新型PCV2 衣殼融合蛋白在HEK293F 細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)研究

羅清平， 彭 妍， ALⅠ Mohsin， 莊英萍,， 郭美錦,

（1.華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 200237；2.上海國佳生化工程技術(shù)研究中心有限公司, 上海 200237）

豬圓環(huán)病毒2 型（Porcine Circovirus type 2，PCV2）是引發(fā)豬圓環(huán)病毒相關(guān)性疾病(Porcine Circovirus Associated Disease, PCVAD)的傳染病原[1]，已給全球豬養(yǎng)殖行業(yè)帶來了巨大損失。目前已發(fā)現(xiàn)8 種亞型如 PCV2a、 PCV2b、 PCV2c、 PCV2d、 PCV2e、PCV2f、PCV2g 和PCV2h[2-3]，其中PCV2b 流行最為廣泛[4]。PCV2 病毒衣殼蛋白是構(gòu)成病毒外殼結(jié)構(gòu)的唯一結(jié)構(gòu)蛋白，含有中和表位誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)，被廣泛應(yīng)用于亞單位疫苗開發(fā)生產(chǎn)。目前PCV2 亞單位疫苗技術(shù)路線主要采用原核生物和桿狀病毒/昆蟲表達(dá)系統(tǒng)?，F(xiàn)國內(nèi)外開發(fā)上市的多種PCV2 疫苗能夠減少疾病的發(fā)生，也造成新病毒株的產(chǎn)生，引起免疫逃逸問題。因此，開發(fā)新型PCV2疫苗及探索新的表達(dá)方式具有非常重要的意義。

PCV2 衣殼蛋白在多個(gè)宿主表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行了表達(dá)研究。采用大腸桿菌[5]和畢氏酵母[6-7]表達(dá)全長PCV2 衣殼蛋白時(shí)存在難表達(dá)問題，在切除蛋白N 端前導(dǎo)序列能夠改善蛋白的表達(dá)水平[8]。另外，桿狀病毒/昆蟲系統(tǒng)具有高效表達(dá)外源蛋白的表達(dá)系統(tǒng)[9-10]，采用pFastBac 載體和Sf9 細(xì)胞， 獲得PCV2 衣殼蛋白150 μg/mL 的表達(dá)水平[11]。然而，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)PCV2 衣殼蛋白方面研究相對(duì)缺乏。瞬時(shí)基因表達(dá)（Transient Gene Expression, TGE）技術(shù)是將外源表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染哺乳細(xì)胞實(shí)現(xiàn)外源蛋白快速表達(dá)的方式。由于能夠快速獲取目標(biāo)蛋白并進(jìn)行后續(xù)蛋白研究，該技術(shù)得到廣泛應(yīng)用[12-15]。盡管存在對(duì)一些外源蛋白瞬時(shí)表達(dá)水平低的問題[16-19]，但有研究報(bào)道，采用降低培養(yǎng)溫度、提高培養(yǎng)系統(tǒng)滲透壓、補(bǔ)加蛋白胨添加物，以及細(xì)胞本身工程化改造等方式能夠提高外源蛋白瞬時(shí)表達(dá)水平[20-24]。

本文對(duì)不同宿主細(xì)胞、轉(zhuǎn)染試劑、轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒比例及孵育時(shí)間等多個(gè)因素進(jìn)行考察，研究在哺乳動(dòng)物細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)PCV2 病毒衣殼蛋白對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的影響。采用電泳阻滯實(shí)驗(yàn)及負(fù)染色透射電子顯微鏡方法揭示了混合時(shí)間對(duì)PEⅠ與DNA形成復(fù)合物的電荷與大小存在影響。另外，為了提高PCV2 衣殼蛋白的表達(dá)水平以及增強(qiáng)蛋白免疫原性，本文對(duì)PCV2 衣殼蛋白進(jìn)行了工程化改造，設(shè)計(jì)如下：以免疫逃逸型豬圓環(huán)病毒2b 型NDSU41513毒株衣殼蛋白，去除N 端富含堿性氨基酸的41 位氨基酸，并通過鏈接子在C 端與豬源ⅠgG Fc 片段進(jìn)行連接，設(shè)計(jì)出新型PCV2 Capsid (△1-41aa)-Fc(pig)protein（PCFP）分子。在3 L 反應(yīng)器中對(duì)HEK293F細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，成功實(shí)現(xiàn)了PCFP 融合蛋白在哺乳細(xì)胞HEK293F 中的表達(dá)，為病毒類蛋白在哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)和制備提供很好的探索。

