基于人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的組織工程化軟骨再生

李陽陽，張茂林，鄒多宏，張志愿

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔外科，上海交通大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，國家口腔醫(yī)學(xué)中心，國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，上海市口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200011）

由體細(xì)胞重編程而來的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）類似于胚胎干細(xì)胞，具有無限增殖能力及多向分化潛能[1]，且能夠避免胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESCs）所面臨的倫理和免疫排斥等問題[2-3]。定向誘導(dǎo)iPSCs 分化可以系統(tǒng)性揭示特定組織發(fā)育再生機(jī)制及其相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制[4-5]，為下一代再生醫(yī)學(xué)開辟一條新的道路[6-10]。目前iPSCs 來源的多巴胺能神經(jīng)元及胰腺細(xì)胞已經(jīng)開始被考慮用于臨床治療帕金森綜合征及糖尿病[11]，iPSCs 在軟骨/ 骨組織發(fā)育再生及相關(guān)疾病治療研究方面也具有良好的應(yīng)用前景[12]。

基于iPSCs 軟骨再生及骨關(guān)節(jié)等相關(guān)疾病的研究，研究者們[13-14]多采用擬胚體（embryoid bodies，EBs）、細(xì)胞團(tuán)塊、細(xì)胞分選或選用支架材料結(jié)合等培養(yǎng)方式，通過加入轉(zhuǎn)化生長因子β超家族（transforming growth factor β superfamily，TGF-βs）和其他蛋白因子，包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenic proteins，BMPs）及活化素（activins）等分階段誘導(dǎo)iPSCs 向軟骨中胚層方向分化，以期獲得均質(zhì)軟骨細(xì)胞。然而上述誘導(dǎo)培養(yǎng)方式周期長、過程復(fù)雜且不連續(xù)。因此，構(gòu)建合適的誘導(dǎo)培養(yǎng)體系，系統(tǒng)高效穩(wěn)定誘導(dǎo)iPSCs 向軟骨中胚層方向分化，是實(shí)現(xiàn)基于iPSCs 軟骨再生及其發(fā)育畸形發(fā)病機(jī)制探究這一目標(biāo)的關(guān)鍵前提[15]。

針對(duì)上述基于iPSCs 發(fā)育生物工程學(xué)及疾病模擬體系，在軟骨發(fā)育畸形發(fā)病機(jī)制及再生研究方面面臨的誘導(dǎo)培養(yǎng)難題，本研究通過誘導(dǎo)人源iPSCs（human iPSCs，hiPSCs）向中胚層方向分化，進(jìn)而通過三維（3D）懸浮培養(yǎng)成功誘導(dǎo)hiPSCs 分化為均質(zhì)軟骨組織，且hiPSCs 來源的軟骨組織在體內(nèi)未形成畸胎瘤。與前期研究相比，3D 懸浮培養(yǎng)體系能夠高效快速誘導(dǎo)hiPSCs 向軟骨中胚層方向分化，簡化了誘導(dǎo)方式，能夠?yàn)樘骄恳詇iPSCs 介導(dǎo)的發(fā)育再生醫(yī)學(xué)方式修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損問題提供良好的平臺(tái)，以期逐步解決臨床上所面臨的關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)重建難題。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

主要試劑：hiPSC 維持培養(yǎng)液（STEMCELL Technologies 公司，加拿大）；中胚層誘導(dǎo)液（STEMCELL Technologies 公司，加拿大）；軟骨誘導(dǎo)液（STEMCELL Technologies 公司，加拿大）；GAPDH（Proteintech 公司，美國）；Nanog 抗體（abcam 公司，英國）；SSEA-4 抗體（Thermo Scientific 公司，美國）；BCIP/NBT 堿性磷酸酯酶顯色試劑盒（上海碧云天公司，中國）；Sox2 抗體（abcam 公司，英國）；Ⅱ型膠原蛋白抗體（Millipore 公司，美國）；Sox9 抗體（Millipore公司，美國）；Aggrecan 抗體（Millipore 公司，美國）；番紅O-固綠染液（北京索萊寶公司，中國）；阿利新藍(lán)染液（廣州賽業(yè)公司，中國）；基質(zhì)膠（BD 公司，美國）。

