慢加急性肝衰竭動物模型研究現狀

劉 韋，白 浪

四川大學華西醫(yī)院感染性疾病中心，成都 610041

慢加急性肝衰竭（acute-on-chronic liver failure，ACLF）是指在慢性肝病基礎上，短期內出現肝功能急性失代償的臨床綜合征。ACLF 發(fā)病機制復雜，病情兇險，進展迅速，伴發(fā)多器官功能衰竭，短期病死率高，尚無具體有效的治療措施［1］。因此建立一個合適的、穩(wěn)定的并且高度模擬臨床的ACLF 動物模型對于闡明ACLF 發(fā)病機制具有重要的價值和意義，有助于臨床制訂更加有效的早期診斷和治療策略，從而提高臨床ACLF 的救治成功率。然而，由于ACLF 病因復雜、并發(fā)癥眾多，其動物模型研發(fā)一直存在較大挑戰(zhàn)。本文就目前常用的ACLF動物模型建立方法進行綜述。

1 ACLF概述

目前ACLF 的定義在國內外尚無統一的標準。我國將ACLF定義為：在慢性肝病基礎上，由各種誘因引起的以急性黃疸加深（總膽紅素≥10 倍正常值上限或每日上升≥17.1 μmol/L）、凝血功能障礙（凝血酶原活動度≤40%或國際標準化比值≥1.5）為肝衰竭表現的綜合征，可合并包括HE、腹水、電解質紊亂、感染、肝腎綜合征、肝肺綜合征等并發(fā)癥，以及肝外器官功能衰竭。根據不同慢性肝病基礎分為3型，A 型：在慢性非肝硬化肝病基礎上發(fā)生的慢加急性肝衰竭；B型：在代償期肝硬化基礎上發(fā)生的慢加急性肝衰竭，通常在4 周內發(fā)生；C 型：在失代償期肝硬化基礎上發(fā)生的慢加急性肝衰竭［2］。目前ACLF 的發(fā)病機制尚未完全闡明，可能與易患體質、誘發(fā)因素、炎癥反應、器官衰竭等有關［3］。常見的危險因素主要有細菌感染、酒精、靜脈曲張破裂出血、肝毒性藥物、肥胖和血脂異常等。ACLF 尚缺乏具體有效的治療方案，主要依賴于藥物治療、人工肝支持治療以及肝移植等［1，4］。

2 建立ACLF動物模型方法

目前建立ACLF 動物模型的思路均是通過各種方法先誘導實驗動物肝臟的慢性損傷，然后在慢性損傷的基礎上，進一步實施急性攻擊，從而導致肝臟發(fā)生急性肝衰竭。

目前在誘導肝臟慢性損傷階段采用的方法不同，主要有CCl4注射、硫代乙酰胺注射、血清白蛋白注射以及膽管結扎等方法。在急性攻擊階段，可采用不同急性攻擊方式，包括單用CCl4或D-氨基半乳糖胺（D-Gal Nactosamine，D-GaL N）LPS 聯合D-GaL N 等方法。Hassan 等［5］對目前所建立ACLF 動物模型的方法進行了較全面的總結，本文主要對CCl4法、硫代乙酰胺法、血清白蛋白法以及膽管結扎法4種常用的方法進行總結、對比及思考。

ACLF 動物模型首選嚙齒類動物，尤其是老鼠，由于體型小，壽命短，妊娠期短，容易在圈養(yǎng)環(huán)境中飼養(yǎng)和繁殖，而且與人類在基因上的顯著相似性，加上基因操縱的便利性，因此老鼠成為目前模擬ACLF 的最常用的實驗動物［6］。另外，建立大型動物模型可選擇豬、兔、非人靈長類動物等，其中非人靈長類動物如猴、猩猩、狒狒等與人類十分相似，但其價格和造模的方法更為嚴格，導致其很難大規(guī)模開展，因此少有研究者以此建立ACLF動物模型。