1 材料與方法

1.1 目的基因、細(xì)胞株、培養(yǎng)基及試劑

實(shí)驗(yàn)采用豬圓環(huán)病毒2 型 NDSU41513 毒株編碼的衣殼蛋白基因（GenBank accession number KR 816332.1）。哺乳細(xì)胞細(xì)胞株HEK293F、Escherichia coliDH5α、質(zhì)粒pEGFP-N1 和pcDNA3.1（+）來自實(shí)驗(yàn)室保藏。細(xì)胞株CHO-K1 由中科院友情提供。限制性內(nèi)切酶NheⅠ和Hind ⅠⅠⅠ采購自德泰生物科技（南京）有限公司。pfu 酶，T4 DNA 連接酶等購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。25 kDa 和40 kDa線性聚乙烯亞胺轉(zhuǎn)染試劑 (PEⅠ) 采購自懋康生物技術(shù)有限公司。搖瓶中所用培養(yǎng)基為Union 293 培養(yǎng)基，采購自永聯(lián)生物科技（上海）有限公司。生物反應(yīng)器培養(yǎng)中所用培養(yǎng)基為OPM-293 CD05 培養(yǎng)基，采購自上海奧浦邁生物科技有限公司。純化及電泳分析所用試劑采購自碧云天生物科技有限公司。兔抗衣殼蛋白多克隆抗體一抗采購自美國Abcam 公司。HRP 標(biāo)記的山羊抗兔抗體二抗采購自艾美捷科技有限公司。完全弗氏佐劑及不完全弗氏佐劑采購自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司。商業(yè)化抗PCV2 亞單位疫苗（CSV）采購自青島易邦生物工程有限公司。商業(yè)化小鼠（Mouse）圓環(huán)病毒2 型抗體（PCV-2-Ab）試劑盒采購自江蘇菲亞生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

蛋白純化儀（美國GE 公司，AKTA explorer）；攪拌式生物反應(yīng)器（中國上海國強(qiáng)生化工程裝備有限公司，F(xiàn)AS-3L 型）；細(xì)胞培養(yǎng)自動(dòng)控制系統(tǒng)軟件（中國上海國強(qiáng)生化工程裝備有限公司，V2.0 版本）； PCR（Polymerase Chain Reaction）核酸擴(kuò)增儀（中國北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司）；超凈工作臺(tái)（中國蘇州博訊儀器有限公司，ETC811 型）；透射電子顯微鏡（日本電子株式會(huì)社，JEM-1400 型）；超聲破碎儀（美國Misonix 公司，QsonicaLLCQ125 型）；CountStar 細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(中國上海睿鈺生物科技有限公司，MD F4 型)；葡萄糖乳酸生化分析儀（中國山東省科學(xué)院生物研究所，SBA-40E 型）