1.2 hiPSCs 及ESCs 培養(yǎng)

H9 ESCs；hiPSCs（型號(hào)：DYR0100，人包皮細(xì)胞來源）由中國科學(xué)院提供。冰上溶解基質(zhì)膠，無血清DMEM/F12 培養(yǎng)液稀釋，均勻鋪在6 孔板上，并置于37 ℃孵育箱過夜，次日吸走上層培養(yǎng)液，將復(fù)蘇的hiPSCs/ESCs 細(xì)胞懸液接種到6 孔板中，每2 天換液1 次。

1.3 誘導(dǎo)hiPSCs 向軟骨中胚層方向分化

hiPSCs 中胚層誘導(dǎo)液培養(yǎng)3 d。3 d 后更換為軟骨誘導(dǎo)液繼續(xù)培養(yǎng)，誘導(dǎo)培養(yǎng)至第14 天后，將初步成形的細(xì)胞團(tuán)塊轉(zhuǎn)移至超低附著培養(yǎng)板，進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，軟骨誘導(dǎo)液每2 天換液1 次。

1.4 細(xì)胞免疫熒光

4%多聚甲醛固定30 min，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清 洗3 遍，抗 體Nanog（1∶200）、SSEA-4（1∶200）分別稀釋于含0.1% TritonX-100、1% 牛血清白蛋白、0.1% Tween 的PBS 溶液中，分別室溫避光孵育1 h，用PBS 清洗，紅色熒光二抗（孵育Nanog 一抗），綠色熒光二抗（孵育SSEA-4 一抗）避光孵育1 h，4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）法染核10 min，PBS 清洗，置于熒光顯微鏡下觀察。

1.5 堿性磷酸酯酶染色

4% 多聚甲醛固定30 min，PBS 清洗3 遍，配置好的堿性磷酸酯酶工作液避光孵育30 min，蒸餾水終止反應(yīng)，PBS 清洗，置于倒置相差顯微鏡下觀察。

1.6 Western blotting

RIPA 裂解液提取hiPSCs、ESCs 的總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，用10% 十二烷基硫酸鈉聚丙酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離等量的總蛋白，后轉(zhuǎn)至PVDF 膜（Bio-Rad 公司，美國），5% 脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST 清洗3 遍，4 ℃孵育過夜一抗Nanog（1∶2 000）、SSEA-4（1∶2 000）、Sox2（1∶2 000）、GAPDH（1∶5 000），第2 天用TBST 清洗3 遍，HRP-羊抗兔二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，在ChemiDoc成像系統(tǒng)（Bio-Rad 公司，美國）下觀察蛋白印跡條帶。

1.7 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）

用RNAiso Plus 裂解液（TaKaRa 公司，日本）提取hiPSCs、ESCs 及中胚層誘導(dǎo)第3 天、軟骨誘導(dǎo) 第28天的總RNA，Multiskan GO 系統(tǒng)（Thermo Scientific 公司，美國）測(cè)定RNA 的濃度及純度，反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa 公司，日本）合成cDNA，SYBR Green I aster mix（TaKaRa 公司，日本）混合cDNA，Light Cycler 96（Roche 公司，瑞士）進(jìn)行RT-qPCR，引物序列見表1，通過β-actin 標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)參，用2-ΔΔCt值表示每個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 RT-qPCR 引物序列Table 1 Primers sequence for RT-qPCR

1.8 阿利新藍(lán)、番紅O-固綠染色

hiPSCs來源的軟骨球用4%多聚甲醛固定24 h，脫水，包埋，切片，梯度脫蠟至水。阿利新藍(lán)8GX 染色20 min，蒸餾水中浸泡數(shù)秒，核固紅染色液染核20 min，梯度脫水，二甲苯透明20 min，光學(xué)樹脂封固；番紅O 染色：蘇木精染核68 s，酸性分化液分化 1～2 s，水洗，固綠染色30～60 min，弱酸溶液洗滌切片1～2 s，番紅O 染色2 min，水洗，95%乙醇脫水，無水乙醇脫水10～20 s，二甲苯透明10 min，光學(xué)樹脂封固。

