乳酸菌對果蔬產(chǎn)品的抑菌機理及應用

王 璐，蔣沙沙，李德海*，孫常雁，李書欣

（1 東北林業(yè)大學生命科學學院 哈爾濱150040 2 哈爾濱理工大學材料科學與化學工程學院 哈爾濱 150080）

由于水果和蔬菜具有高營養(yǎng)價值和促進健康的特性，如防止糖尿病、癌癥和心臟病等，因此對它們的需求越來越大[1]。據(jù)國家統(tǒng)計局數(shù)據(jù)（2021年中國統(tǒng)計年鑒），我國農(nóng)產(chǎn)品總產(chǎn)量近20 億t，而一年的果蔬損耗量就超過1 億t，比多數(shù)國家年產(chǎn)果蔬總產(chǎn)量還多[2]。每年超過價值3 000 億的生鮮食品被損耗，相當于約6.7×108hm2耕地的投入和產(chǎn)出被浪費掉，而我國擁有的總耕地面積僅為1.2×109hm2。我國的農(nóng)產(chǎn)品腐敗損失率高達20%～30%，而歐美國家還不到5%（http：//www.nyguancha.com/）。2019 年的數(shù)據(jù)顯示，全球每年有超過三分之一的果蔬因腐敗菌污染、環(huán)境因素和儲存條件而變質(zhì)，其損失大約占糧食總損失的40%～50%，導致每年7 500 億美元的總損失[3]。果蔬產(chǎn)品的質(zhì)量劣化主要與腐敗菌的生長繁殖和果蔬自身生理過程的相互作用有關[4]，而這些損失可在采后貯藏中得到預防。為了防止果蔬被腐敗菌污染，人們廣泛使用常規(guī)化學防腐劑。盡管這些化學防腐劑在一定程度上能夠延長果蔬的保質(zhì)期，但是使用不當可能會對環(huán)境和人類的健康產(chǎn)生不可逆轉(zhuǎn)的影響[5]。在這種背景下，消費者對食品安全的認知日益增強，他們開始要求使用更安全、更天然的防腐劑。生物防腐劑作為一種替代選擇逐漸嶄露頭角，并以其天然成分和抗菌性能，受到了廣泛的研究和應用關注，如乳酸菌產(chǎn)生的乳酸鏈球菌肽、植物精油、殼聚糖等，其中使用乳酸菌進行果蔬保鮮除具有綠色、環(huán)保、安全、無毒等優(yōu)勢外，還可對人體產(chǎn)生一定的益處[6]，如乳酸菌發(fā)酵導致B 族維生素增加[7]，提高抗氧化活性等。

近年來，乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）被認為是可以增強果蔬產(chǎn)品保鮮的生物替代品，可以減少果蔬產(chǎn)品中的細菌載量，如抑制李斯特菌及梭狀芽胞桿菌等腐敗微生物[8]。乳酸菌被用于果蔬保鮮，是因其能夠能產(chǎn)生一系列的抗菌活性物質(zhì)，如有機酸、過氧化氫、細菌素等，它們可以抑制病原菌的生長[9]和降低抗菌素耐藥性[10]，這些活性物質(zhì)對革蘭氏陽性菌和陰性菌均有效。此外，作為益生菌，乳酸菌還具備潛在的健康效益。然而，乳酸菌在果蔬產(chǎn)品保鮮中應用并不廣泛。本文綜述了乳酸菌對果蔬腐敗菌的抑菌機制、研究現(xiàn)狀及果蔬產(chǎn)品保鮮中的應用情況。

1 乳酸菌對果蔬腐敗菌的抑菌機理

乳酸菌是一種公認的食品級微生物，能夠產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)并且對產(chǎn)品風味具有一定的積極影響[10]。乳酸菌在果蔬中的抑菌作用可以通過2種方式實現(xiàn)：一是添加活性菌，與果蔬中被污染或原生腐敗菌共同培養(yǎng)，乳酸菌可以快速定殖在果蔬產(chǎn)品上并迅速生長，與新鮮果蔬上的腐敗菌群競爭環(huán)境和營養(yǎng)物質(zhì)。利用各種微生物之間的拮抗作用和競爭性抑制作用，阻礙有害微生物的生長而不影響有益菌的增加[11]，以延緩腐敗菌或病原菌的生長，提高食品安全性和保質(zhì)期。二是提取乳酸菌在正常生長和新陳代謝過程中產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)，并在果蔬表面按一定量處理，以達到果蔬保鮮的目的[12]。乳酸菌在果蔬腐敗菌上的作用機制如圖1 所示，它們的作用形式如圖2 所示。

