甘蔗糖蜜促進類球紅細(xì)菌輔酶Q10 的糖轉(zhuǎn)化效率

葛 燕， 栗 波， 劉愛軍， 肖慈英， 陳必欽， 朱志春， 梁劍光， 莊英萍， 王澤建

（1.常州大學(xué)藥學(xué)院, 江蘇 常州 213164；2.華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室, 上海 200237；3.河北欣港藥業(yè)有限公司, 石家莊 051530；4.內(nèi)蒙古金達威藥業(yè)有限公司, 呼和浩特 010000）

輔酶Q10（Coenzyme Q10, CoQ10），是一種親酯性分子，在有氧呼吸的電子傳遞鏈中充當(dāng)電子載體，產(chǎn)生三磷酸腺苷（ATP），并廣泛存在于生物中[1-2]。輔酶Q10是一種強抗氧化劑，通過直接清除自由基或再生生育酚水平來保護膜磷脂和蛋白質(zhì)不受脂質(zhì)過氧化的影響[3]。此外，輔酶Q10在膽固醇代謝、氨基酸代謝、維持溶酶體pH 值等方面發(fā)揮作用，已被證明直接影響許多基因的表達[4]。醫(yī)學(xué)研究表明，補充輔酶Q10對糖尿病患者、心血管衰竭患者以及患有阿爾茲海默癥和帕金森病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的患者有益[5-7]。

輔酶Q10的生物合成方法具有成本低、生產(chǎn)過程簡單、生物活性較高的特點，被認(rèn)為是最有前景的方法，主要生產(chǎn)菌株有酵母菌屬、假單胞菌屬、土壤桿菌屬、紅曲酶屬等[8]。輔酶Q10發(fā)酵優(yōu)化策略主要有分子優(yōu)化策略、氧調(diào)控策略和培養(yǎng)基優(yōu)化策略。Zhu等[9]通過在類球紅細(xì)菌中共同表達gpa-1 和vgb 基因，調(diào)節(jié)了細(xì)胞內(nèi)的氧化還原電位和攝氧量，產(chǎn)生了協(xié)同效應(yīng)，提高了輔酶Q10的產(chǎn)量和生物量，在補料分批發(fā)酵中，輔酶Q10產(chǎn)量達到600 mg/L。Wang 等[10]通過調(diào)節(jié)供氧水平和連續(xù)補料硫酸銨，將在線氧攝取速率（OUR）恒定控制在（45±2.2） mmol/(L·h)，輔酶Q10產(chǎn)量達到（2 584±82） mg/L，較對照組提高了15.4%。

培養(yǎng)基優(yōu)化是提高微生物代謝水平和產(chǎn)物積累較有效的方法[11]，其中碳源和氮源對菌體生長代謝影響較大。甘蔗糖蜜(Cane Molasses，CM)是制糖產(chǎn)業(yè)的副產(chǎn)品，其中含有40%～60%的糖(葡萄糖、蔗糖和果糖)，氮含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）約為8.7%。此外，甘蔗糖蜜中還含有一定量的氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸），有機酸（蘋果酸、檸檬酸、草酸等），無機鹽（Na+、Mg+、K+、P+等金屬離子）和維生素（膽堿、泛酸、煙酸）等物質(zhì)，可以為菌體生長提供能量、提供物質(zhì)合成所需的碳骨架和前體[12-15]。文獻[16]發(fā)現(xiàn)甘蔗糖蜜可以作為酵母菌株生長和代謝所必需的碳源，有效提高乙醇的產(chǎn)量。與葡萄糖和其他碳源相比，甘蔗糖蜜中含有大量的糖，是通過生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)生物產(chǎn)品的廉價原料[17]。Gomes 等[18]利用甘蔗糖蜜中的混合糖來生產(chǎn)丁醇，既降低了原材料的成本，又提高了丁醇的產(chǎn)量。