2.1 CCl4聯合LPS/D-Gal N法 CCl4是一種能引起肝細胞壞死的化合物，常作為誘發(fā)各種肝損傷的造模劑［7］。CCl4通過肝細胞的細胞色素P450的激活，生成自由基物質CCl3·和CCl3OO·，這些自由基會對膜結構上的多不飽和脂肪酸產生攻擊，促使細胞膜、線粒體膜等生物膜發(fā)生脂質過氧化，從而導致脂質過氧化物的產生，后者反過來還能對各種生物膜造成進一步的損傷，使其穩(wěn)定性和完整性降低、通透性增加，造成細胞內各種酶的溢出以及其他細胞損傷，最終導致肝細胞的凋亡與壞死［8］。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）又稱內毒素，是革蘭陰性菌細胞壁表面的一種成分，通過刺激免疫細胞釋放炎癥因子，導致肝細胞發(fā)生凋亡與壞死［9］。D-Gal N可通過抑制mRNA合成和部分抑制糖復合物的轉移后修飾導致肝細胞損傷，同時激活巨噬細胞和粒細胞，促進炎癥反應的發(fā)生，從而導致肝細胞凋亡。而毒性劑量的D-Gal N 主要是通過耗竭ATP、抑制大分子合成導致肝細胞壞死。在LPS 和D-Gal N 的協同作用下，實驗動物的肝細胞在短時間內大量死亡，肝臟生理功能嚴重受損［8］。

CCl4聯合LPS/D-GaL N誘導的ACLF動物模型，可用于模擬人類化學毒性物質所致的肝損傷，是目前比較常用的方法，該方法常采用腹腔內注射作為給藥方式，一方面操作簡便，便于掌握注射劑量，一方面藥物吸收較皮下注射快避免局部皮膚產生炎癥，而較血管注射慢避免導致急性藥物中毒。但研究者們在實驗動物選擇、誘導方式、誘導劑量等方面存在一定的差異。

目前CCl4聯合LPS/D-GaL N 建立的ACLF 動物模型可分為大鼠模型和小鼠模型。目前多數研究已經證實，在誘導肝臟慢性損傷階段，無論是選擇大鼠或者小鼠建模，12周左右的建模時間可以導致大鼠或者小鼠的肝臟發(fā)生明顯的慢性損傷。在12周的造模過程中，為使肝功能維持損傷狀態(tài)并防止其完全恢復，同時又不會因為給藥頻繁，劑量過大導致其死亡，最合適的給藥頻率建議為2次/周［10］。根據用于建模的鼠的種類不同，CCl4的注射劑量有所不同。張慧蕓等［11］將3～4周齡BALB/C的雄性小鼠腹腔注射20% CCl4油溶液5 mL/kg；高安等［12］將3～4周齡的SPF級雄性C57BL/6小鼠作為實驗動物，腹腔注射20% CCl4（橄欖油稀釋）5 mL/kg，2次/周，共12周。而誘導大鼠慢性肝損傷步驟相對繁瑣，研究［13-14］發(fā)現若選擇雄性SD大鼠（體質量160～170 g），雖然同樣是通過腹腔注射50% CCl4植物油溶液，連續(xù)12 周，每3 天1 次，但是和小鼠不同，劑量需要做相應的調整，其中第1個月劑量為1.5 mL/kg，第2、3 個月劑量為2.0 mL/kg。另外，為防止大鼠對CCl4產生耐藥性，需在4周后加大劑量，通常加至起始劑量的0.3 倍左右，而誘導小鼠肝硬化的給藥劑量相對穩(wěn)定。

在急性攻擊階段，可采用不同急性攻擊方式，分為單用CCl4或D-GaL N、LPS 聯合D-GaL N 三種方法，張海燕等［13］模擬了以上三種急性攻擊方法，以比較不同的方法是否能成功誘導慢性肝損傷基礎上急性肝衰竭的發(fā)生，在成功誘導大鼠慢性肝損傷后，將實驗大鼠分為A、B、C三組，實驗組A：2 g/kg D-Gal N；實驗組B：100 μg/kg LPS聯合0.5 g/kg D-Gal N；實驗組C：5 mL/kg 50% CCl4植物油溶液，給藥途徑均為腹腔注射。結果顯示三組實驗大鼠肝臟均出現肝細胞大塊或亞大塊壞死，符合急性肝衰竭表現，其中實驗組B肝細胞壞死程度大于A、C組，C組最輕。該研究表明三種方法均可成功誘導肝硬化基礎上的急性肝衰竭。其中單獨D-Gal N注射誘導生存時間最長提示該模型有較長的治療窗，更適合藥物篩選的實驗研究，而單獨CCl4注射誘導的急性肝衰竭的發(fā)生雖然也迅速，但其肝細胞壞死程度不如LPS 聯合D-Gal N 誘導的急性肝衰竭明顯。LPS 聯合D-Gal N 誘導的急性肝衰竭發(fā)生時間快、肝細胞壞死程度最為嚴重，因此相對于其他兩種處理方式，LPS聯合D-Gal N誘導在慢性肝損傷基礎上的急性肝衰竭發(fā)生，可能更適合ACLF病理機制的實驗研究。但是不同的研究也會采用不同的LPS 和D-Gal N劑量誘導急性肝衰竭發(fā)生。張慧蕓等［11］在12周末次給藥3 d后腹腔聯合注射D-Gal N 1 g/kg、LPS 10 μg/kg建立ACLF 小鼠模型。高安等［12］在12 周末次給藥10 d后，給予一次性腹腔聯合注射（LPS 0.5 mg/kg、D-Gal N 400 mg/kg），建立ACLF 小鼠模型?？梢姡谑褂肔PS 聯合D-GaL N急性攻擊方式時，研究者們在LPS和D-GaL N的劑量選擇上存在差異，考慮到LPS的毒性作用較強，因此急性攻擊時所需LPS的劑量通常都遠遠小于D-GaL N，但是聯合這兩種藥物進行急性攻擊時，其最優(yōu)劑量還值得進一步探索。