圖1 乳酸菌在果蔬腐敗菌上的作用機制Fig. 1 The mechanism of lactic acid bacteria on spoilage bacteria of fruits and vegetables

圖2 乳酸菌在果蔬腐敗菌上的作用形式Fig. 2 The action form of lactic acid bacteria on spoilage bacteria in fruits and vegetables

1.1 乳酸菌與果蔬腐敗菌的拮抗作用

在微生物的生命歷程中，它們?yōu)榱松娑鵂帄Z有利的環(huán)境條件，對營養(yǎng)物質(zhì)和環(huán)境資源的競爭主要以間接競爭和直接競爭兩種方式進行。間接競爭即為微生物尋求快速利用有機資源，而不與種群的其它成員進行直接競爭。直接競爭涉及競爭對手之間直接的對抗性互動，即為微生物之間的拮抗作用。其中腐敗菌和乳酸菌爭奪可用的營養(yǎng)素時，無論是作為單獨的機制還是與生物活性化合物結(jié)合使用，乳酸菌均可能通過有效利用營養(yǎng)物質(zhì)來抑制腐敗生物的生長，這會限制或耗盡生長培養(yǎng)基中必需的營養(yǎng)素[12]，以此達到抑制腐敗菌的目的。Honoré 等[13]對3 種副乳桿菌的代謝物消耗量進行評估，并研究了它們與腐爛菌生長抑制的聯(lián)系。他們觀察到，3 種副乳桿菌所消耗的葡萄糖和谷氨酰胺數(shù)量與腐爛菌的增長呈負相關關系，由此體現(xiàn)了乳酸菌與腐敗菌的拮抗作用。

1.2 乳酸菌的代謝產(chǎn)物對腐敗菌具有抑制作用

已鑒定出多種由乳酸菌產(chǎn)生的抗菌化合物，例如細菌素、有機酸、二乙酰基、乳酸等。這些物質(zhì)的種類涵蓋了基礎的有機酸及其初級代謝產(chǎn)物，再到更為復雜的多肽、蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)裂解產(chǎn)物，分別對腐敗生物的抑菌潛力進行表征，發(fā)現(xiàn)它們能夠通過降低pH 值、產(chǎn)生酸并調(diào)整細胞膜的通透性等發(fā)揮抗菌作用。雖然它們的抗菌作用略有差別，但均可以延長保質(zhì)期、增強安全性。已知從乳酸菌產(chǎn)生的代謝物可以有效地對抗革蘭氏陽性和陰性細菌，并且可以降低抗菌素耐藥性，由此體現(xiàn)了它們對果蔬保鮮的重要性。此外，乳酸菌包括幾個產(chǎn)生代謝物的屬，已被相關食品監(jiān)管機構批準用于食品應用。

1.2.1 有機酸 有機酸是乳酸菌發(fā)酵的主要代謝物，包括檸檬酸、乙酸和乳酸等[14]。王雅等[15]經(jīng)試驗發(fā)現(xiàn)乳酸菌菌株A32 在椰子水中所產(chǎn)抑菌物質(zhì)主要是有機酸類，此外還有很多研究表明乳酸菌產(chǎn)生的有機酸可顯著抑制果蔬及其制品上的腐敗菌，因此乳酸菌代謝產(chǎn)生的有機酸可以在果蔬中被用作抗菌劑。作用機理主要有降低pH 值、改變細胞膜的結(jié)構和通透性以及兩種或多種有機酸的協(xié)同作用等[16]。研究表明，添加有機酸會引起環(huán)境pH 值的改變，從而影響腐敗菌細胞膜的結(jié)構和通透性，導致內(nèi)部細胞代謝物的泄漏[17-18]。此外，有機酸還表現(xiàn)出親脂性特征，被允許在細胞膜脂質(zhì)中增溶，并可以進入細胞質(zhì)。在這種環(huán)境中，有機酸發(fā)生解離，從而會抑制酶促反應的發(fā)生以及導致細胞內(nèi)環(huán)境的酸化，減少腐敗菌增殖[16]。這種情況的發(fā)生取決于幾個因素，如目標腐敗菌的種類、酸解離常數(shù)、分子極性和大小、pH 值以及乳酸菌產(chǎn)生的其它抗菌物質(zhì)[19]。有機酸還可以通過改變細胞膜通透性來協(xié)同增強其它抗菌物質(zhì)的作用，如由乳酸菌生產(chǎn)的乳酸除了降低pH 值而具有抗菌特性外，還具有革蘭氏陰性細菌外膜滲透劑的功能，并且可以作為其它抗菌物質(zhì)作用的增強劑[20]。當乳酸和乙酸混合時可以發(fā)揮協(xié)同作用，比單獨使用任何一種酸更有效[21]。有機酸可以抑制梭狀芽胞桿菌（Clostridium difficile）、假單胞菌（Pseudomonas sp.）等果蔬腐敗菌，沙門氏菌（Salmonella）、李斯特菌（Listeria monocytogenes）等致病菌，以及蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、肉毒梭狀芽胞桿菌（Clostridiumbotulinum）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）等具有致毒素的細菌[22]。當然，乳酸菌的其它代謝產(chǎn)物也有助于乳酸菌的整體抗菌能力。

