不同碳源對(duì)E.adhaerens 產(chǎn)維生素B12 發(fā)酵代謝動(dòng)力學(xué)分析

陳欣怡， 栗 波， 趙杜娟， 汪博倫， 郭華楠， 付 麗， 劉愛軍， 楊 輝， 王澤建

（1.廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 南寧 530004；2.華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海200237；3.浙江工業(yè)大學(xué), 杭州 310014；4.河北欣港藥業(yè)有限公司, 石家莊 051530）

維生素B12（VB12）發(fā)現(xiàn)于20 世紀(jì)20 年代，又被稱為鈷胺素。VB12的化學(xué)結(jié)構(gòu)式極其復(fù)雜，化學(xué)合成過程繁瑣并且成本十分昂貴，目前大多數(shù)VB12由生物合成而來，主要包括好氧途徑和厭氧途徑，黏著劍菌(E.adhaerens)是利用好氧途徑合成VB12的主要菌種[1-4]。 目前對(duì)于E.adhaerens的研究主要集中于利用工藝優(yōu)化和基因工程提高VB12的產(chǎn)量，如從碳源、溶氧、攪拌、氮源等方面來提高VB12產(chǎn)量[1,5-7]，其中碳源是黏著劍菌生長和生產(chǎn)VB12最重要的原料，不同碳源在生產(chǎn)過程中獲得的底物轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)發(fā)酵單位差異較大，但有關(guān)VB12在不同碳源下的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究鮮有報(bào)道，利用代謝動(dòng)力學(xué)分析生產(chǎn)菌的代謝特征是闡明代謝合成機(jī)制和過程控制的關(guān)鍵。

微生物生長和代謝是極其復(fù)雜的生物反應(yīng)過程，包括胞內(nèi)外物質(zhì)傳遞與交換、細(xì)胞內(nèi)生化反應(yīng)等，通過建立發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型，有利于深入了解微生物生理代謝特性，還可以根據(jù)模型指導(dǎo)發(fā)酵工藝優(yōu)化和發(fā)酵罐設(shè)計(jì)。常用的動(dòng)力學(xué)模型主要分為結(jié)構(gòu)模型、“黑箱”模型和非結(jié)構(gòu)模型[8-9]3 類：結(jié)構(gòu)模型反映了細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)過程的部分本質(zhì)和機(jī)理，但涉及過多模型方程和參數(shù)，應(yīng)用難度較大；“黑箱”模型是建立在狀態(tài)變量和操作變量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上的模型，不具有明確的物理意義；非結(jié)構(gòu)模型把生物反應(yīng)過程理論定量與經(jīng)驗(yàn)公式相結(jié)合，用若干方程來表示生物反應(yīng)過程的特征，建模比較簡單且模型參數(shù)有明確的物理意義。常用的非結(jié)構(gòu)發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型包括菌體生長動(dòng)力學(xué)模型、產(chǎn)物形成動(dòng)力學(xué)模型和底物消耗動(dòng)力學(xué)模型。生長動(dòng)力學(xué)模型通常用Monod和Logistic 這兩個(gè)方程表示，產(chǎn)物合成動(dòng)力學(xué)通常用Luedeking-Piret 方程表示[6,9-10]。Don 等[11]探討了透明質(zhì)酸（HA）發(fā)酵過程的動(dòng)力學(xué)，發(fā)現(xiàn)HA 的合成與菌體的生長相偶聯(lián)并受到乳酸的抑制作用。Wang 等[12]研究了恒化培養(yǎng)條件下糞產(chǎn)堿桿菌凝膠多糖的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)，發(fā)現(xiàn)最佳限制性銨離子質(zhì)量濃度為5.75 mg/L時(shí)，能夠顯著提升凝膠多糖的生產(chǎn)效率。徐曉琴等[13]利用Logistic 和Luedeking-Piret 方程擬合少動(dòng)鞘脂單胞菌發(fā)酵產(chǎn)結(jié)冷膠的發(fā)酵過程，實(shí)現(xiàn)了對(duì)不同初始糖濃度下菌體生長、底物消耗、產(chǎn)物形成等生理參數(shù)的預(yù)測(cè)。

