鹵代甲基轉(zhuǎn)移酶的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用研究進(jìn)展

陳 琦， 張詩雨， 高春玉， 鄭高偉， 許建和

（華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院, 生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室, 上海 200237）

烷基化反應(yīng)在化學(xué)合成和生物合成領(lǐng)域中具有重要的地位，通過引入甲基或其他烷基基團(tuán)，可以調(diào)控分子的生物活性和物理化學(xué)性質(zhì)，從而實現(xiàn)目標(biāo)分子結(jié)構(gòu)和功能的精準(zhǔn)設(shè)計。S-腺苷甲硫氨酸(SAM)及其依賴性甲基轉(zhuǎn)移酶(MT)體系是生物體內(nèi)常見的烷基化催化系統(tǒng)。由于甲基轉(zhuǎn)移酶的底物范圍十分廣泛，它不僅可以催化SAM-甲基的轉(zhuǎn)移，還可以在一定程度上催化SAM 類似物的烷基轉(zhuǎn)移，這種底物混雜性有利于實現(xiàn)天然產(chǎn)物的烷基隨機(jī)化。由于SAM 及其類似物的成本很高、且相對不穩(wěn)定，導(dǎo)致其應(yīng)用范圍受限。因此，研究SAM 及其類似物的合成或再生至關(guān)重要。

SAM 及其類似物的合成方法包括：化學(xué)合成、酶法合成和S-腺苷-L-半胱氨酸(簡稱SAH)的循環(huán)再生?；瘜W(xué)法催化SAH 可以生成有活性的(S)-SAM 和非活性(R)-SAM 的異構(gòu)體混合物。該異構(gòu)體混合物的分離純化較困難，且SAH 價格昂貴，因此該合成路線的經(jīng)濟(jì)性不高，難以實現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用。SAM 在生物體內(nèi)的合成主要依賴于S-腺苷甲硫氨酸合成酶(MAT)，它催化L-甲硫氨酸(L-Met)和三磷酸腺嘌呤(ATP)反應(yīng)，生成SAM 和三磷酸。MAT 也可以催化L-Met 類似物的縮合反應(yīng)，生成SAM 類似物?；瘜W(xué)-酶法生產(chǎn)的非對映體純SAM 和SAM 衍生物的引入，拓寬了酶催化烷基化反應(yīng)的范圍[1-2]。然而，L-Met 類似物需要通過化學(xué)法合成，合成方法相對復(fù)雜，且不易分離。2017 年，文獻(xiàn)[3]報道了一種基于多聚磷酸鹽的甲基轉(zhuǎn)移酶循環(huán)再生級聯(lián)反應(yīng)，如圖1 黑色箭頭所示路線。這個仿生的循環(huán)再生系統(tǒng)較好地解決了昂貴的SAH 不能直接回收的問題，標(biāo)志著MT 在生物催化應(yīng)用方面邁出了重要一步。該方法的主要不足在于系統(tǒng)中包含6 種酶和14 種代謝物，綜合成本過高，難以實現(xiàn)規(guī)?；瘧?yīng)用。

圖1 SAM 的原位循環(huán)再生反應(yīng)系統(tǒng)Fig.1 The in-situ recycling regeneration reaction system of SAM

2019 年，Seebeck 團(tuán)隊[4]通過引入鹵代甲基轉(zhuǎn)移酶(HMT)催化SAH 合成SAM，報道了一種更加簡單、通用的SAM 循環(huán)再生系統(tǒng)。HMT 除了可以同普通甲基轉(zhuǎn)移酶一樣產(chǎn)生甲基化產(chǎn)物外，還可以實現(xiàn)從SAH 到SAM 的直接再生。將HMT 與MT 級聯(lián)，并使用甲基碘(Met-I)作為SAH 的甲基供體，如圖1 紅色箭頭路線所示，就能實現(xiàn)簡單的體外甲基化級聯(lián)反應(yīng)。該體系可以實現(xiàn)高達(dá)500 多次的SAH 循環(huán)，比仿生級聯(lián)系統(tǒng)更加簡單、高效，為生物催化的烷基化反應(yīng)提供了新的策略。為了突破甲基供體碘甲烷有毒且易揮發(fā)的問題，2022 年Seebeck 團(tuán)隊[5]發(fā)現(xiàn)了來自硫嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶家族的酶(TPMT)，它能接受基于硫酸酯和磺酸酯的甲基供體，且其轉(zhuǎn)化SAH 生成SAM 的效率可與先前發(fā)表的利用碘甲烷的生物轉(zhuǎn)化過程相媲美。隨后，Hammer 團(tuán)隊[6]利用TPMT 家族的酶參與不飽和雜環(huán)的選擇性N-甲基化，可用于形成N-雜環(huán)的C?N 鍵，直接將有生物活性的先導(dǎo)結(jié)構(gòu)烷基化為各種潛在的、具有更高活性的烷基化衍生物，同時大大縮短了合成工藝路線。