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 載體構(gòu)建 構(gòu)建pEGFP-N1-Capid 載體。以豬圓環(huán)病毒2 型 NDSU41513 毒株編碼的衣殼蛋白基因（GenBank accession number KR816332.1）為基礎(chǔ)，進(jìn)行密碼子優(yōu)化， DNA 序列通過化學(xué)合成克隆到pUC57 載體（德泰生物科技有限公司）。在pUC57-Capsid 載體中，通過pEGFP-N1-Capid（PENC）引物用pfu 酶PCR 擴(kuò)增出PCV2 衣殼蛋白基因片段（表1）。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95 ℃、3 min（95 ℃、25 s，66 ℃、20 s，72 ℃、40 s） 25 循環(huán)，72 ℃、1 min。使用TianGen純化試劑盒（天根生化科技北京有限公司），回收PCR 擴(kuò)增目標(biāo)片段DNA，將回收PCR 產(chǎn)物與空載體pEGFP-N1 分別進(jìn)行NheⅠ和Hind ⅠⅠⅠ酶雙酶切，處理后使用T4 DNA 連接酶連接，構(gòu)建載體pEGFP-N1-Capid。構(gòu)建pcDNA3.1（+）-Capsid（△1-41aa）-Fc（pig）載體。Capsid（△1-41aa）-Fc（pig）基因序列是由PCV2衣殼蛋白基因通過鏈接子Linker（GSGGGSGGGG SGGGS）與豬血清免疫球蛋白G（ⅠgG）重鏈Fc 區(qū)域基因（序列ⅠD 為Gen Bank accession number AAD 38418.1）連接構(gòu)成。表達(dá)的蛋白為PCFP 融合蛋白。同樣將經(jīng)密碼子優(yōu)化的Capsid（△1-41aa）-Fc（pig）序列通過化學(xué)合成克隆到pUC57 載體上。通過帶有NheⅠ和Hind ⅠⅠⅠ酶切位點(diǎn)的pcDNA3.1（+）-Capsid（△1-41aa）-Fc（pig）（PDCF）引物（表1），PCR 擴(kuò)增出Capsid（△1-41aa）-Fc（pig）基因片段?；厥盏臄U(kuò)增產(chǎn)物與空載體pcDNA3.1（+）DNA 分別進(jìn)行限制性內(nèi)切核酸酶NheⅠ和Hind ⅠⅠⅠ酶雙酶切。T4 DNA 連接酶連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1（+）-Capsid（△1-41aa）-Fc（pig）。

表1 實(shí)驗(yàn)所用的引物Table 1 Primers used in this study

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染表達(dá)方法 在搖瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。將懸浮HEK293F 細(xì)胞和CHO-K1 細(xì)胞接種在含有HT 的Union 293 培養(yǎng)基中，置于37 ℃、85%濕度、φ=5.0%二氧化碳、100 r/min 轉(zhuǎn)速的搖床中培養(yǎng)。細(xì)胞在對(duì)數(shù)生長階段，細(xì)胞活率超過95%細(xì)胞擴(kuò)增。細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)，DNA 質(zhì)量濃度為1 mg/L，PEⅠ（Polyethylenimine）濃度依實(shí)驗(yàn)要求設(shè)定，將PEⅠ和DNA 按照相同體積進(jìn)行混和，室溫下靜置30 min。將配制的PEⅠ/DNA 復(fù)合物加入到細(xì)胞密度約為1.0 ×106cells/mL 待轉(zhuǎn)染細(xì)胞（HEK293F 或CHO 細(xì)胞）中。將細(xì)胞置于37 ℃、φ=5.0%二氧化碳、90 r/min轉(zhuǎn)速的二氧化碳恒溫?fù)u床中進(jìn)行培養(yǎng)。流加培養(yǎng)模式為補(bǔ)加葡萄糖，維持葡萄糖質(zhì)量濃度為2～5 g/L。在3 L 生物反應(yīng)器中對(duì)HEK293F細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。將裝1.2 L OPM-293 CD05 培養(yǎng)基的反應(yīng)器的攪拌轉(zhuǎn)速設(shè)定為120 r/min，溫度維持在37 ℃，pH 控制在7.0±0.1，溶解氧濃度為50%。當(dāng)活細(xì)胞密度為2.0×106cells/mL 時(shí)，以質(zhì)量濃度2 mg/L pcDNA3.1(+)-PCV2 Capsid(△1-41aa) –Fc(pig)質(zhì)粒，將PEⅠ-40kDa與質(zhì)粒按照質(zhì)量分?jǐn)?shù)比6∶1 進(jìn)行混合，孵育30 min后，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293F細(xì)胞。每天補(bǔ)加葡萄糖，維持葡萄糖質(zhì)量濃度為2～5 g/L。