本文考察了不同碳源（麥芽糖、蔗糖、葡萄糖和果糖）對(duì)E.adhaerens發(fā)酵過程生理參數(shù)和動(dòng)力學(xué)的影響；分別利用Logistic 和Luedeking-Piret 方程擬合了細(xì)胞生長和產(chǎn)物合成動(dòng)力學(xué)模型，通過生理參數(shù)分析、動(dòng)力學(xué)分析和代謝機(jī)理分析，詳細(xì)闡述了E.adhaerens利用不同底物碳源在生長和代謝上的差異。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株E.adhaerens：由國家生化工程技術(shù)研究中心（上海）提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

（1）斜面培養(yǎng)基（g/L）：蔗糖40；玉米漿20；甜菜堿8；硫酸銨0.8；磷酸氫二銨2.2；硫酸錳0.8；氯化鈷0.022；無水硫酸鎂0.3；5,6-二甲基苯并咪唑（DMBⅠ）0.006；硫酸鋅0.022；瓊脂20.0；pH 7.2～7.4。

（2）種子培養(yǎng)基（g/L）：蔗糖40；玉米漿20；甜菜堿5；硫酸銨1；磷酸氫二銨2；硫酸錳0.8；氯化鈷0.02；氧化鎂0.3；DMBⅠ 0.01；硫酸鋅0.01；碳酸鈣1.5；pH 7.2～7.4。

（3）發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：碳源（每組分別使用80 g蔗糖、84.2 g 果糖、92.5 g 一水葡萄糖、84.2 g 麥芽糖作為唯一碳源，碳源含量根據(jù)相同碳原子物質(zhì)的量進(jìn)行換算）；玉米漿60；甜菜堿28；硫酸銨1；磷酸二氫鉀0.75；氯化鈷0.075；氧化鎂0.5；DMBⅠ 0.05；硫酸鋅0.08；碳酸鈣1；尿素1；pH 7.2～7.4。

（4）補(bǔ)料培養(yǎng)基1（g/L）：碳源（每組分別使用476 g蔗糖、500 g 果糖、550 g 一水葡萄糖、500 g 麥芽糖作為唯一碳源，碳源含量根據(jù)相同碳原子物質(zhì)的量進(jìn)行換算）；氯化鈷 0.45；DMBⅠ 0.45。

（5）補(bǔ)料培養(yǎng)基2（g/L）：50%甜菜堿 500 mL；氯化鈷1.6；DMBⅠ 1.6。

1.2 測(cè)試與表征

1.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器 SBA-40E 型生物傳感分析儀（山東省科學(xué)院生物研究所），Agilent 1100 series 型高效液相色譜（美國 Agilent 公司），SHZ-D（ⅠⅠⅠ）型循環(huán)式真空泵（上海予華儀器設(shè)備有限公司），ZHWY-3212 型旋轉(zhuǎn)式搖床（上海智城分析儀器制造有限公司），AL204 型分析天平（METTLER TOLEDO），pH 計(jì)（METTLER TOLEDO），YXQ-LS-S 型壓力蒸汽滅菌器（博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠（上海）），GZX-9420 MBE 型鼓風(fēng)烘箱（上海華連醫(yī)療器械有限公司） ， 酶標(biāo)儀（ Thermo Scientific） ， 電導(dǎo)率儀（METTLER TOLEDO）。

1.2.2 菌濃測(cè)定 使用蒸餾水把菌液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，以去離子水作為對(duì)照，于波長700 nm 下測(cè)定吸光度值（OD700）。將1 mL 菌液于12 000 r/min 下離心，去掉上清后置于60 ℃烘箱中烘干，測(cè)定細(xì)胞干重（DCW）。將細(xì)胞干重與菌液吸光度值作關(guān)系曲線，得DCW=0.8*OD700。

1.2.3 還原糖和總糖測(cè)定

（1）還原糖測(cè)定：取10 mL 發(fā)酵液，在4 000 r/min條件下離心5 min，吸取1 mL 發(fā)酵液上清稀釋合適倍數(shù)，用生物傳感分析儀檢測(cè)。

（2）總糖測(cè)定：發(fā)酵液總糖及還原糖的濃度采用3,5-二硝基水楊酸（3,5-Dinitrosalicylic acid, DNS）法測(cè)定[2]。

1.2.4 VB12含量測(cè)定 取5 mL 發(fā)酵液于50 mL 比色管中，加入2 mL 冰乙酸和2 mL 80 g/L NaNO2溶液，并加消沫劑1～2 滴，于100 ℃水浴30 min，冷卻后用水稀釋50 mL，充分搖勻后過濾。取濾液5 mL 作為待測(cè)樣品溶液。