糖轉(zhuǎn)化率是影響輔酶Q10產(chǎn)量的關(guān)鍵，是生產(chǎn)中的主要組成部分，降低糖消耗量是提升生產(chǎn)效率的關(guān)鍵。甘蔗糖蜜能夠用于菌體的生長和能量的維持，實現(xiàn)替代糖的功能，用于菌體的生長且利用效率更高。甘蔗糖蜜具有成本低、污染物含量少、全年可用性等優(yōu)點，已經(jīng)被用于乳酸、丁酸、乙醇、檸檬酸等多種工業(yè)化產(chǎn)品的生產(chǎn)[19]。Wechgama 等[20]采用正交試驗設(shè)計優(yōu)化了培養(yǎng)基，提高了甘蔗糖蜜生產(chǎn)丁醇的效率，并且使糖轉(zhuǎn)化率提高到了90.50%，甘蔗糖蜜中含有大量的可發(fā)酵糖，有效地降低了生產(chǎn)成本。綜上所述，甘蔗糖蜜的添加有利于生產(chǎn)成本的降低，然而目前鮮有關(guān)于甘蔗糖蜜對輔酶Q10發(fā)酵的影響的報道，本研究首次考察了甘蔗糖蜜對輔酶Q10發(fā)酵的影響。

本文選用類球紅細(xì)菌作為出發(fā)菌株生產(chǎn)輔酶Q10，首先研究了不同碳源底物、甘蔗糖蜜濃度、玉米漿干粉對類球紅細(xì)菌菌體生長和輔酶Q10合成的影響，通過正交試驗優(yōu)化了甘蔗糖蜜、葡萄糖、磷酸二氫鉀的最佳配比，并在30 L 發(fā)酵罐上對甘蔗糖蜜添加工藝進行中試驗證。本文對提高輔酶Q10發(fā)酵效價和降低發(fā)酵成本具有重要的現(xiàn)實意義。

1 實驗部分

1.1 原料和試劑

1.1.1 菌株 類球紅細(xì)菌（Rhodobacter sphaeroides），由內(nèi)蒙古金達威藥業(yè)有限公司提供。

1.1.2 實驗儀器 SBA-40E 型生物傳感分析儀（山東省科學(xué)院生物研究所）；30 L 發(fā)酵罐（上海國強生化工程裝備有限公司）；安捷倫1260 型液相色譜儀（美國Agilent 公司）；MAX300-LG 型尾氣質(zhì)譜儀（美國Extrel 公司）；752 型紫外可見分光光度計（上海菁華科技儀器公司）。

1.1.3 培養(yǎng)基

（1）平板培養(yǎng)基（g/L）：酵母提取物15，磷酸氫二鉀1，氯化鈉2，七水硫酸亞鐵0.1，七水硫酸鎂0.5，硫酸錳溶液（10 g/L）3 mL，氯化鈷溶液（10 g/L）1 mL，氯化膽堿溶液（0.404 g/L）1 mL，瓊脂粉20，pH 7.0～7.2。

（2）種子培養(yǎng)基（g/L）：硫酸銨4，酵母粉2，味精1，玉米漿粉1，葡萄糖15，磷酸氫二鉀1，磷酸二氫鉀1，硫酸亞鐵0.2，硫酸鎂3.6，氯化鈉2，硫酸錳溶液1（0 g/L）2 mL，氯化鈷溶液（10 g/L）1.5 mL，pH 7.1～7.2。

（3）發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖30，硫酸銨3，味精3，玉米漿干粉4，磷酸二氫鉀1，硫酸鎂12，硫酸亞鐵1.2，氯化鈉2.5，酵母膏1，碳酸鈣2.5，GLT-309 消泡劑0.2 mL。

1.1.4 培養(yǎng)方法

（1）搖瓶培養(yǎng)：從平板上挑取顏色鮮艷、形態(tài)飽滿的單菌落接入裝有50 mL 一級種子培養(yǎng)基的500 mL搖瓶中，在32 ℃、260 r/min 下避光培養(yǎng)28 h，按1%接種量將一級種子液接入裝有200 mL 二級種子培養(yǎng)基的2 L 搖瓶中，在32 ℃、260 r/min 培養(yǎng)21 h；按10%接種量將二級種子液接入裝有45 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL 搖瓶中，在32 ℃、260 r/min 下培養(yǎng)48 h。

