，縱坐標(biāo)表示兩個(gè)分組差異的FDR的-Lg值，紅色(group_2相對(duì)于group_1表達(dá)量上調(diào))和藍(lán)色(表達(dá)量下調(diào))的點(diǎn)表示基因的表達(dá)量有差異(判斷標(biāo)準(zhǔn)為 FDR <0.05, 且差異倍數(shù)在兩倍以上)，黑色的點(diǎn)為沒有差異。其中，越靠近兩端的基因，差異程度越大。在CB-vs-D1B中，有197個(gè)差異基因上調(diào)，418個(gè)差異基因下調(diào)；在CB-vs-D2B中，有114個(gè)差異基因上調(diào)，301個(gè)差異基因下調(diào)；在CB-vs-d1B中，有317個(gè)差異基因上調(diào)，491個(gè)差異基因下調(diào)；在CB-vs-d2B中，有311個(gè)差異基因上調(diào)，608個(gè)差異基因下調(diào)(圖1-e)。

圖1 密度脅迫組和對(duì)照組差異基因表達(dá)狀況

2.3 GO功能富集分析

將轉(zhuǎn)錄組信息與 GO(Gene Ontology)數(shù)據(jù)庫作比對(duì)，分別注釋到了生物過程(biological process, BP)、分子功能(molecular function, MF)、細(xì)胞組分(cellular component, CC)3個(gè)亞類(圖2)，其中紅色代表上調(diào)表達(dá)，藍(lán)色代表下調(diào)表達(dá)。在生物過程亞類中，得到最顯著注釋的條目依次為：細(xì)胞過程、單組織過程、代謝過程、生物調(diào)控、生物過程的調(diào)節(jié)；在分子功能亞類中, 得到最顯著注釋的條目依次為：結(jié)合、催化活性；在細(xì)胞組分亞類中, 得到最顯著注釋的條目依次為：細(xì)胞組分、細(xì)胞、細(xì)胞膜。但在CB-vs-D2B中，顯著差異注釋的條目相較其他3組更少。

圖2 差異表達(dá)基因的 GO 功能富集分析

2.4 KEGG 功能富集分析

用KEGG數(shù)據(jù)庫富集出在密度脅迫后表現(xiàn)出顯著差異的代謝途徑繪制KEGG富集氣泡圖(圖3)，其中Q值為多重假設(shè)檢驗(yàn)校正之后的P值。利用Q值最小的前20個(gè)pathway來作圖，縱坐標(biāo)為pathway，橫坐標(biāo)為富集因子(該pathway中差異基因數(shù)量除以該pathway中所有數(shù)量)，大小表示數(shù)量多少，顏色越紅Q值越小。富集分析的結(jié)果表明：在CB-vs-D1B中，差異表達(dá)的基因富集到267條通路上，其中富集程度最高的通路依次是：氧化磷酸化、晝夜節(jié)律、產(chǎn)熱、病毒蛋白與細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體的相互作用(圖3-a)。在CB-vs-D2B中，差異表達(dá)的基因富集到230條通路上，其中富集程度最高的通路是：晝夜節(jié)律(圖3-b)。在CB-vs-d1B中，差異表達(dá)的基因富集到278條通路上，其中富集程度最高的通路是：晝夜節(jié)律、蛋白質(zhì)消化吸收(圖3-c)。在CB-vs-d2B中，差異表達(dá)的基因富集到269條通路上，其中富集程度最高的通路是：晝夜節(jié)律、賴氨酸降解、MAPK信號(hào)通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用(圖3-d)。

2.5 趨勢(shì)分析

趨勢(shì)分析(trend analysis)是針對(duì)多個(gè)連續(xù)型樣本(至少3個(gè))的特點(diǎn)(樣本間包含特定的時(shí)間、空間或處理劑量大小順序)而對(duì)基因的表達(dá)模式(在多階段中表達(dá)曲線的形狀)進(jìn)行聚類的方法。然后從聚類結(jié)果中挑選符合一定生物學(xué)特性(如表達(dá)量持續(xù)上升)的基因集。

2.5.1 100尾·m-3組的趨勢(shì)分析

來自CB_D1B_d1B的1 520個(gè)基因被分配到8個(gè)趨勢(shì)中(圖4)，其中 Profile 2、Profile 1、Profile 0和Profile 6為顯著趨勢(shì)。在Profile 2中，有361個(gè)基因表達(dá)先下調(diào)后恢復(fù)到脅迫前的狀態(tài)，KEGG通路分析顯示其中最主要富集的通路是白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移和細(xì)胞凋亡。在Profile 1中，有273個(gè)基因表達(dá)先下調(diào)后趨平，KEGG通路分析顯示其中最主要富集的通路是晝夜節(jié)律。在Profile 0中，有271個(gè)基因表達(dá)持續(xù)性下調(diào)，KEGG通路分析顯示其中最主要富集的通路是MAPK信號(hào)通路、晝夜節(jié)律、皮質(zhì)醇合成與分泌、鈣信號(hào)通路、ECM-受體相互作用。在Profile 6中，有234個(gè)基因表達(dá)情況先上調(diào)后趨平，KEGG通路分析顯示其中最主要富集的通路是氧化磷酸化、產(chǎn)熱、代謝途徑、糖酵解/糖異生、碳代謝、氨基酸的生物合成、核糖體和RNA降解。