色譜柱：C18（5 μL，4.6 mm×250 mm）；柱溫：40 ℃；流動(dòng)相為甲醇水溶液（甲醇和水體積比為3∶7），每升甲醇水溶液中添加2 mL 乙酸，以氨水調(diào)pH 為7.0，真空抽濾；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長：550 nm。

樣品溶液與VB12工作標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)樣，進(jìn)樣量均為20 μL。設(shè)VB12工作標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為ρ（μg/mL），液相出峰面積為SA，樣品的峰面積為SB，樣品稀釋倍數(shù)為n，則樣品中VB12質(zhì)量濃度計(jì)算公式[14]如下：

1.2.5 發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型

（1）細(xì)胞生長動(dòng)力學(xué)模型通常用Logistic 方程[5]表示，其表現(xiàn)形式為：

式中：Xm為最大菌濃（g/L）；X為菌濃（g/L）；um為最大比生長速率。

積分后得到：

式中：X0為初始菌濃（g/L）；t為時(shí)間（h）。

（2）產(chǎn)物合成的動(dòng)力學(xué)模型通常用Luedeking-Piret 方程[8]：

積分后得到單位時(shí)間產(chǎn)量P(t)：

式中：P0為初始VB12產(chǎn)量；α代表與菌體生長相關(guān)的產(chǎn)物形成參數(shù)；β代表與菌體生長非相關(guān)的產(chǎn)物形成參數(shù)。其中，當(dāng)α≠0，β=0 時(shí)，產(chǎn)物合成為生長偶聯(lián)型；當(dāng)α=0，β≠0 時(shí)，產(chǎn)物合成為非生長偶聯(lián)型；當(dāng)α≠0，β≠0 時(shí)，產(chǎn)物合成為部分生長偶聯(lián)型。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

種子培養(yǎng)：將斜面用5 mL 無菌水洗凈，接種到裝液量50 mL 的一級(jí)種子搖瓶中，在30 ℃、260 r/min培養(yǎng)24 h，取20 mL 一級(jí)種子液接種至裝液量200 mL二級(jí)種子搖瓶中，在30 ℃、260 r/min 培養(yǎng)18 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：接種二級(jí)種子至裝液量為50 mL 的500 mL 發(fā)酵搖瓶中（接種量10 %），發(fā)酵培養(yǎng)196 h（轉(zhuǎn)速260 r/min、溫度32 ℃）。期間每24 h 補(bǔ)料一次，發(fā)酵期間維持碳源質(zhì)量濃度為（30±10）g/L，甜菜堿質(zhì)量濃度為（10±3）g/L。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同碳源條件下E.adhaerens 生理代謝特性分析

本研究旨在探究不同種類碳源（葡萄糖、蔗糖、果糖和麥芽糖）對(duì)E.adhaerens合成VB12的影響，故以碳原子物質(zhì)的量為依據(jù)換算其不同碳源在培養(yǎng)基中的添加濃度。然而由于不同碳源底物進(jìn)入糖酵解的途徑不同，所需的酶和代謝途徑也不同，影響E.adhaerens對(duì)碳源的利用效率和代謝參數(shù)，進(jìn)而影響VB12的產(chǎn)量[4,15-16]。

不同碳源對(duì)菌體生理代謝影響結(jié)果如圖1 所示，由圖可見，在生長和VB12的合成上顯現(xiàn)出了明顯差異。從菌濃的變化（圖1（ a））上看出，利用雙糖作為碳源底物，菌濃OD 值明顯高于葡萄糖和果糖的單糖實(shí)驗(yàn)組，麥芽糖在發(fā)酵100 h 以內(nèi)更有利于菌體比生長速率的提升，蔗糖對(duì)于維持中后期菌體的比生長速率有較好的促進(jìn)作用。與蔗糖和麥芽糖相比，葡萄糖對(duì)菌體的比生長速率呈現(xiàn)一定的抑制。果糖為碳源實(shí)驗(yàn)組的菌體比生長速率為0.049 h?1，顯著低于其他碳源實(shí)驗(yàn)組，并且菌體進(jìn)入快速生長期，達(dá)到最大比生長速率的時(shí)間明顯遲于其他碳源。果糖為碳源時(shí)發(fā)酵結(jié)束的菌體濃度OD 值只有55，比蔗糖實(shí)驗(yàn)組OD 值（83）低了33.7%。