（2）發(fā)酵罐培養(yǎng)：30 L 發(fā)酵罐裝液量為20 L，按10%接種量接入到發(fā)酵罐中，初始轉(zhuǎn)速400 r/min，通氣量3 L/min，壓力0.05 MPa，溫度32 ℃，發(fā)酵過程中用氨水調(diào)控pH 為6.5，補料控制糖質(zhì)量濃度在（5.0±0.1） g/L，培養(yǎng)96 h，每4～6 h 取樣檢測OD700、菌體干重（DCW）、殘?zhí)?、pH、效價等參數(shù)，并鏡檢觀察菌體形態(tài)變化，每12 h留樣測效價，分別研究甘蔗糖蜜和玉米漿干粉對類球紅細(xì)菌產(chǎn)輔酶Q10的影響。

1.2 檢測方法

1.2.1 菌體濃度測定 OD700：取1 mL 發(fā)酵液，用去離子水稀釋至合適倍數(shù)，一級種子稀釋約20 倍，二級種子稀釋約20～50 倍，發(fā)酵液稀釋50～100 倍，使用紫外可見分光光度計在700 nm 波長處測吸光度。DCW：取10 mL 發(fā)酵液，在4 000 r/min條件下離心10 min，棄去上清后，將沉淀放入烘箱，于105 ℃下烘干稱量。

1.2.2 葡萄糖濃度測定 取5 mL 發(fā)酵液，在4 000 r/min離心5 min，取上清液稀釋至合適倍數(shù)，吸取25 μL 稀釋液，用葡萄糖測定儀進行檢測。

1.2.3 總糖濃度測定 用DNS（二硝基水楊酸）法測總糖。二硝基水楊酸與還原糖發(fā)生氧化還原反應(yīng)，生成3-氨基-5-硝基水楊酸，該產(chǎn)物在煮沸條件下顯棕紅色，且在一定濃度范圍內(nèi)顏色深淺與還原糖含量成比例。具體操作方法是取離心上清液，按照估計的總糖進行濃度稀釋?；靹蚝笕∠♂屢? mL 加入10 mL離心管，加入750 μL鹽酸和750 μL去離子水，攪拌均勻，沸水浴20 min。水解完畢后，冷卻至室溫，繼續(xù)加入750 μL、6 mol/L 的氫氧化鈉溶液，使溶液pH至7.4 左右，加入750 μL 去離子水，1.5 mL DNS 溶液，沸水浴5 min，最后加入4.5 mL 去離子水，混勻。在波長540 nm 處檢測吸光度。

1.2.4 輔酶Q10含量測定 通過高效液相色譜法測定發(fā)酵液中的輔酶Q10含量，具體色譜條件為：C18 色譜柱（4.6mm×150 mm，5 μm，不銹鋼柱），檢測波長275 nm，流動相為無水乙醇與無水甲醇混合液（乙醇與甲醇體積比為35∶65），進樣量20 μL，流速1.1 mL/min，柱溫35 ℃。

樣品處理方法：避光處理；吸取1 mL發(fā)酵液，置于10 mL 容量瓶中，加6 mol/L 鹽酸溶液10 μL，輕微振搖，再加無水丙酮2 mL，φ為30%雙氧水200 μL，用無水乙醇定容至刻度。再將容量瓶置超聲器中超聲提取45 min（容量瓶的塞子放小紙片，排氣、超聲過程水溫不宜過高，35 ℃以下），取出，搖勻。用0.45 μm針筒過濾器過濾，棄去初濾液，收集續(xù)濾液，用高效液相色譜儀分析。

1.2.5 糖轉(zhuǎn)化率（Yp/s） 糖轉(zhuǎn)化率的計算公式如下：

其中， TiterQ10為輔酶Q10產(chǎn)量，mg/L； ρG0為初始糖的質(zhì)量濃度, g/L； ρGt為最終糖的質(zhì)量濃度, g/L；經(jīng)檢測發(fā)酵2 d 培養(yǎng)基體積量揮發(fā)較少，可忽略不計。