1.3.3 融合蛋白純化 細(xì)胞生物反應(yīng)器培養(yǎng)結(jié)束后離心收獲細(xì)胞，將細(xì)胞濕重與pH7.4 的磷酸緩沖液按質(zhì)量體積比1∶8 重懸，超聲破碎。收集上清，0.22 μm膜過濾。同樣，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液，經(jīng)0.22 μm 膜過濾收集進(jìn)行親和層析純化。系統(tǒng)用平衡液以流速為4 mL/min 平衡10 個(gè)以上柱體積，然后將樣品（流速為1.0 mL/min）進(jìn)行上樣至完成。使用0.1 mol/L 甘氨酸（pH 為3.0）的洗脫液進(jìn)行洗脫，收集洗脫組分。使用1 mol/L Tris-HCl，pH 8.5 中和液，以體積比1∶10中和洗脫組分。

1.3.4 核酸瓊脂糖電泳鑒定 配制1.0%（10 g/L）并添加有10000x GelRed 核酸染料的核酸瓊脂糖凝膠，加入1x TAE 緩沖液，將分析樣品與6x 上樣染色緩沖液混勻進(jìn)行上樣。設(shè)定電壓150 V，運(yùn)行30 min。電泳完成后，拍照分析。

1.3.5 Western blot 分析 將樣品進(jìn)行SDS-PAGE 蛋白電泳，采用濕轉(zhuǎn)方式電轉(zhuǎn)到PVDF 膜。以350 mA電流模式，電轉(zhuǎn)90 min。電轉(zhuǎn)后的PVDF 膜，用PBST洗滌液進(jìn)行清洗，再用快速封閉液（QuickBlockTM Western，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行封閉15 min。將PVDF 膜置于一抗（兔抗衣殼蛋白多克隆抗體，體積比1∶1 000，美國Abcam 公司）中，于4 ℃下過夜孵育。用二抗（HRP標(biāo)記的山羊抗兔抗體，體積比1∶2 500，艾美捷科技有限公司）室溫孵育2 h。使用超敏ECL（Enhanced Chemiluminescent）化學(xué)發(fā)光試劑盒配制顯色液（P0018S，碧云天生物技術(shù)有限公司），用Tanon 5020 儀器進(jìn)行拍攝。采用ⅠmageJ 圖像分析系統(tǒng)對(duì)PCFP 融合蛋白的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.3.6 高分辨透射電子顯微鏡觀測(cè) 取20 μL PEⅠ/DNA 復(fù)合物樣品加在碳包裹銅網(wǎng)上。室溫放置15～30 min，用濾紙吸附掉多余樣品，用3%（30 g/L）磷鎢酸（Phosphotungstic Acid， PTA）進(jìn)行負(fù)染色，靜置10 min，上樣，觀測(cè)樣品形態(tài)與大小。對(duì)病毒樣顆粒樣品先稀釋10 倍，取20 μL 測(cè)試目標(biāo)蛋白樣品加在碳包裹銅網(wǎng)上。采用相同的操作方式，觀測(cè)樣品形態(tài)與大小。

1.3.7 小鼠免疫及小鼠抗衣殼蛋白血清抗體檢測(cè)

將4～6 周齡雌性BALB/c 小鼠在特定無病原體動(dòng)物（SPF）級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，保持在溫度和光照受控的環(huán)境以及可隨意獲取食物和水條件，并在正式實(shí)驗(yàn)前飼養(yǎng)7 d。小鼠按隨機(jī)分組，每組5 只小鼠。免疫方式采用腹腔注射。將PCFP 蛋白透析用緩沖液（1×PBS，pH 7.4）稀釋，再按體積比1∶1 與完全弗氏佐劑或不完全弗氏佐劑進(jìn)行混合乳化，制備成質(zhì)量濃度為100 μg/mL 的實(shí)驗(yàn)疫苗，用于首免或加強(qiáng)免疫。在首免12 d 后進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，注射體積為200 μL。小鼠眼眶取血，在第1 d、第14 d、第30 d 及第45 d 進(jìn)行采集。轉(zhuǎn)速1 000 r/min，10 min 離心。使用小鼠（Mouse）圓環(huán)病毒2 型抗體（PCV-2-Ab）試劑盒對(duì)樣本進(jìn)行抗體濃度測(cè)定。試劑盒采用衣殼蛋白作為抗原包被，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作，測(cè)定樣品數(shù)值。小鼠免疫評(píng)測(cè)如表2 所示。