圖1 不同碳源條件下E.adhaerens 過程的代謝特性Fig.1 Metabolism properties of E.adhaerens under different carbon sources

菌體生長過程pH 的變化（圖1（b））顯示，以葡萄糖和果糖作為碳源時(shí)，前期pH 的增長速率明顯低于蔗糖和麥芽糖實(shí)驗(yàn)組，與菌體前期比生長速率的變化相一致。在菌體快速增長期，高濃度的葡萄糖條件下，由于產(chǎn)酸速率快，pH 下降速度明顯高于蔗糖和麥芽糖實(shí)驗(yàn)組，100 h 后pH 值降到了6.5 以下。利用果糖作為碳源底物的pH 值最高，表明E.adhaerens利用果糖的速率較慢。不同碳源底物對(duì)VB12的生物合成影響顯著（圖1（d）），利用蔗糖作為碳源底物時(shí)在發(fā)酵中后期維持了較高的合成速率，最高發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到115 mg/L，比葡萄糖、麥芽糖、果糖組分別高出53%、40%、103%。果糖為碳源條件下，產(chǎn)物的合成速率明顯低于其他實(shí)驗(yàn)組。

E.adhaerens對(duì)不同碳源的消耗情況如圖2 所示。從糖耗速率上，也驗(yàn)證了E.adhaerens對(duì)于果糖的吸收利用最差，發(fā)酵過程中果糖的最高耗糖速率僅為0.63 g/(L·h)，而葡萄糖、麥芽糖和蔗糖的最高耗糖速率分別為1.14、1.09、0.93 g/(L·h)（圖2（a））。葡萄糖作為碳源容易被菌體利用，其次是麥芽糖，麥芽糖需要先被水解為兩分子葡萄糖后再被利用，糖耗速率略微低于可以被直接利用的葡萄糖，而水解為一分子葡萄糖和一分子果糖的蔗糖，糖耗速率較慢，原因是因?yàn)镋.adhaerens對(duì)果糖的利用速率較慢。

圖2 E.adhaerens 對(duì)不同碳源的消耗情況Fig.2 Consumption of different carbon sources by E.adhaerens

在糖耗方面，雙糖組的耗糖速率在菌體指數(shù)生長期明顯高于單糖組（圖2（b）和圖2（c））。前期單糖組耗糖速率較低的原因是因?yàn)楦哔|(zhì)量濃度單糖使E.adhaeren代謝受到一定的抑制[11]。雙糖由于邊分解邊利用，發(fā)酵液中還原糖質(zhì)量濃度（0～3 g/L）較低，沒有對(duì)細(xì)胞形成脅迫和抑制，更有利于菌體生長，糖耗速率高于單糖組。而在整個(gè)發(fā)酵過程中，葡萄糖的糖耗速率最高，為1.14 g/L，比蔗糖、麥芽糖、果糖組分別高出22%、5%和73%，說明當(dāng)葡萄糖逐漸被利用，發(fā)酵液中糖質(zhì)量濃度逐漸降低到不再對(duì)菌體生長有抑制時(shí)，葡萄糖是E.adhaerens最易被利用的碳源。在發(fā)酵后期，葡萄糖組的殘?zhí)撬郊s維持在40 g/L，整個(gè)發(fā)酵過程其耗糖速率最高，其次是麥芽糖，也證明了葡萄糖前期耗糖速率低是因?yàn)槠咸烟且种频脑騕10]。

2.2 不同碳源條件下E.adhaerens 發(fā)酵動(dòng)力學(xué)分析

分別利用Logistic 方程擬合菌體生長動(dòng)力學(xué)模型，Luedeking-Piret 擬合VB12合成動(dòng)力學(xué)模型。擬合結(jié)果（圖3）表明，實(shí)驗(yàn)值和估計(jì)值有良好的一致性，表明模型能很好地預(yù)測(cè)菌體的生理代謝特征。

圖3 不同碳源條件下E.adhaerens 發(fā)酵合成VB12 過程代謝動(dòng)力學(xué)分析Fig.3 Metabolic kinetics analysis of VB12 synthesis by E.adhaerens fermentation under different carbon sources