1.2.6 OUR 檢測 發(fā)酵過程中采用質(zhì)譜儀對OUR進行在線測定，并使用Biostar 軟件對數(shù)據(jù)進行采集以及在線處理。OUR 的具體計算公式如式（2）：

其中，F(xiàn)in為進氣流量（mmol/L）；V為發(fā)酵液體積（L）；φinert,in, φO2,in, φCO2,in, φO2,out和 φCO2,out分別表示進氣中惰性氣體、氧氣、二氧化碳和尾氣中氧氣、二氧化碳的體積分?jǐn)?shù)，pin為進氣氣壓(Pa)，tin為溫度(℃)，h為進氣的相對濕度(%)。上述變量除tin、h外均由反應(yīng)器在線參數(shù)檢測獲得，tin、h為離線測定所得[21]。

1.2.7 二氧化碳釋放速率（CER）測定 GER 計算公式如式（3）所示：

2 結(jié)果與討論

2.1 不同碳源對類球紅細(xì)菌Q10 發(fā)酵過程的影響

碳源在微生物培養(yǎng)基中具有重要作用，為微生物生長提供物質(zhì)基礎(chǔ)，并為產(chǎn)物合成提供碳架。不同碳源進入糖酵解所需的酶不同，會影響微生物對碳源的利用效率和產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化效率。因此，本研究考察了不同種類碳源（葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、乳糖）搖瓶發(fā)酵對類球紅細(xì)菌生長和輔酶Q10合成的影響，結(jié)果如圖1 所示。

圖1 不同碳源對類球紅細(xì)菌發(fā)酵過程的影響Fig.1 Effects of different carbon sources on the fermentation process of Rhodobacter sphaeroides

搖瓶結(jié)果（圖1（a））可以看出，單糖更利于類球紅細(xì)菌生長，尤其是葡萄糖作為碳源最適合類球紅細(xì)菌菌體生長，發(fā)酵48 h 葡萄糖組菌體濃度可達到29.00 g/L，輔酶Q10質(zhì)量濃度292.00 mg/L，單位菌體產(chǎn)量10.07 mg/g（表1）。類球紅細(xì)菌對果糖的利用效果低于葡萄糖，這是因為果糖需要先轉(zhuǎn)化為果糖-6-磷酸，再轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6-磷酸，中間需要果糖激酶等一系列酶催化，導(dǎo)致菌體生長緩慢。從糖耗（圖1（b））可以看出，二糖可以被緩慢利用，但是類球紅細(xì)菌對二糖利用效果明顯低于單糖，二糖的菌體濃度只能生長到16 g/L 左右，這是因為二糖水解為單糖需要一系列酶的作用，其中，蔗糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖和果糖需要蔗糖酶，麥芽糖和乳糖分別需要麥芽糖酶和乳糖酶轉(zhuǎn)化為葡萄糖，而類球紅細(xì)菌相關(guān)酶的活力較低，導(dǎo)致菌體對糖的消耗比較緩慢，菌體生長缺乏有效碳源，菌體濃度較低，搖瓶內(nèi)未達到氧限制狀態(tài)，而輔酶Q10的合成是在氧限制的條件下，所以二糖組幾乎沒有產(chǎn)物的合成和積累。

表1 葡萄糖組和果糖組發(fā)酵參數(shù)Table 1 Fermentation parameters of cane molasses group and corn steep powder group

2.2 不同質(zhì)量濃度甘蔗糖蜜對類球紅細(xì)菌發(fā)酵過程生理參數(shù)影響

本研究將玉米漿干粉（Corn Steep Powder，CSP）全部替換為氮含量相等的甘蔗糖蜜（4 g/L 玉米漿干粉和5 g/L 甘蔗糖蜜中氮的質(zhì)量濃度基本相等），并研究了不同甘蔗糖蜜質(zhì)量濃度（5、10、15、20、25、30 g/L）對類球紅細(xì)菌生長和輔酶Q10合成的影響，結(jié)果如圖2 所示。

圖2 不同質(zhì)量濃度甘蔗糖蜜對類球紅細(xì)菌發(fā)酵過程的影響Fig.2 Effects of different mass concentrations of cane molasses on the fermentation process of Rhodobacter sphaeroides