綜上，多種研究證明CCl4聯合LPS/D-Gal N 法建立ACLF 動物模型簡單易行、穩(wěn)定性好，適用于多種臨床研究。但有研究［15］表明CCl4模型在誘導因素停止后，肝纖維化程度、炎癥等逐漸減輕。特別是有學者［16］認為細菌感染在ACLF患者中極為常見，急性細菌感染是亞洲ACLF最常見的誘發(fā)事件之一，通常與全身炎癥、不良的臨床結局和高病死率密切相關［17］。而僅僅通過CCl4或者D-Gal N 等藥物注射并沒有很好的模擬感染在肝衰竭發(fā)生中的作用以及肝外器官的損害。因此CCl4聯合LPS/D-Gal N 法在模擬ACLF 的進展過程中仍然存在局限和不足。近年來有研究建立了更加完整模擬ACLF 病程及臨床特征的ACLF 小鼠模型，所采用的方法分為誘導慢性肝損傷、急性肝損傷、細菌感染三個階段，具體如下：首先將雄性C57BL/6J 小鼠腹腔內注射CCl4（0.2 mL/kg），每周2 次，持續(xù)8 周，以誘導小鼠慢性肝損傷；在急性攻擊階段，再次注射雙倍劑量的CCl4（0.4 mL/kg），然后腹腔注射克雷伯氏菌肺炎菌株或行盲腸結扎穿刺術［18］。該方法通過誘導細菌感染成功構建了一種嚴重肝損傷的ACLF小鼠模型，更佳地模擬了ACLF的臨床核心病程以及病程中易出現的肝外臟器損傷。該模型不僅具有合適的生存周期用于干預研究。同時，該模型造模方法能夠很好地標準化，取材容易，簡便快速，易于推廣，為ACLF 的相關機制研究和新治療靶點篩選提供了可靠的平臺。

2.2 硫代乙酰胺（thioacetamide，TAA）聯合LPS 法 TAA是一種肝毒性藥物，被人體攝取后，可經肝細胞內細胞色素P450 混合功能氧化酶代謝為TAA-硫氧化物，后者進一步代謝為中間代謝產物及其他極性分子，并與肝臟大分子物質結合，引起肝細胞功能的改變繼而壞死。一次性腹腔注射TAA 可導致急性肝炎，反復腹腔注射可導致肝細胞壞死、再生結節(jié)形成、毛細膽管增生、門靜脈高壓而導致肝硬化［19］。TAA 誘導慢性肝損傷的機制是影響蛋白合成及肝細胞中酶的代謝，在組織學和生化代謝的變化上與各種病因引起的人類肝硬化改變很相似，誘導所產生的肝纖維化更為穩(wěn)定和持久［20］。

de Mesquita 等［21］在TAA 注射前約1 h，將其溶解于0.9%生理鹽水中，給予雄性Wistar大鼠腹腔注射200 mg/kg TAA，每周2次，持續(xù)12周，用于建立慢性肝病動物模型。Tripathi 等［22］將雄性大鼠（150～200 g）腹腔注射生理鹽水溶解的TAA，劑量為250 mg/kg，2 次/周，持續(xù)10 周，建立無腹水發(fā)生的慢性肝病大鼠模型，再給予代償期的大鼠腹膜內或靜脈內注射LPS（1 mg/kg），以建立ACLF 大鼠模型。