圖4 CB_D1B_d1B所有趨勢(shì)總圖

2.5.2 500尾·m-3組的趨勢(shì)分析

來自CB_D2B_d2B的1 547個(gè)基因被分配到8個(gè)趨勢(shì)中(圖5)，其中Profile 2、Profile 0、Profile 4和Profile1為顯著趨勢(shì)。在Profile 2中，有363個(gè)基因表達(dá)先下調(diào)后恢復(fù)到脅迫前的狀態(tài)，KEGG通路分析顯示其中最主要富集的通路是Toll樣受體信號(hào)通路。在Profile 0中，有349個(gè)基因表達(dá)持續(xù)性下調(diào)，KEGG通路分析顯示其中最主要富集的通路是MAPK信號(hào)通路、cAMP 信號(hào)通路、多巴胺能突觸、鈣信號(hào)通路和谷氨酸能突觸。在Profile 4中，有178個(gè)基因表達(dá)先不變?cè)偕险{(diào)，KEGG通路分析顯示其中最主要富集的通路是PPAR信號(hào)通路、過氧化物酶體、氮代謝和類固醇生物合成。在Profile 1中，有168個(gè)基因表達(dá)先下調(diào)再趨平，KEGG通路分析顯示其中最主要富集的通路是晝夜節(jié)律。

圖5 CB_D2B_d2B所有趨勢(shì)總圖

3 討論

為了滿足人類社會(huì)需求，水產(chǎn)動(dòng)物高密度養(yǎng)殖逐漸成為降低養(yǎng)殖成本、提高養(yǎng)殖產(chǎn)量的重要養(yǎng)殖模式，然而過度追求高密度養(yǎng)殖會(huì)造成種群內(nèi)對(duì)資源的掠奪加劇，最終可能造成水產(chǎn)動(dòng)物生存能力的降低[19]。當(dāng)密度發(fā)生改變時(shí)，水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)并非單個(gè)的基因或者信號(hào)通路發(fā)生變化，而是整個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)均會(huì)發(fā)生改變[20]。目前，關(guān)于綠鰭馬面鲀的的研究多集中在生長(zhǎng)發(fā)育、攝食習(xí)性、養(yǎng)殖技術(shù)、營(yíng)養(yǎng)成分和遺傳結(jié)構(gòu)分析[21-25]。近些年，轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在多種水產(chǎn)動(dòng)物研究中均得到廣泛應(yīng)用，其在生物進(jìn)化研究、免疫應(yīng)答反應(yīng)和毒理學(xué)等方面取得了大量的研究進(jìn)展[26]。為了闡明綠鰭馬面鲀腦組織的基因表達(dá)模式，探究明顯富集通路的關(guān)鍵基因，本研究首次構(gòu)建了綠鰭馬面鲀腦組織的cDNA文庫，并通過Illumina平臺(tái)進(jìn)行了高通量測(cè)序分析。

3.1 腦組織差異表達(dá)基因數(shù)目和GO富集

對(duì)綠鰭馬面鲀腦組織的不同組進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、組裝、注釋，發(fā)現(xiàn)在CB-vs-D1B中，有197個(gè)差異基因上調(diào)，418個(gè)差異基因下調(diào)；在CB-vs-D2B中，有114個(gè)差異基因上調(diào)，301個(gè)差異基因下調(diào)；在CB-vs-d1B中，有317個(gè)差異基因上調(diào)，491個(gè)差異基因下調(diào)；在CB-vs-d2B中，有311個(gè)差異基因上調(diào)，608個(gè)差異基因下調(diào)。表明綠鰭馬面鲀?cè)谑艿矫芏让{迫后可能激活了細(xì)胞的代謝，以應(yīng)答應(yīng)激環(huán)境下對(duì)綠鰭馬面鲀體內(nèi)造成的傷害。

在GO功能富集分析中，注釋得到的最顯著的條目有細(xì)胞過程、單組織過程、代謝過程、結(jié)合和催化活性等部分，表明綠鰭馬面鲀腦組織的此類生理過程受到了顯著影響。但與其他組相比，CB-vs-D2B中的顯著差異注釋的條目相較于其他3組相對(duì)較少，可能是相對(duì)其他組來說，D2B在密度脅迫下受到的影響更小。