由圖2（a）看出，添加5 g/L 甘蔗糖蜜組和對照組的DCW 皆可達到33 g/L，且添加5 g/L 甘蔗糖蜜組的輔酶Q10產(chǎn)量僅比對照組少3%（圖2（b）），說明甘蔗糖蜜可以替代玉米漿干粉作為類球紅細(xì)菌生產(chǎn)輔酶Q10的合適氮源。隨著甘蔗糖蜜添加質(zhì)量濃度的添加，菌體濃度呈先增長后降低的趨勢，輔酶Q10產(chǎn)量也呈現(xiàn)相同的趨勢。當(dāng)甘蔗糖蜜添加質(zhì)量濃度為20 g/L 時，DCW 和輔酶Q10產(chǎn)量均達到最高，分別為35 g/L 和343 mg/L，Q10產(chǎn)量較對照組提高了19.6%。當(dāng)添加的甘蔗糖蜜質(zhì)量濃度超過20 g/L 時，輔酶Q10的產(chǎn)量會稍微下降。從菌體的產(chǎn)物得率Yp/c結(jié)果（圖2（c））可知，甘蔗糖蜜添加組的Yp/c基本高于對照組，且在低質(zhì)量濃度糖蜜范圍下Yp/c與對照組相近，而隨著甘蔗糖蜜質(zhì)量濃度的增加，Yp/c與總效價的變化趨勢相似，先上升后下降，其中，添加20 g/L 甘蔗糖蜜條件下Yp/c達到9.87 mg/g，比對照組高14.2%。由圖2（d）知，添加甘蔗糖蜜有利于糖轉(zhuǎn)化率的提高，當(dāng)甘蔗糖蜜添加質(zhì)量濃度為20 g/L 時，糖轉(zhuǎn)化率達到最高（6.87 mg/g），較對照組提高了19.6%，葡萄糖得到了高效的利用。

甘蔗糖蜜中的糖類物質(zhì)可以被菌體利用，為菌體生長提供能量，甘蔗糖蜜中豐富的氮源有利于菌體生長中氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸及含氮代謝物的合成，當(dāng)添加一定量的甘蔗糖蜜時，有利于促進菌體生長，菌體生長越好，產(chǎn)量就越高。當(dāng)甘蔗糖蜜添加質(zhì)量濃度過高時，糖蜜中的金屬離子和其他的微量元素濃度過高會影響菌體生長代謝，進而抑制輔酶Q10的合成。以上實驗證明，輔酶Q10的合成過程中，甘蔗糖蜜質(zhì)量濃度為20 g/L時最利于菌體生長和產(chǎn)物合成，輔酶Q10的效價和糖轉(zhuǎn)化率可以得到顯著提高，有效地減少了對葡萄糖的利用，且甘蔗糖蜜價格低廉，可以降低生產(chǎn)成本，適合在生產(chǎn)中使用。

2.3 正交試驗

為探索碳源與氮源及無機鹽組分的最優(yōu)化搭配，本研究在單因素碳源實驗的基礎(chǔ)上，通過設(shè)計正交試驗選取對類球紅細(xì)菌產(chǎn)輔酶Q10影響較大的3 個因素：甘蔗糖蜜、葡萄糖、磷酸二氫鉀的質(zhì)量濃度，考察對輔酶Q10發(fā)酵的影響。各因素選取3 個試驗水平，以糖轉(zhuǎn)化率為考察指標(biāo)。正交試驗考察結(jié)果（表2）直觀數(shù)據(jù)分析及相應(yīng)方差統(tǒng)計結(jié)果（表3）顯示，葡萄糖質(zhì)量濃度對輔酶Q10糖轉(zhuǎn)化率的影響最為顯著（p＜0.05），磷酸二氫鉀的質(zhì)量濃度對類球紅細(xì)菌產(chǎn)輔酶Q10的糖轉(zhuǎn)化率影響最小。不同因素組合對輔酶Q10的影響和正交試驗的效應(yīng)曲線分別如圖3和圖4 所示。從菌體干重(圖3(a))及其效應(yīng)曲線圖(圖4(a))可知，菌體濃度與甘糖蜜和葡萄糖的初始添加量呈正相關(guān)，當(dāng)添加的甘蔗糖蜜質(zhì)量濃度為30 g/L、葡萄糖質(zhì)量濃度為70 g/L 時，菌體濃度達到最大，但是隨著葡萄糖質(zhì)量濃度的增加，耗糖速率也在增加(圖3(d)、4(d))，不利于糖轉(zhuǎn)化率的提升，增加了生產(chǎn)成本。正交試驗結(jié)果(表2)顯示，在 30 g/L 的初始糖質(zhì)量濃度下，輔酶Q10的糖轉(zhuǎn)化率最高，達到了 12.71 mg/g；隨著初始糖質(zhì)量濃度的增加，糖轉(zhuǎn)化率顯著下降，當(dāng)初始糖質(zhì)量濃度為 50 g/L，糖轉(zhuǎn)化率降到了 7.9 mg/g。甘蔗糖蜜質(zhì)量濃度影響統(tǒng)計結(jié)果顯示(圖3(b)、4(b)、4(c))，甘蔗糖蜜質(zhì)量濃度對輔酶Q10產(chǎn)量影響較大，20 g/L 為甘蔗糖蜜的最適添加的質(zhì)量濃度，當(dāng)添加的質(zhì)量濃度超過 20 g/L 時，由于甘蔗糖蜜中金屬離子等其他物質(zhì)的積累，對輔酶 Q10的合成以及糖轉(zhuǎn)化率的提升沒有促進作用。