TAA 誘導的TAA 動物模型也可用于模擬人類化學毒性物質所致的肝損傷，與CCl4模型相比，其誘導的肝損傷穩(wěn)定性更好更持久，不易逆轉。但由于TAA 的毒性較強，對人體危害性較大，不利于研究者操作，因此目前不常用于建立ACLF動物模型。

2.3 血清白蛋白法 Bhunchet 等［23］研究認為，當機體反復接受異體血清時，會導致體內大量生產的免疫復合物，從而促使血管內皮細胞、Kupffer 細胞產生大量細胞因子，作用于肝貯脂細胞，最終導致肝纖維化。目前主要通過牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、人血清白蛋白（human albumin serum，HSA）、豬血清（porcine serum，PS）誘導免疫損傷性肝損傷模型，在此基礎上再進一步聯合使用D-Gal N、LPS 以建立ACLF 動物模型。該方法通常選擇大鼠作為實驗動物，不同研究應用血清白蛋白法建立ACLF 模型的區(qū)別主要在于白蛋白的種類，給藥劑量，給藥途徑以及給藥時間不同。

目前常用的血清白蛋白包括BSA、HSA 和PS。我國劉旭華等［24］首先利用HSA 聯合D-GalN/LPS 建立大鼠ACLF 模型。BSA 和HSA 誘導肝臟慢性損傷通常分為兩個階段，一是免疫階段，血清白蛋白用生理鹽水稀釋與等體積的完全福氏佐劑乳化，每次皮下注射0.5 mL（內含白蛋白4 mg），共4次（第1、15、25、35天）。二是免疫攻擊階段，即靜脈注射血清白蛋白。劉子倩等［25］將SPF 級雄性大鼠皮下多點注射含4 mg的BSA乳化液0.5 mL，分別于第1、15、25、35 天時皮下多點注射致敏（共4 次）；再向大鼠尾靜脈注射BSA 溶液，每周2 次，共計6 周（12 次），BSA含量從每次2 mg開始，每次增加0.5 mg注射，逐次增加至每次4 mg 后維持此劑量。劉旭華等［23］給予雌性Wistar大鼠皮下注射4次0.5 mL的HSA乳化液后，向大鼠尾靜脈注射2.5 mg的HSA，逐次增加0.5 mg直至4.5 mg，并維持次劑量，每周2次，共6周。Wang等［26］給予Wistar雄性大鼠皮下多點注射4 次含有4 mg 的HSA 乳化液0.5mL。HSA 致敏后，向大鼠尾靜脈注射4 mg HSA，每周2 次，持續(xù)6 周，導致大鼠肝臟慢性損傷。BSA 或者HSA 法的主要區(qū)別在于致敏后靜脈注射白蛋白的劑量，HSA法既可采用2.5 mg起始，逐次增加0.5 mg，至4.5 mg后維持該劑量，也可直接采用維持劑量4 mg，而BSA法則多選擇從2 mg起始，逐次增加0.5 mg，至4 mg后維持該劑量。采用逐次遞增劑量的方式可能使大鼠的死亡率降低，提高建模成功率，但對于更好地模擬人類ACLF而言，兩者孰優(yōu)孰劣需要進一步探索。相對于BSA或者HSA誘導肝臟慢性損傷相對繁瑣的步驟，Li 等［27］給予雄性Wistar 大鼠腹腔注射0.5 mL 的PS，每周2 次，持續(xù)11 周，建立肝纖維化模型。PS誘導肝臟慢性損傷則更為簡便，利于操作，可重復，同時PS 法所選擇的給藥途徑為腹腔注射，相對于皮下注射、靜脈注射更為安全，成模率高。

在急性攻擊階段，BSA 法、HSA 法和PS 法均采用聯合使用D-Gal N、LPS 的方式，但是由于誘導慢性肝損傷的白蛋白種類不同，D-Gal N、LPS 的給藥劑量、給藥途徑存在差異。其中，BSA 法、HSA 法可采用相同的急性攻擊方式，在大鼠慢性肝損傷的基礎上，于第6 周末，聯合給予腹腔注射100 μg/kg 的LPS 和400 mg/kg 的D-Gal N以誘導急性肝衰竭［24-26］。而通過PS 誘導的大鼠，將于11 周后給予其靜脈注射劑量為50 μg/kg 的LPS，30 min后再腹腔注射劑量為600 mg/kg 的D-Gal N 以誘導急性肝衰竭［27］。