表2 小鼠免疫評(píng)測(cè)Table 2 Ⅰmmunogenicity evaluation in mice

1.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 數(shù)據(jù)以means ± SD 表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。采用圖形和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析軟件（美國GraphPad Software 有限責(zé)任公司，GraphPadPrism 8 版本）進(jìn)行分析，并使用未配對(duì)的t 檢驗(yàn)（Student’s test）確定顯著性。 *p＜0.05 被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 重組質(zhì)粒構(gòu)建

采用PENC 引物（表1） 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，獲得豬圓環(huán)病毒2 型 NDSU41513 毒株編碼的衣殼蛋白基因（GenBank no.KR816332.1）片段。如圖1（a）所示，在750 bp 處有PCR 擴(kuò)增條帶，條帶大小與預(yù)期相符。將目標(biāo)片段與pEGFP-N1 質(zhì)粒雙酶切后進(jìn)行連接，構(gòu)建pEGFP-N1-Capsid 重組質(zhì)粒。DNA 測(cè)序顯示重組質(zhì)粒序列與目的序列完全一致，pEGFP-N1-Capid 重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。設(shè)計(jì)了新的PCV2 衣殼融合蛋白PCFP，即將PCV2 衣殼蛋白的N 端1-41 位氨基酸切除，同時(shí)在C 端連接上豬ⅠgG Fc 片段?；瘜W(xué)合成目的基因片段， 隨后利用PDCF 引物（表1）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。如圖1（b）所示，1 394 bp 處顯示的條帶大小與預(yù)期相符。將擴(kuò)增的目的片段與pcDNA3.1（+）質(zhì)粒雙酶切后進(jìn)行連接，構(gòu)建pcDNA3.1（+）-Capsid（△1-41aa）-Fc（pig）重組質(zhì)粒，并通過核酸序列測(cè)序確認(rèn)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 PCR products

2.2 PCV2 Capsid 基因在兩種不同宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)染的差異

CHO-K1 和HEK293F 細(xì)胞廣泛應(yīng)用在外源蛋白瞬時(shí)表達(dá)。然而，對(duì)于不同性質(zhì)的蛋白，不同細(xì)胞往往表現(xiàn)出不同的表達(dá)偏向性[25]。本文分別考察了空載體和帶有PCV2 Capsid 基因的pEGFP-N1 質(zhì)粒（pEGFP-N1-Capsid）在CHO-K1 和HEK293F 不同細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的差異。結(jié)果顯示（表3），在CHO-K1細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒pEGFP-N1 的轉(zhuǎn)染效率為24.12%，GFP 平均熒光強(qiáng)度值（RFU）為4 924.01，而轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-Capsid 質(zhì)粒時(shí)，轉(zhuǎn)染效率非常低，GFP的RFU 僅為82.90。而在HEK293F 細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染pEGFP-N1 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率達(dá)到35.48%，GFP 的RFU為13 506.92，pEGFP-N1-Capsid 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率僅為7.06%，GFP 的RFU 為434.63。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，帶有PCV2 Capsid 基因能夠降低兩種宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。然而，相對(duì)于CHO-K1 細(xì)胞，HEK293F 細(xì)胞在瞬時(shí)表達(dá)PCV2 Capsid 中表現(xiàn)出更好偏向性。

表3 pEGFP-N1 和pEGFP-N1-Capsid 質(zhì)粒在HEK293 細(xì)胞和CHO-K1 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染效率Table 3 Transfection efficiency of pEGFP-N1 and pEGFP-N1-Capsid plasmids transfected into HEK293 cells and CHO-K1 cells

2.3 不同PEI 轉(zhuǎn)染試劑在細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率上的差異