表2 正交試驗結(jié)果表Table 2 Table of orthogonal experiment results

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance table

圖3 正交試驗中不同組合對輔酶Q10 發(fā)酵的影響Fig.3 Effect of different combinations on Coenzyme Q10 fermentation in orthogonal experiment

圖4 正交試驗效應(yīng)曲線圖Fig.4 Curves of the effects of orthogonal experiments

結(jié)合圖4 和表2 可知，最優(yōu)組合是A2B1C2，即甘蔗糖蜜質(zhì)量濃度為20 g/L，葡萄糖質(zhì)量濃度為30 g/L，磷酸二氫鉀質(zhì)量濃度為1 g/L 時，糖轉(zhuǎn)化率最高，達到12.71 mg/g，輔酶Q10效價達到380.1 mg/L，糖轉(zhuǎn)化率得到了較大的提升，且耗糖速率為0.62 g/(L·h)，有效地降低了糖耗，有利于降低生產(chǎn)成本。

2.4 甘蔗糖蜜添加工藝對輔酶Q10 合成的影響

為進一步分析甘蔗糖蜜對輔酶Q10發(fā)酵過程動態(tài)代謝的影響，結(jié)合搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化實驗結(jié)果，在30 L 發(fā)酵罐中考察了甘蔗糖蜜對輔酶Q10發(fā)酵過程中菌體生長和產(chǎn)物合成的影響，并與玉米漿工藝進行了對比分析。

30 L 發(fā)酵罐培養(yǎng)過程在線和離線相關(guān)參數(shù)的變化（圖5）顯示：在發(fā)酵前期，玉米漿干粉組菌體生長較快，且輔酶Q10效價高于甘蔗糖蜜組。在發(fā)酵后期（76 h 后），甘蔗糖蜜為氮源能夠更好地維持菌體活力，輔酶Q10合成速率能夠維持，96 h 發(fā)酵產(chǎn)量最高達到3 311 mg/g，比玉米漿干粉組高15.4%。OUR 作為能夠直接反應(yīng)細(xì)胞呼吸代謝情況的生理參數(shù)，可以體現(xiàn)出發(fā)酵過程中菌體生長的狀態(tài)。從兩組實驗OUR 變化可以看出（圖5（c））：在發(fā)酵60 h 前，甘蔗糖蜜組較平穩(wěn)，玉米漿干粉組波動較大；在發(fā)酵后期，玉米漿干粉組OUR 呈現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢，而甘蔗糖蜜組能維持較為穩(wěn)定的OUR 水平，且明顯高于玉米漿實驗組，這說明甘蔗糖蜜的添加明顯起到了維持菌體活力的作用。二氧化碳釋放速率（CER）變化（圖5（d））與OUR 表現(xiàn)出了同樣的趨勢，甘蔗糖蜜組優(yōu)于玉米漿干粉組，這些都表明甘蔗糖蜜的添加有利于菌體呼吸代謝。從單位產(chǎn)量（圖5（e））和輔酶Q10合成速率（圖5（f））也可以看出，甘蔗糖蜜的添加有利于維持后期菌體活力以及輔酶Q10的合成。通過甘蔗糖蜜組和玉米漿干粉組發(fā)酵過程參數(shù)的最大值（表4）可看出，與玉米漿相比，甘蔗糖蜜的糖耗（Ys/p）從112.78 kg/kg 降低到99.74 kg/kg，糖轉(zhuǎn)化率提高了13.9%。糖耗得到顯著降低，這是因為甘蔗糖蜜中含有的還原糖可以被菌體生長利用，從而降低了葡萄糖的消耗，并且提高了發(fā)酵后期葡萄糖轉(zhuǎn)化為輔酶Q10的效率，在提高產(chǎn)量的同時，進一步降低了生產(chǎn)成本。