1.9 免疫組織化學(xué)染色

hiPSCs來源的軟骨球用4%多聚甲醛固定24 h，脫水，包埋，切片，梯度脫蠟至水，胰蛋白酶修復(fù)抗原決定簇，用PBS 清洗，山羊血清37 ℃孵箱封閉1 h，甩去血清加一抗（1∶200），4 ℃孵育過夜，次日37 ℃復(fù)溫30 min，PBS 清洗，生物素二抗（1∶200）37 ℃孵育60 min，辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素37 ℃孵育20 min，PBS 清洗，DAB 液（1∶50）顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片。

1.10 裸鼠皮下實(shí)驗(yàn)

裸鼠背部備皮，用0.5%碘伏消毒，以麻醉劑戊巴比妥鈉腹腔注射，縱向切開裸鼠背部皮膚，向兩側(cè)鈍性分離，兩側(cè)植入hiPSCs 來源的軟骨球，縫合切 口。4 周后處死裸鼠并取材（裸鼠n=3；軟骨球n=6）。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析及獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hiPSCs 體外培養(yǎng)與多能干性維持

hiPSCs 體外傳代培養(yǎng)能夠維持其多能干性。免疫熒光檢測(cè)（圖1A、1B）顯示hiPSCs 與ESCs相似，均高表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物Nanog 及SSEA4。hiPSCs 及ESCs 堿性磷酸酶活性染色均呈現(xiàn)強(qiáng)陽性（圖1C）。Western blotting 實(shí)驗(yàn)（圖1D）顯示多能干性標(biāo)志物Sox2、SSEA4 及Nanog 蛋白表達(dá)水平無明顯差異。RT-qPCR 檢測(cè)結(jié)果（圖1E）與Western blotting 結(jié)果一致。以上結(jié)果證實(shí)，本研究hiPSCs體外培養(yǎng)體系能夠較好地維持其未分化狀態(tài)，保持其多能干性，為后續(xù)誘導(dǎo)hiPSCs 定向向軟骨中胚層分化打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

圖1 hiPSCs 體外培養(yǎng)與多能性維持（×100）Figure 1 In vitro culture and pluripotency maintenance of hiPSCs（×100）

圖2 hiPSCs 軟骨中胚層方向誘導(dǎo)分化培養(yǎng)體系Figure 2 Culture system of hiPSCs cartilage mesodermal induced differentiation

圖3 標(biāo)志物Nanog、Brachyury、Sox9 及Col2a1 的表達(dá)分析及hiPSCs 來源的軟骨球組織學(xué)分析Figure 3 Expression analysis of markers Nanog,Brachyury,Sox9 and Col2a1,and histological analysis of hiPSCs-derived cartilaginous pellets

圖4 hiPSCs 來源的軟骨球皮下移植及組織化學(xué)分析(×100)Figure 4 Subcutaneous transplantation of hiPSCs-derived cartilaginous pellets and histological analysis (×100)

2.2 誘導(dǎo)hiPSCs 向軟骨中胚層方向分化

本研究通過模擬體內(nèi)的發(fā)育方式，采用分階段誘導(dǎo)的方式，逐步誘導(dǎo)hiPSCs 向軟骨中胚層方向分化（圖2A）。中胚層誘導(dǎo)3 d 后，hiPSCs 克隆逐漸融合，細(xì)胞形態(tài)明顯改變，由圓形變?yōu)樗笮危▓D2B、2C）。中胚層誘導(dǎo)3 d 后，更換為軟骨誘導(dǎo)液，軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)至7 d 時(shí)，細(xì)胞逐漸聚集，形成細(xì)胞團(tuán)塊（圖2D）。培養(yǎng)至14 d 時(shí)，細(xì)胞球體逐漸從培養(yǎng)皿中脫離，至此，細(xì)胞球轉(zhuǎn)至低附著培養(yǎng)6 孔板中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)（圖2E）。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞球體直徑逐漸增大（圖2F），形成具有軟骨光澤的類軟骨球體（圖2G）。