為了提高轉(zhuǎn)染效率，實(shí)驗(yàn)采用HEK293F 細(xì)胞作為瞬時(shí)轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，w(PEⅠ)∶w(DNA)為1∶4，在分批培養(yǎng)和流加-分批培養(yǎng)兩種模式下分別考察了不同PEⅠ轉(zhuǎn)染試劑（PEⅠ-25 kDa 和PEⅠ-40 kDa）對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響。結(jié)果顯示（圖2（a）），采取流加培養(yǎng)模式，采用PEⅠ-40 kDa 轉(zhuǎn)染試劑，獲得實(shí)驗(yàn)最高轉(zhuǎn)染效率35%。另外，PEⅠ-40kDa 實(shí)驗(yàn)組的最大活細(xì)胞密度可達(dá)到6.2×106cells/mL，細(xì)胞活率為86%。而PEⅠ-25 kDa 實(shí)驗(yàn)組的最大活細(xì)胞密度為3.9×106cells/mL，細(xì)胞活率為78%（圖2（b），2（c））。因此，在兩種不同的培養(yǎng)模式下， PEⅠ-40kDa 轉(zhuǎn)染試劑在HEK293F 細(xì)胞上表現(xiàn)出更好的轉(zhuǎn)染性能，可能是PEⅠ-40kDa 的低細(xì)胞毒性，獲得更高的細(xì)胞密度和轉(zhuǎn)染效率。

圖2 PEⅠ-25kDa 和PEⅠ-40kDa 轉(zhuǎn)染試劑的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率比較Fig.2 Transfection efficiency of PEⅠ-25kDa and PEⅠ-40kDa transfected into HEK293F

實(shí)驗(yàn)也考察不同孵育時(shí)間對(duì)PEⅠ／DNA 復(fù)合物形成表觀電荷定性研究。以300 ng 質(zhì)粒pEGFP-NⅠ-Capsid DNA 量，轉(zhuǎn)染試劑為 PEⅠ-40kDa，按PEⅠ/DNA不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)比(0， 1∶4、1∶2、 1∶1、2∶1、4∶1、8∶1)配制，各樣品體積都為40 μL 的混合液?；旌弦涸谑覝叵路謩e靜置孵育3 min 和30 min 后，在1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳阻滯實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示， 靜置孵育時(shí)間3 min的PEⅠ/DNA 混合樣品都向正極方向遷移（圖3（a）），表觀電荷表現(xiàn)為帶負(fù)電。而靜置孵育時(shí)間30 min 的PEⅠ/DNA 混合樣品，不同PEⅠ/DNA復(fù)合物樣品沒有出現(xiàn)向正極方向遷移的條帶，表觀電荷表現(xiàn)為正電（圖3（b））。另外，細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率實(shí)驗(yàn)顯示，對(duì)孵育時(shí)間3 min 的混合物進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染效率非常低（數(shù)據(jù)未顯示）。這種差異有可能是帶負(fù)電質(zhì)粒DNA不能被PEⅠ有效包裹，存在游離或吸附在PEⅠ外表面形式，影響DNA 進(jìn)入細(xì)胞體內(nèi)。

圖3 電泳阻滯實(shí)驗(yàn)（EMSA）分析PEⅠ/DNA 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)比下相互結(jié)合能力Fig.3 Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for the binding ability of different PEⅠ/DNA mass fractions

2.4 透射電子顯微鏡觀測(cè)PEI/DNA 復(fù)合物

首先實(shí)驗(yàn)考察對(duì)PEⅠ/DNA 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)比轉(zhuǎn)染HEK293F 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在質(zhì)粒質(zhì)量濃度為1 mg/mL 條件下，細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率隨著PEⅠ與DNA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)比提高而增強(qiáng)。 在w(PEⅠ)∶w(DNA)為8∶1 時(shí)，細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率達(dá)到最高，為18.4%（圖4）。為了探究不同w(PEⅠ)∶w(DNA)對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率影響的原因，采用透射電子顯微鏡來觀測(cè)不同比例的PEⅠ/DNA 復(fù)合物在外觀形狀和尺寸大小的差異。結(jié)果顯示（圖5），在w(PEⅠ)∶w(DNA)為1∶1 時(shí)，復(fù)合物呈現(xiàn)為大于300 nm、松散且無規(guī)則形態(tài)。而在w(PEⅠ)∶w(DNA)為6∶1 時(shí)，復(fù)合物呈現(xiàn)為15～80 nm 大小顆粒形態(tài)。因此，PEⅠ/DNA 復(fù)合物比例影響形成復(fù)合物的大小與形態(tài)。由于細(xì)胞的胞吞作用是細(xì)胞攝入外源物質(zhì)的重要方式，15～80 nm 大小的PEⅠ/DNA 復(fù)合物會(huì)有利于細(xì)胞的攝入，提高轉(zhuǎn)染效率。