表1 所示為不同碳源情況下E.adhaerens生長和產(chǎn)物合成過程的生理代謝參數(shù)。模型擬合得到的4 種碳源發(fā)酵過程中菌體最大比生長速率（μm）差異顯著，蔗糖為碳源底物情況下最大比生長速率為0.054 h?1，高于麥芽糖和葡萄糖情況下的0.051 h?1和0.052 h?1。果糖作碳源時(shí)，菌體的比生長速率最低為0.049 h?1，比蔗糖碳源組低了近10%；同時(shí)蔗糖作為碳源的最大產(chǎn)率最高達(dá)到了（0.701±0.02）mg/(L·h)，分別比葡萄糖、麥芽糖和果糖高出約55%、40%、105%，表明蔗糖是用于生長和合成的最優(yōu)碳源。

表1 不同碳源對(duì) E.adhaerens 發(fā)酵過程生理代謝參數(shù)的影響Table 1 Effect of different carbon sources on physiological metabolic parameters of E.adhaerens

由表1 可擬合得到與細(xì)胞生長相關(guān)的產(chǎn)物生成系數(shù)α以及與細(xì)胞濃度相關(guān)的產(chǎn)物生成系數(shù)β，兩者均為恒定值，且都不為零，表明VB12的合成為部分生長相關(guān)型[7]。其中麥芽糖具有最高的α值，最有利于E.adhaerens合成VB12；蔗糖具有最高的β值，最有利于維持E.adhaerens合成VB12的速率。以葡萄糖為碳源的情況下，較高的質(zhì)量濃度可能會(huì)對(duì)VB12的生長和合成起到一定的抑制作用[17]，其α、β值分別低于以麥芽糖和蔗糖為碳源的情況；果糖不利于菌體合成VB12，α值最低，但有利于維持其合成速率，β值僅低于蔗糖組。

根據(jù)生理參數(shù)中比生長速率和VB12的數(shù)據(jù)（圖1（d））看出，在0～48 h 菌體主要處于生長階段，48～192 h主要為產(chǎn)物合成階段，因此將VB12的合成得率計(jì)算分為兩階段討論[18]，如表2 所示。果糖之所以在生長和產(chǎn)物合成上比其他碳源差，是因?yàn)樵谏L階段菌體對(duì)底物得率（YX/S）最低，為0.46，在產(chǎn)物合成期間產(chǎn)物對(duì)底物的得率（YP/S）最低，為0.73，而蔗糖之所以在生長和產(chǎn)物合成上更具優(yōu)勢(shì)，是因?yàn)樯L階段它具有較高的YX/S（0.73）以及產(chǎn)物合成階段具有最高的YP/S（1.54）和最低的對(duì)產(chǎn)物的細(xì)胞得率系數(shù)（YX/P）。

表2 不同碳源對(duì)VB12 得率的影響Table 2 Effect of different carbon sources on yield of E.adhaerens

綜合生長和產(chǎn)物合成動(dòng)力學(xué)模型及參數(shù)，蔗糖在μm、α、β、YX/S、YP/S、YX/P等參數(shù)上都具有明顯優(yōu)勢(shì)，其是E.adhaerens發(fā)酵生產(chǎn)VB12的最優(yōu)碳源。

2.3 不同碳源代謝途徑分析

通過過程生理參數(shù)分析和動(dòng)力學(xué)擬合，本文發(fā)現(xiàn)在不同碳源情況下，E.adhaerens的生理代謝存在顯著的差異。為了更全面闡明不同碳源對(duì)E.adhaerens的生理代謝的影響，我們進(jìn)一步從VB12合成途徑上分析了蔗糖、麥芽糖、葡萄糖和果糖生理參數(shù)和動(dòng)力學(xué)差異的代謝機(jī)理。

碳源主要通過3 種代謝途徑被微生物利用，糖酵解途徑（EMP 途徑）、磷酸戊糖途徑（HMP 途徑）、2-酮-3-脫氧-6-磷酸葡糖酸裂解（ED 途徑）等（見圖4）。但不同碳源進(jìn)入代謝途徑的方式不同，葡萄糖和果糖可被微生物直接利用進(jìn)入代謝途徑，葡糖糖和果糖在己糖激酶的催化下轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸進(jìn)入代謝途徑，蔗糖需要先在蔗糖酶的作用下水解為一分子果糖和一分子葡萄糖后，再在酶的催化下進(jìn)入代謝途徑，麥芽糖需要先被麥芽糖酶水解為兩分子葡萄糖，然后進(jìn)入代謝途徑。并且不同碳源進(jìn)入代謝途徑后被代謝的路徑不同，從而為微生物的生長代謝和產(chǎn)物合成提供能量和所需前體物質(zhì)。