綜上，BSA 法、HSA 法和PS 法均可成功建立ACLF大鼠模型。目前利用免疫誘導法建立ACLF動物模型的常見造模方式，是HSA 法建立的ACLF 大鼠模型［28］，但其建立的模型死亡率相對較高，為23%［29］。與BSA 和HSA 法建立的ACLF 大鼠模型相比，PS 模型的死亡率更低，更容易操作，同時該模型與人類ACLF更加相似［27］。

2.4 膽管結扎術（bile duct ligation，BDL）法 BDL通過結扎膽管使膽汁反流造成肝細胞損傷來誘導肝纖維化。BDL誘導后的大鼠對內毒素敏感性增加，通常使用D-Gal N或LPS使大鼠發(fā)生急性肝損傷。

叢偉［30］通過此方法成功建立了ACLF 大鼠模型，首先將雄性SD 大鼠（體質量250～280 g），術前禁食12 h，結扎膽總管，4 周后可建立膽汁淤積性肝硬化模型。然后取膽管結扎4 周后存活的大鼠（已建立膽汁淤積性肝硬化模型），禁食12 h，按1.4 g/kg 給藥劑量配置D-Gal N（配置濃度0.2～0.4 g/mL），腹腔注射24 h 后可誘導肝硬化基礎上的急性肝損傷。

Tripathi 等［22］使用BDL 建立ACLF 動物模型，首先結扎雄性大鼠（200～225 g）膽總管，誘導繼發(fā)性膽汁性肝硬化（共28 天）。在血流動力學研究前4 h，給予肝硬化失代償期的大鼠腹膜內或靜脈內注射1 mg/kg的LPS，以建立ACLF大鼠模型。

BDL 模型可用于模擬人類膽管阻塞而造成的肝損傷，但BDL模型手術復雜，模型較不穩(wěn)定。

3 建立ACLF動物模型的挑戰(zhàn)與展望

綜上所述，CCl4聯合LPS/D-Gal N 法、TAA 聯合LPS法、血清白蛋白法、膽管結扎術法是目前建立ACLF 動物模型常用的方法，CCl4模型、TAA模型均為化學毒物的損傷，操作簡單便利，但對于劑量的選擇有一定要求，劑量過大易導致動物死亡，過小則達不到診斷要求。血清蛋白法主要模擬免疫性的肝損傷，模型穩(wěn)定，可重復。BDL法模擬人類膽管阻塞而造成的肝損傷操作復雜，對動物損傷大，較不穩(wěn)定?？梢?，建立ACLF 動物模型有多種方法，研究者可以根據具體研究目的選擇一種合適的方法。但ACLF 的病因、病理機制復雜多樣，同時實驗動物與人類之間存在異質性，而臨床情況更加復雜，將同時或依次出現多種誘發(fā)因素和并發(fā)癥，導致多種疾病和器官衰竭，因此無法準確地模擬人類ACLF發(fā)生發(fā)展過程［31］。

ACLF發(fā)生于慢性肝病的基礎上，通常包括病毒性肝病、酒精性肝病、藥物性肝病、自身免疫性肝病等，其病因多種多樣，不同病因所致的肝損傷機制各有不同。HBV的再激活是亞洲地區(qū)ACLF 的主要原因，其患病率高，HBV 相關的急性慢性肝衰竭占ACLF 的70%以上［32-34］。但是目前所建立的ACLF 動物模型，包括可模擬化學毒物性損傷、免疫性肝損傷、膽汁淤積性肝損傷，均無法模擬病毒性肝損傷，因此建立HBV相關的急性慢性肝衰竭動物模型是目前的一大難題和挑戰(zhàn)。另外，為建立合適的ACLF動物模型，實驗動物的選擇也很重要，根據不同的研究目的，選擇最適合的動物模型，考慮到嚙齒類動物的優(yōu)勢，目前通常選擇大鼠或者小鼠作為實驗動物。

理想的ACLF 動物模型應盡量模擬人類的肝損傷發(fā)病機制，雖然此過程可通過使用不同藥物、毒物或其他有創(chuàng)操作而實現，也可調整給藥劑量或其他方式盡可能模擬人類ACLF的死亡率、生存率，但目前由于動物本身與人類之間存在異質性以及外界因素的不可控性，暫時無法完整復制人類ACLF。因此選擇更符合人類發(fā)病機制的動物、更佳的毒物藥物、合適的藥物劑量等，需要研究者們進一步探索。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：劉韋起草論文；白浪負責擬定寫作思路，論文審閱修改。