1.2.2 細菌素 還有一類由乳酸菌分泌的具有廣譜抑菌活性的蛋白質(zhì)類抑菌物質(zhì)——細菌素[23]，也已被證明對果蔬及其制品上的腐敗菌有效，如Yi 等[24]發(fā)現(xiàn)細菌素GF-15 對在線鮮切水果中富含的糞腸球菌表現(xiàn)出良好的抗菌活性。由乳酸菌分泌的細菌素主要有乳酸菌素、乳酸桿菌素、乳酸鏈球菌素等[25]，每一種都有針對生物膜的特定作用機制，它們主要通過作用于細胞膜和細胞壁發(fā)揮抗菌作用[17]。細菌素分子首先被膜表面吸收，形成瞬時孔道，造成質(zhì)子動能損耗、跨膜pH 值梯度變化，造成膜透性下降，并致使小分子滲漏、養(yǎng)分轉(zhuǎn)運及ATP 合成受阻[26]，最終造成菌體失活而死亡。另外，有些細菌素能引起敏感細胞的溶解，顯示出對果蔬致病菌和某些真菌的抗菌活性[27]。細菌素是天然存在的抗菌素，且已被證明可以作為食品生物防腐劑并進一步應用。它可以殺死或抑制與產(chǎn)生它們的細菌相關或不相關的細菌菌株。具有多種作用模式的細菌素組合可以提高對果蔬的保護效果，并且可以降低抗菌素耐藥性的發(fā)生率。

1.2.3 羅伊氏素 羅伊氏素（Reuterin）屬于抗生素的一種，是在厭氧條件下由羅伊氏乳桿菌在甘油發(fā)酵過程中產(chǎn)生的，該物質(zhì)主要構成成分包括3-羥基丙醛（3-HPA）單體、二聚體和水合物[28]。雖然經(jīng)過20 年的調(diào)查，羅伊氏素發(fā)揮其抗菌作用的確切作用機制仍然難以捉摸，但是已經(jīng)基本表明，它可以通過對蛋白及小分子巰基進行修飾，引起細胞內(nèi)的中的氧化應激反應，進而抑制DNA 的合成，達到抑制細菌生長的目的[29]。羅伊氏素對各種革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌、酵母菌和原生微生物具有殺菌和抑菌作用，并且對蛋白酶和脂肪酶具有抗性[29]。

1.2.4 H2O2過氧化氫（H2O2）可以由乳酸菌通過氧化酶【如丙酮酸氧化酶（Pox）、乳酸氧化酶（Lox）和NADH 氧化酶（Nox）】在中樞碳代謝中產(chǎn)生，對細菌和真菌都有抗菌作用。它可以對細胞膜產(chǎn)生強烈的氧化作用，并可以影響蛋白質(zhì)的分子結(jié)構[30]。Teusink 等[31]從多種食品中篩選到193 株乳酸菌，發(fā)現(xiàn)能夠在懸浮液中累積較高H2O2的有27株，且乳酸乳球菌AI 62（Lactococcus lactis AI 62）產(chǎn)生的H2O2對腐敗菌均有顯著抑菌作用。H2O2的作用模式與細菌細胞上的強氧化作用以及細胞蛋白質(zhì)的基本分子結(jié)構的破壞有關，可導致膜通透性的增加。此外，與其它物質(zhì)（例如硫氰酸酯）的反應可導致新抑制劑的形成[32]。研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌懸浮液中產(chǎn)生的H2O2能夠富集在菌懸液中，且抑菌效明顯，目前H2O2已成為一種被廣泛應用于果蔬等食品領域的抗菌物質(zhì)[33-34]。H2O2抑制細菌的作用機理是通過對DNA、蛋白質(zhì)和膜脂的氧化來實現(xiàn)的[31，35-36]。