2.3 軟骨中胚層誘導(dǎo)過程中標(biāo)志基因表達(dá)變化及hiPSCs 來源的軟骨球組織形態(tài)學(xué)分析

如圖3A 所示，中胚層誘導(dǎo)3 d 后，中胚層標(biāo)志物Brachyury 表達(dá)顯著上升，而多能干性標(biāo)志物Nanog 表達(dá)逐漸下降，提示hiPSCs 向中胚層方向分化，多能干性逐漸喪失；軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后，軟骨特異性標(biāo)志物Sox9 及Col2a1 的表達(dá)顯著提高，提示 hiPSCs 向軟骨方向分化。如圖3B 所示，培養(yǎng)至49 d 時(shí)，對(duì)hiPSCs 來源的軟骨球進(jìn)行組織化學(xué)分析，組織形態(tài)學(xué)及免疫組織化學(xué)分析顯示，hiPSCs 分化為均質(zhì)的軟骨細(xì)胞，具有典型的卵圓形細(xì)胞形態(tài)；番紅 O、阿利新藍(lán)及Ⅱ型膠原染色呈現(xiàn)均質(zhì)陽性。以上結(jié)果提示軟骨基質(zhì)逐漸在細(xì)胞團(tuán)塊中沉積。

2.4 hiPSCs 來源的軟骨球裸鼠皮下移植

hiPSCs 來源的軟骨球體內(nèi)維持其軟骨特性且無畸胎瘤或其他組織形成（圖4A）。移植的軟骨球被纖維膜包繞（圖4B）。組織學(xué)分析表明移植的軟骨球保持穩(wěn)定的軟骨形態(tài)，番紅O 及阿利新藍(lán)染色陽性（圖4B）。免疫組織化學(xué)分析顯示軟骨球Ⅱ型膠原蛋白染色呈現(xiàn)陽性（圖4B）。

3 討論

干細(xì)胞是一類未充分分化，尚不成熟的能夠自我更新的多潛能細(xì)胞，其具有再生各種組織器官乃至生物個(gè)體的潛能，是體外研究組織器官發(fā)育再生、構(gòu)建特定疾病模型及模擬病理過程的一個(gè)有效工具，在疾病治療和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有重要的價(jià)值[5]。iPSCs 最初由日本京都大學(xué)山中申彌[1，16]于2006 年利用病毒載體將4 種轉(zhuǎn)錄因子（Oct4、Sox2、Klf4 和c-Myc）轉(zhuǎn)入分化的體細(xì)胞中，使其重新編程進(jìn)而得到的類似胚胎干細(xì)胞的一種細(xì)胞類型。iPSCs 具有無限增殖能力及多向分化潛能，在組織器官發(fā)育再生研究方面能夠避免成體干細(xì)胞來源有限及胚胎干細(xì)胞所面臨的倫理學(xué)和免疫排斥等問題，為下一代再生醫(yī)學(xué)開辟了一條全新的道路。本研究體外成功培養(yǎng)hiPSCs，并能維持其類似于ESCs 的多能干性，同時(shí)構(gòu)建誘導(dǎo)hiPSCs 向軟骨中胚層方向分化的培養(yǎng)體系，成功誘導(dǎo)hiPSCs 體外分化為透明軟骨球體，且hiPSCs 來源的軟骨球體體內(nèi)移植無畸胎瘤形成的風(fēng)險(xiǎn)。本研究有望為基于iPSCs 的軟骨再生重建開創(chuàng)新的手段和技術(shù)平臺(tái)。

體外穩(wěn)定培養(yǎng)hiPSCs 并維持其多能干性是誘導(dǎo)hiPSCs 定向分化的關(guān)鍵前提。本研究中，hiPSCs經(jīng)多次傳代培養(yǎng)，細(xì)胞集落形態(tài)立體、緊密，形狀規(guī)則，能長期增殖保持其未分化的狀態(tài)[17]。免疫熒光、ALP 染色檢測(cè)顯示，hiPSC 與ESCs 類似，均高表達(dá)特定多能干性標(biāo)志物SSEA-4、Nanog 及堿性磷酸酶。同時(shí)，Western blotting 及RT-qPCR 結(jié)果進(jìn) 一步驗(yàn)證，多能干性標(biāo)志物Nanog、SSEA-4、Sox2 及Oct3/4 在hiPSCs 中的表達(dá)與在ESCs 中相當(dāng)[18]。以上結(jié)果證實(shí)本研究體外培養(yǎng)體系能夠維持hiPSCs未分化狀態(tài)，保持其多能干性，為后續(xù)誘導(dǎo)hiPSCs向軟骨方向分化奠定良好基礎(chǔ)。