圖4 氧限制前后E.adhaerens 代謝途徑Fig.4 Metabolic pathways of E.adhaerens before and after oxygen limitation

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，利用蔗糖和麥芽糖作為碳源的雙糖組更有利于菌體生長和VB12合成，麥芽糖對(duì)發(fā)酵前期（＜100 h）VB12的合成效果顯著，蔗糖更有利于促進(jìn)中后期VB12的合成速率。果糖作為唯一碳源的條件下，菌體生長和VB12合成明顯受到限制；葡萄糖作為碳源的情況下，發(fā)酵前期（＜30 h）的比生長速率為0.051 h?1，比蔗糖實(shí)驗(yàn)組的比生長速率（0.054 h?1）低了近8%。

從不同碳源進(jìn)入代謝途徑的方式來看，葡萄糖組和果糖組的差異可能由于菌體利用葡萄糖的酶活力較高，而利用果糖的酶活力較低，E.adhaerens更易于利用葡萄糖作為碳源進(jìn)行生長代謝和產(chǎn)物合成。其次，從葡萄糖組和蔗糖組的差異來看，由于葡萄糖可直接被菌體利用，初始添加量為80 g/L，質(zhì)量濃度較高，在高質(zhì)量濃度葡萄糖和高滲透壓條件下可能對(duì)菌體的生長代謝和產(chǎn)物合成產(chǎn)生一定的抑制作用；而蔗糖雖然初始添加量也較高，但其是雙糖不能夠直接被利用，需要先被水解為一分子葡萄糖和果糖，然后再被菌體利用[3,7,19]，分解和利用的動(dòng)態(tài)平衡使發(fā)酵液中葡萄糖質(zhì)量濃度極低，不會(huì)對(duì)菌體生長代謝和產(chǎn)物合成產(chǎn)生抑制作用。最后，從蔗糖和麥芽糖組別的差異來看，蔗糖相較于麥芽糖更有利于菌體生長代謝和產(chǎn)物合成，可能是由于麥芽糖水解為兩分子葡萄糖，葡萄糖質(zhì)量濃度相對(duì)較高，起到一定的抑制作用，且蔗糖組水解產(chǎn)生的果糖可能起到了一定促進(jìn)作用。

3 結(jié)束語

本文研究了E.adhaerens利用不同碳源為底物生產(chǎn)VB12的發(fā)酵過程生理代謝特性、發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型的差異，并根據(jù)其代謝分析了差異的可能原因。研究發(fā)現(xiàn)，根據(jù)發(fā)酵過程生理參數(shù)分析，E.adhaerens發(fā)酵最優(yōu)的碳源是蔗糖，其次是麥芽糖、葡萄糖，果糖的利用效果最差，通過對(duì)其生長和VB12合成進(jìn)行動(dòng)力學(xué)擬合，發(fā)現(xiàn)其在生長和產(chǎn)物合成動(dòng)力學(xué)模型上也存在顯著差異，最后通過代謝途徑分析了引起差異的可能性機(jī)理[20]。

E.adhaerens在不同碳源為底物下，在菌體生長、VB12合成、比生長速率、糖耗速率、pH 變化等參數(shù)上存在顯著差異。其中蔗糖最有利于菌體生長和VB12合成，具有最高菌濃（OD700=83），最高產(chǎn)量115 mg/L；而果糖最不利于菌體生長和VB12合成，菌濃為OD700=55，產(chǎn)量為56 mg/L。利用Logistic 方程和Luedeking-Piret 方程對(duì)不同碳源條件下VB12的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模擬分析結(jié)果證實(shí)，蔗糖作為碳源時(shí)μm為0.054 h?1。不同碳源下發(fā)酵過程生理代謝參數(shù)分析表明，蔗糖為E.adhaerens發(fā)酵生產(chǎn)VB12的最佳碳源。

E.adhaerens利用不同碳源（葡萄糖、果糖、蔗糖和麥芽糖）在生理代謝參數(shù)和動(dòng)力學(xué)上出現(xiàn)顯著差異，主要由3 個(gè)原因引起：首先，代謝不同碳源進(jìn)入代謝途徑的酶活力或酶量不同；其次，不同碳源進(jìn)入代謝途徑后所走的路徑不同；最后，雙糖底物蔗糖和麥芽糖為碳源時(shí)，分解生成葡萄糖且同時(shí)利用葡萄糖，緩解了葡萄糖質(zhì)量濃度過高而引起的抑制效應(yīng)。