圖4 PEⅠ/DNA 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)比轉(zhuǎn)染HEK293 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率Fig.4 Transfection efficiency of different mass fractions of PEⅠ/DNA transfected into HEK293 cells

圖5 負(fù)染色透射電子顯微鏡觀測(cè) PEⅠ/DNA 復(fù)合物的大小和形態(tài)Fig.5 Size and morphology of the PEⅠ/DNA complexes determined by negative staining transmission electron microscopy

2.5 PCFP 蛋白在3 L 反應(yīng)器瞬時(shí)表達(dá)及其分子自組裝

在3 L 反應(yīng)器中考察新型PCV2 衣殼融合蛋白PCFP 在HEK293F 細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)情況。在HEK293F活細(xì)胞密度為2.0×106cells/mL，pcDNA3.1(+)-PCV2 Capsid(△1-41aa) –Fc(pig)質(zhì)粒質(zhì)量濃度為2 mg/L，PEⅠ-40kDa 與質(zhì)粒以質(zhì)量分?jǐn)?shù)6∶1 比例混合，孵育30 min 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。結(jié)果顯示，細(xì)胞具有較好的生長狀態(tài)，最大活細(xì)胞密度達(dá)到5.0×106cells/mL（圖6（a））。葡萄糖質(zhì)量濃度維持在2～5 g/L，細(xì)胞代謝副產(chǎn)物乳酸低于2.7 g/L 水平（圖6（b））。對(duì)培養(yǎng)6 d細(xì)胞上清以及超聲處理的細(xì)胞沉淀進(jìn)行親和純化（圖6（c））。Western blot 分析顯示，獲得了一清晰目標(biāo)條帶（圖6（d）），表達(dá)量約為3.8 mg/L。實(shí)驗(yàn)成功實(shí)現(xiàn)了在3 L 反應(yīng)器上瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293F 細(xì)胞表達(dá)新型PCV2 衣殼融合蛋白PCFP。對(duì)純化的PCFP蛋白進(jìn)行負(fù)染色透射電鏡觀測(cè)，結(jié)果顯示，PCFP 在透射電鏡觀測(cè)下呈現(xiàn)大小約為41 nm 蛋白納米顆粒，形態(tài)類似于PCV2 滅活病毒（圖7）。PCFP 自組裝納米病毒樣顆粒特性，將為獲得更好免疫原性的疫苗研制提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

圖6 3 L 生物反應(yīng)器中的PCFP 表達(dá)與純化Fig.6 Expression and purification of PCFP in a 3 L bioreactor

圖7 負(fù)染色透射電子顯微鏡觀測(cè) PCFP 蛋白大小與形態(tài)Fig.7 Size and morphology of the PCFP protein determined by negative staining and transmission electron microscopy