關(guān)節(jié)軟骨主要分布在長骨的末端，起著潤滑和降低摩擦力的作用，當(dāng)它受到損傷或退行性變時(shí)，運(yùn)動(dòng)等對(duì)關(guān)節(jié)的沖擊無法得到緩沖，久之形成骨關(guān)節(jié)炎。組織工程和再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展為骨關(guān)節(jié)軟骨的缺損修復(fù)提供了新的策略[19]。構(gòu)建高效穩(wěn)定的軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)體系，是基于hiPSCs 軟骨再生的關(guān)鍵前提。細(xì)胞增殖、分化和代謝均受到微環(huán)境的影響。二維（two dimensions，2D）平面培養(yǎng)狀態(tài)下，細(xì)胞與基質(zhì)間及細(xì)胞與細(xì)胞間的相互作用與體內(nèi)生理?xiàng)l件存在明顯差異。3D 培養(yǎng)能夠模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，建立細(xì)胞間及細(xì)胞與胞外基質(zhì)的聯(lián)系[20-21]，促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化及細(xì)胞外基質(zhì)分泌等作用[22]。首先，本研究將hiPSCs 維持培養(yǎng)在鋪滿基質(zhì)膠的6 孔板進(jìn)行擴(kuò)增，然后誘導(dǎo)分化更換為中胚層誘導(dǎo)液，誘導(dǎo)hiPSCs 向中胚層方向分化，3 d 后中胚層相關(guān)標(biāo)志物Brachyury 表達(dá)顯著上升，此后將中胚層誘導(dǎo)液更換為軟骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)[23]。經(jīng)過一段時(shí)間的軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)皿中逐漸出現(xiàn)細(xì)胞團(tuán)塊。培養(yǎng)至14 d 后，將細(xì)胞團(tuán)塊轉(zhuǎn)移至低附著培養(yǎng)板中進(jìn)行3D懸浮培養(yǎng)。軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)至28 d 時(shí)，RT-qPCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，軟骨標(biāo)志物Sox9、Col2a1 表達(dá)逐漸升高，多能性標(biāo)志物Nanog 表達(dá)不斷下降，中胚層標(biāo)志物Brachyury 先上升后下降。軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)至49 d 時(shí)，對(duì)hiPSCs 來源的軟骨球體進(jìn)行組織化學(xué)分析，番紅O、阿利新藍(lán)化學(xué)染色及Col2a1 免疫組織化學(xué)染色均呈陽性。球體內(nèi)細(xì)胞呈現(xiàn)均一的卵圓形類軟骨細(xì)胞形態(tài)。以上結(jié)果證實(shí)，hiPSCs 成功分化為軟骨細(xì)胞。3D 懸浮培養(yǎng)體系能夠簡化誘導(dǎo)培養(yǎng)方式，穩(wěn)定高效誘導(dǎo)hiPSCs 分化為均質(zhì)軟骨細(xì)胞。

畸胎瘤形成的潛在風(fēng)險(xiǎn)是iPSCs 細(xì)胞用于臨床治療的一個(gè)主要障礙。未分化hiPSCs 體內(nèi)移植后，一般在4～12 周會(huì)有畸胎瘤的形成，本研究中hiPSCs 來源的軟骨球裸鼠皮下移植4 周后，無畸胎瘤形成。軟骨球的番紅O 和阿利新藍(lán)化學(xué)染色及Ⅱ型膠原蛋白免疫組織化學(xué)染色均呈陽性。以上結(jié)果證明hiPSCs 來源的軟骨球體內(nèi)能夠維持其軟骨特性且無畸胎瘤形成。因此，hiPSCs 來源的軟骨球具有良好軟骨再生臨床應(yīng)用前景。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了誘導(dǎo)hiPSCs 向軟骨中胚層分化的培養(yǎng)體系，該體系能夠模擬體內(nèi)發(fā)育過程，穩(wěn)定誘導(dǎo)hiPSCs 向軟骨中胚層方向分化，用于軟骨再生，為后續(xù)軟骨發(fā)育再生及發(fā)育畸形發(fā)病機(jī)制的研究提供一個(gè)全新的平臺(tái)。