1.2.5 乙醇和CO2乙醇是由碳水化合物和乳酸的無氧轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的一種有價值的最終產(chǎn)物。乙醇在果蔬食品中可以具有抗菌作用，是因為它對膜流動性和完整性具有影響，這可能導致質(zhì)膜滲漏和細菌細胞死亡[28]。CO2是在異質(zhì)發(fā)酵代謝過程中形成的另一種低分子質(zhì)量化合物，它的抑制作用基于厭氧環(huán)境的產(chǎn)生和影響細胞膜特性[12]。CO2分子可以與細胞膜脂質(zhì)相互作用，這就阻礙了離子被吸收到細胞中的可能性。不同的微生物對CO2的敏感性不同，酵母和霉菌對CO2具有很強的抵抗力，需要相當高的濃度來抑制它們，而革蘭氏陰性嗜冷菌對CO2氣體非常敏感。

1.2.6 抗真菌活性肽 除了小代謝物外，具有抗真菌活性的肽也是由乳酸菌產(chǎn)生的[37]，主要包括聚氨基酸、合成小分子AMP（單磷酸腺苷）和脂肽[38]等基本類。其中，聚賴氨酸可以通過靜電相互作用使果蔬腐敗菌細胞膜去極化，導致細胞膜破裂或內(nèi)容物流出，最終引起腐敗菌死亡[39-40]。這種作用機制使果蔬腐敗菌難以產(chǎn)生抗藥性，從而顯著提高抗菌效率；而AMP 表現(xiàn)出共同的特征：正電荷和疏水性。正電荷促進對帶負電荷的果蔬腐敗菌細胞質(zhì)膜的選擇，而疏水性和整體兩親性將肽錨定在細胞膜上，并且AMP 可以自結(jié)合到膜中，膜破壞致使細胞內(nèi)容物流出，并最終導致細菌死亡[41-42]；脂肽由于其特殊的結(jié)構，具有提高兩親性和與細胞膜脂質(zhì)壁相容的優(yōu)點。它們可以通過內(nèi)吞作用將活性物質(zhì)輸送到細胞中，還可以破壞腐敗菌的細胞壁并起到滅菌作用[43]?？咕牡目咕鷻C制涉及細菌細胞膜結(jié)構的不可逆損傷及其細胞壁和膜的通透性增加，而與細胞中酶系統(tǒng)的相互作用已被提出作為抑制細菌生長的潛在靶標。這些抗菌活性肽的抗菌活性的差異可能與它們的結(jié)構、氨基酸序列和每個肽的抗菌機制有關。

1.2.7 其它 除了前面討論的幾種代謝產(chǎn)物外，LAB 還能夠產(chǎn)生其它抗菌劑，例如短鏈/中鏈脂肪酸、雙乙?；捅交樗岬?，已知均具有抗真菌活性[44]。如苯基乳酸可以通過下調(diào)KdpB（屬于P 型ATP 酶超家族的泵樣亞基）抑制K+的轉(zhuǎn)運、抑制群體感應系統(tǒng)中功能基因的表達等來起到抑菌效果[45]。由于消費者對無添加劑食品的需求不斷增加，使用這些生物基化合物是確保果蔬安全和延長果蔬產(chǎn)品保質(zhì)期的有前途的策略[16]。

2 乳酸菌在果蔬產(chǎn)品保鮮中的應用

乳酸菌在果蔬的某些腐敗微生物群中占據(jù)主導地位，因此它對果蔬及其制品的生物保存具有至關重要的潛力。乳酸菌作為潛在的抑制腐敗菌的生物保護劑，在作用于果蔬及其制品時對其產(chǎn)生的感官品質(zhì)影響和安全方面的問題是至關重要的。事實上，各種研究已經(jīng)證明乳酸菌可以成功地應用于緩解各種果蔬及其制品中的真菌腐敗，使其成為化學防腐劑的可行替代品，表1 總結(jié)了各種乳酸菌及其代謝產(chǎn)物在果蔬產(chǎn)品中的應用，包括果蔬產(chǎn)品類型、抑菌物質(zhì)、靶向微生物以及應用效果。

總體來看，在各種果蔬原料或產(chǎn)品中加入乳酸菌或其代謝物，均能有效地抑制靶標菌種，且能適應大多數(shù)低溫儲藏環(huán)境。另外，雖然有不同的抑菌作用，但乳酸菌和它們的代謝物基本上都適合普通的果蔬制品的包裝方法和處理方法。