3.2 各組中均得到富集的通路

在對(duì)綠鰭馬面鲀腦組織進(jìn)行KEGG分析后發(fā)現(xiàn)，各個(gè)組中的晝夜節(jié)律通路都得到了顯著富集。晝夜節(jié)律又稱日夜節(jié)律，是生物體內(nèi)的生物鐘面對(duì)外界信號(hào)影響時(shí)所作出的一種內(nèi)源性調(diào)控應(yīng)答反應(yīng)機(jī)制，從而使生物的行為節(jié)律以及內(nèi)分泌系統(tǒng)與外界信號(hào)同步, 因此是機(jī)體對(duì)外界環(huán)境信息的一種適應(yīng)性應(yīng)答[27]。clock基因編碼的蛋白質(zhì)在調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律中起到核心作用。該蛋白具有組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活性，是堿性-螺旋-環(huán)-螺旋家族的轉(zhuǎn)錄因子，在DNA損傷、細(xì)胞凋亡等過程具有重要作用[28]。cry是一種蛋白質(zhì)編碼基因，與cry相關(guān)的疾病包括延遲睡眠階段障礙和睡眠障礙，其相關(guān)通路包括BMAL1-CLOCK、NPAS2，激活晝夜節(jié)律基因的表達(dá)與該基因相關(guān)的GO注釋包括核苷酸結(jié)合和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合[29]。這些與生物體晝夜節(jié)律相關(guān)的基因異常表達(dá)可能代表著密度脅迫影響了綠鰭馬面鲀腦組織對(duì)于生物鐘的調(diào)控，且隨著時(shí)間改變未恢復(fù)到正常水平。

3.3 趨勢(shì)分析中的關(guān)鍵通路

在綠鰭馬面鲀腦組織的趨勢(shì)分析中，發(fā)現(xiàn)MAPK信號(hào)通路在CB_D1B_d1B和CB_D2B_d2B均持續(xù)性下調(diào)表達(dá)，是真核細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞外信號(hào)到細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡和死亡等多種生理過程。其中bdnf基因是編碼神經(jīng)生長(zhǎng)因子蛋白質(zhì)家族的成員，選擇性剪接產(chǎn)生多個(gè)轉(zhuǎn)錄變體，其中至少一個(gè)編碼前體蛋白，該前體蛋白經(jīng)過蛋白水解加工產(chǎn)生成熟蛋白[30]。rps6ka3是一種蛋白質(zhì)編碼基因，該基因是編碼絲氨酸/蘇氨酸激酶的 RSK家族的成員[31]。il1r1基因編碼屬于白細(xì)胞介素-1 受體家族的細(xì)胞因子受體，它是參與許多細(xì)胞因子誘導(dǎo)的免疫和炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)[32]。由此看來，MAPK信號(hào)通路的持續(xù)性下調(diào)表達(dá)對(duì)綠鰭馬面鲀的蛋白質(zhì)編碼造成了不利影響，并可能造成該魚的抗病免疫功能降低。

另外，鈣離子信號(hào)通路也在CB_D1B_d1B和CB_D2B_d2B中持續(xù)性下調(diào)表達(dá)，鈣離子信號(hào)通路可以調(diào)節(jié)有氧代謝[33]，其中htr5a是一種蛋白質(zhì)編碼基因，起神經(jīng)遞質(zhì)、有絲分裂原和激素的作用，G蛋白介導(dǎo)這種受體的活性，它可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平而發(fā)揮作用，可能與精神疾病有關(guān)[34]。ryr2基因編碼主要位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的RYR-2蛋白，RYR-2作為同四聚體的一個(gè)亞基，構(gòu)成了調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的鈣通道，其在心臟和大腦中廣泛分布和高表達(dá)[35]。pln基因可逆地抑制心臟肌質(zhì)網(wǎng)中ATP2A2的活性，通過對(duì)ATP2A2的影響，調(diào)節(jié)心肌對(duì)生理刺激的收縮性，在肌肉放松期間調(diào)節(jié)鈣的再攝取，并在心肌中的鈣穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[36]。

除去以上幾個(gè)通路出現(xiàn)顯著富集外，筆者還關(guān)注到PPAR信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路。PPAR信號(hào)通路和動(dòng)物免疫防御和抗炎方面有關(guān)，PPARα調(diào)節(jié)因子影響脂蛋白和長(zhǎng)鏈脂肪酸代謝[37]。推測(cè)本研究中綠鰭馬面鲀?cè)诿芏让{迫下能量消耗變大，隨后糖酵解/糖異生增強(qiáng)，長(zhǎng)時(shí)間的密度脅迫導(dǎo)致該魚免疫抗病能力的降低。Toll樣受體可識(shí)別不同的病原體相關(guān)分子模式，并在先天性免疫應(yīng)答中扮演著不可或缺的角色。它們是抵御病原體入侵的第一道防線，在炎癥、免疫細(xì)胞調(diào)控、存活和增殖方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[38]。

致謝：綠鰭馬面鲀養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)過程中，得到本所吳艷慶、劉威等同志的幫助;綠鰭馬面鲀?nèi)蚪M序列由水科院黃海所陳四清研究員、邊力博士提供；謹(jǐn)致謝忱。