表4 甘蔗糖蜜組和玉米漿干粉組發(fā)酵過程參數(shù)的最大值Table 4 Fermentation process maximum parameters of cane molasses group and corn steep powder group

圖5 甘蔗糖蜜組和玉米漿干粉組發(fā)酵過程代謝參數(shù)差異Fig.5 Difference of metabolic parameters between sugarcane molasses group and corn pulp dry powder group during fermentation

30 L 發(fā)酵罐的實驗結(jié)果表明，添加甘蔗糖蜜可有效提高輔酶Q10的產(chǎn)量，有利于菌體代謝活力的維持，并能有效提升輔酶Q10對葡萄糖的轉(zhuǎn)化率。此外，甘蔗糖蜜中含有氨基酸、有機酸、含氮化合物、維生素、K+、甜菜堿等能夠維持菌體的代謝活力，可為輔酶Q10合成提供前體，促進輔酶Q10的合成。

3 結(jié) 論

（1）考察了不同碳源對輔酶Q10的影響，發(fā)現(xiàn)葡萄糖為碳源最適于菌體生長和輔酶Q10的合成，同時，類球紅細(xì)菌可以利用二糖生長菌體，但利用率低于單糖。

（2）首次考察了添加不同質(zhì)量濃度的甘蔗糖蜜對輔酶Q10發(fā)酵的影響，當(dāng)甘蔗糖蜜添加質(zhì)量濃度為20 g/L時，輔酶Q10產(chǎn)量達到343 mg/L，糖轉(zhuǎn)化率提升了19.6%。

（3）通過正交試驗探究了甘蔗糖蜜、葡萄糖、磷酸二氫鉀的質(zhì)量濃度對類球紅細(xì)菌產(chǎn)輔酶Q10的影響，研究結(jié)果表明，當(dāng)甘蔗糖蜜質(zhì)量濃度為20 g/L、葡萄糖質(zhì)量濃度為30 g/L、磷酸二氫鉀質(zhì)量濃度為1 g/L 時，輔酶Q10產(chǎn)量提高了10.8%，且糖轉(zhuǎn)化率達到12.71 mg/g，較優(yōu)化前提高了85.0%。

（4）在30 L 發(fā)酵罐上考察了糖蜜添加工藝對輔酶Q10合成的影響，研究發(fā)現(xiàn)玉米漿干粉有利于前期菌體的生長和輔酶Q10的合成，而甘蔗糖蜜有利于維持菌體代謝活力和輔酶Q10的合成速率，促進后期輔酶Q10的合成，Q10產(chǎn)量最高達到3 311 mg/L，較對照組提高了15.4%，同時糖耗降低了11.8%，糖轉(zhuǎn)化率為10.10 mg/g，提高了13.9%。

（4）添加一定量的甘蔗糖蜜有利于輔酶Q10的合成和糖轉(zhuǎn)化率的提升，降低生產(chǎn)成本，為放大生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。后續(xù)可以通過結(jié)合代謝物組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)深入研究甘蔗糖蜜在類球紅細(xì)菌中的代謝機理，從而更全面深入地了解甘蔗糖蜜對輔酶Q10的發(fā)酵影響。