3 潛在優(yōu)勢及局限性

乳酸菌作為果蔬產(chǎn)品的天然抗菌劑有很大的潛力，通過靶向腐敗菌細胞結(jié)構或細胞穩(wěn)態(tài)來抑制果蔬產(chǎn)品中食源性病原體的生長。與傳統(tǒng)化學抑菌劑相比，乳酸菌不會讓果蔬腐敗菌產(chǎn)生抗藥性，且對人體健康和自然環(huán)境不會造成危害，也可以為果蔬產(chǎn)品提供額外的預防因素。與精油等植物抑菌劑相比，乳酸菌不會對果蔬的感官品質(zhì)產(chǎn)生不利的影響，特別是不會產(chǎn)生不良氣味。除了減緩果蔬產(chǎn)品的腐敗外，乳酸菌還對人類健康有益，如誘導免疫調(diào)節(jié)、防止生理應激以及改善腸道上皮的屏障功能[66]等。

在過去的10 年中，乳酸菌在抗果蔬產(chǎn)品腐敗菌領域已經(jīng)取得了非常顯著的進展，然而，某些局限性仍然需要解決。雖然近年來有許多關于乳酸菌及其代謝產(chǎn)物抗果蔬產(chǎn)品腐敗菌應用的研究報道，但只有少數(shù)研究調(diào)查了最終果蔬產(chǎn)品的質(zhì)量，包括感官分析等。同時，很少有商業(yè)化的乳酸菌培養(yǎng)物，這可能是由于任何特定菌株的抗真菌活性都取決于許多物理化學參數(shù)、果蔬產(chǎn)品生產(chǎn)過程和菌株在果蔬產(chǎn)品中產(chǎn)生化合物的能力。乳酸菌是一種極具發(fā)展前景的果蔬保鮮劑，但要實現(xiàn)規(guī)模化應用，仍面臨許多難題。第一，導致乳酸菌活力下降有諸多因素，果蔬制品中的組分及外界環(huán)境的變化，均可導致乳酸菌的死亡，進而導致其防腐性能下降，因此保持乳酸菌的穩(wěn)定應該成為科研工作的重點；第二，針對果蔬原料，多是通過戳破水果表面造成創(chuàng)口來探索其防腐方法的有效性，而要實現(xiàn)其在果蔬表面的生防作用，則需要通過表面的生防作用來提高細菌在表面的定植能力；第三，目前關于乳酸菌及其代謝產(chǎn)物的毒性和抑菌機制的研究尚不深入，這可能導致潛在的毒性風險對人們的生命安全構成危害。因此，專家學者在研究其機制的同時，應進行毒理學試驗研究，以明確不同乳酸菌或其代謝物的使用量、使用范圍以及對人們心理和人體健康的具體影響；第四，雖然乳酸菌具有有潛在的抗菌保鮮效果，但與化學保鮮劑或精油等植物保鮮劑相比，其產(chǎn)量較低且不易獲取，這在一定程度上限制了乳酸菌保鮮劑的工業(yè)化生產(chǎn)。為了克服這些限制，建議采用基因工程等技術對乳酸菌菌株進行改良，或者結(jié)合其它物理化學保鮮技術，以提高乳酸菌及其代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。這些措施有助于優(yōu)化果蔬的抗菌保鮮效果，并實現(xiàn)利益的最大化。

4 結(jié)論及展望

乳酸菌可以抑制果蔬腐敗菌，降低果蔬產(chǎn)品的腐敗率。近年來，研究人員繼續(xù)尋找天然防腐劑，以取代目前用于果蔬及其制品的化學防腐劑，實現(xiàn)更健康的飲食和生活方式。消費者對營養(yǎng)的認識不斷提高以及對自然和健康產(chǎn)品需求的持續(xù)關注，導致乳酸菌及其代謝產(chǎn)物作為生物防腐劑的歡迎程度增加。一般來說，已被證明對果蔬腐敗菌有效的乳酸菌及代謝產(chǎn)物的生物防腐劑，主要是細菌素和保護性培養(yǎng)物，它們不會對果蔬品質(zhì)或感官特性產(chǎn)生負面影響，顯示出它們作為天然抗菌劑的巨大潛力。隨著人們對果蔬防腐劑安全問題的重視，開發(fā)環(huán)保安全、綠色高效的新型微生物源果蔬抗菌劑必將具有廣闊的應用前景。