PCV2 新型融合蛋白PCFP，能夠在3 L 反應(yīng)器中獲得表達(dá)。主要原因如下：（1）對(duì)PCV2 衣殼蛋白富含堿性氨基酸的去除，降低了蛋白等電點(diǎn)，從11.02 改變?yōu)?.84。（2）通過在C 末端融合豬ⅠgG Fc 片段，進(jìn)一步將等電點(diǎn)降低到8.78。（3）HEK293F細(xì)胞更適合表達(dá)病毒蛋白，最終在3 L 反應(yīng)器中獲得3.8 mg/L 瞬時(shí)表達(dá)水平。此外，實(shí)驗(yàn)通過負(fù)染色透射電鏡對(duì)PCFP 蛋白樣品觀測(cè)發(fā)現(xiàn)，PCFP 蛋白能夠自發(fā)形成形態(tài)類似于PCV2 病毒，大小約為41 nm顆粒。已有研究報(bào)道，當(dāng)PCV2 Capsid 去除N 端核定位序列會(huì)影響病毒結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性[26]。而本研究設(shè)計(jì)的PCFP 蛋白能自主裝形成約為41 nm 顆粒，推測(cè)可能是由于PCFP 蛋白Ⅰg Fc 形成鏈間二硫鍵，形成類病毒納米顆粒的主要原因。另外，研究表明，抗原提呈細(xì)胞（Antigen-Presenting Cells，APC）處理抗原時(shí)，抗原構(gòu)象的穩(wěn)定性會(huì)影響免疫原性和免疫極化。而在APC 細(xì)胞專職表達(dá)的Fc-γ 受體 (FcγR) 可以被高度特異性捕獲和呈遞，從而增強(qiáng)細(xì)胞免疫反應(yīng)[27]。因此，可以推測(cè)PCFP 蛋白中的Fc 片段靶向APC 能增強(qiáng)機(jī)體免疫反應(yīng)，獲得更好的免疫效果。

2.6 PCFP 蛋白免疫原性考察

對(duì)PCFP 蛋白及商業(yè)PCV2 疫苗 (CSV)免疫小鼠的血清進(jìn)行 ELⅠSA 測(cè)定，以評(píng)估PCV2 Capsid 特異性抗體的產(chǎn)生情況。實(shí)驗(yàn)采用沒有ⅠgG Fc 標(biāo)簽的重組PCV2 Capsid 蛋白作為包被抗原，消除來自Fc 片段的干擾。結(jié)果顯示（圖8），PCFP 和 CSV 免疫的小鼠都產(chǎn)生抗 PCV2 Capsid 特異性抗體。在第1 次免疫 (days post injection，dpi) 及在第12 dpi 加強(qiáng)免疫后，抗 PCV2 Capsid 特異性抗體迅速增加，在 30 dpi后獲得較高的抗體濃度。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)PCFP 蛋白免疫小鼠組比CSV 免疫的小鼠組產(chǎn)生更高濃度抗PCV2 Capsid 特異性抗體（p＜0.05）。顯然，PCFP 蛋白能夠有效誘導(dǎo)機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗PCV2 衣殼蛋白的特異性抗體。

圖8 抗PCV2 衣殼蛋白特異性抗體水平Fig.8 Specific antibodies levels of anti-PCV2 capsid

3 結(jié) 論

對(duì)PCV2 衣殼蛋白瞬時(shí)轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行考察，采用HEK293F 轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，PEⅠ-40kDa 轉(zhuǎn)染試劑，w(PEⅠ)∶w(DNA)為1∶4，孵育30 min 進(jìn)行轉(zhuǎn)染并進(jìn)行流加培養(yǎng)，細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率可達(dá)到35%。采用電泳阻滯實(shí)驗(yàn)及負(fù)染色透射電子顯微鏡方法分析發(fā)現(xiàn)，復(fù)合物的表觀電荷及大小是影響轉(zhuǎn)染效率的重要原因。同時(shí)，我們成功在3 L 反應(yīng)器中以HEK293F為宿主細(xì)胞進(jìn)行新型PCV2 衣殼融合蛋白PCFP 瞬時(shí)表達(dá)，獲得3.8 mg/L 表達(dá)水平，并發(fā)現(xiàn)PCFP 蛋白具有自組裝大小41 nm 類病毒納米顆粒特性，同時(shí)能有效誘導(dǎo)機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗PCV2 衣殼蛋白的特異性抗體。并且PCFP 產(chǎn)生抗PCV2 衣殼蛋白抗體的濃度高于商業(yè)亞單位疫苗（CSV）。

與商業(yè)化桿狀病毒/昆蟲系統(tǒng)生產(chǎn)PCV2 衣殼蛋白相比， 本文所采用HEK293F 細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的表達(dá)量仍存在差距，但采用建立和篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)高產(chǎn)細(xì)胞株，以及在培養(yǎng)基和工藝方面進(jìn)一步優(yōu)化仍具有很大的經(jīng)濟(jì)實(shí)用性潛力。