為了實現(xiàn)更長鏈烷基的轉(zhuǎn)移，2021 年Bornscheuer團(tuán)隊[7]報道了以碘化物為甲基供體的擬南芥鹵代甲基轉(zhuǎn)移酶(AtHMT)的定向進(jìn)化研究，所得突變體V140T 可以接受乙基、丙基和烯丙基的碘化物，并產(chǎn)生相應(yīng)的SAM 類似物。他們還將AtHMT-V140T 與O-甲基轉(zhuǎn)移酶應(yīng)用于一鍋級聯(lián)反應(yīng)中，實現(xiàn)了木犀草素的區(qū)域選擇性乙基化和3,4-二羥基苯甲醛的烯丙基化。為了進(jìn)一步提高HMT 催化生成長鏈烷基轉(zhuǎn)移的效率，本課題組[8]采用半理性設(shè)計和基于結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系分析的定向進(jìn)化方法，對棒曲霉鹵代甲基轉(zhuǎn)移酶(AcHMT)進(jìn)行了分子改造，使其能夠更好地接受碘乙烷(EtI)，催化合成S-腺苷乙硫氨酸(SAE，為SAM 的乙基類似物)。篩選所得最優(yōu)突變體AcHMT-M3 對EtI 的比活力(421.5 mU/mg)比野生型AcHMT 的比活力(10.88 mU/mg)提高了38 倍，比Bornscheuer團(tuán)隊報道的最佳變體AtHMT-V140T 的比活力 (25.82 mU/mg)高出16 倍。最后，以3,4-二羥基苯甲醛(3,4-DHBAL)為底物，采用AcHMT-M3 和O-甲基轉(zhuǎn)移酶(RnCOMT-Y200L)進(jìn)行一鍋級聯(lián)反應(yīng)，如圖2 所示，成功實現(xiàn)了乙基香蘭素(Ethyl vanillin)的生物合成，證實了工程化的HMT 在生物催化實現(xiàn)化合物的乙基化修飾方面的巨大應(yīng)用潛力。

圖2 AcHMT-M3 和COMT 級聯(lián)催化3,4-DHBAL 一鍋法合成乙基香草醛[8]Fig.2 AcHMT-M3 and COMT catalyzed the one-pot synthesis of ethyl vanillin by 3,4-DHBAL[8]

鹵代甲基轉(zhuǎn)移酶HMT 的發(fā)現(xiàn)及其與MT 的級聯(lián)應(yīng)用研究，為生物催化的烷基化反應(yīng)提供了新的研究思路。利用HMT 的底物混雜性，不同的烷基鹵化物均有可能作為烷基供體用于SAM 及其類似物的酶促合成，從而實現(xiàn)酶催化的烷基轉(zhuǎn)移。最新的研究以磺酸類物質(zhì)作為新的甲基供體，在硫嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶家族成員的催化下實現(xiàn)SAM 再生，相較于鹵化物更加綠色環(huán)保。HMT-MTs 的級聯(lián)催化不僅實現(xiàn)了SAM 及其類似物的酶法合成和原位再生，也提高了反應(yīng)的原子經(jīng)濟(jì)性，使得烷基化反應(yīng)更加簡單、高效。然而HMT 對于長鏈或者更復(fù)雜的烷基供體的催化活力尚較低，使得它目前還無法滿足實際工業(yè)應(yīng)用的需求。因此對這類酶進(jìn)行催化機(jī)理解析、結(jié)構(gòu)改造以及新的同系酶挖掘?qū)⒊蔀槲磥淼难芯繜狳c。通過HMT 和HMT-MT 級聯(lián)反應(yīng)的更深入研究，可望獲得能接受新型非天然烷基供體的獨(dú)特酶催化劑，從而實現(xiàn)更多種化合物的高效生物烷基化，助力綠色生物制造的技術(shù)變革。