藍(lán)莓花色苷生理活性、提取純化及穩(wěn)態(tài)化研究進(jìn)展

李梓旋，郭佳婧，蘇東林，單 楊

（1 湖南大學(xué)生物學(xué)院隆平分院 長(zhǎng)沙410125 2 湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所 果蔬貯藏加工與質(zhì)量安全湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 長(zhǎng)沙 410125）

藍(lán)莓（Vaccinium uliginosum L.）是杜鵑花科越桔屬植物，為多年生落葉或常綠灌木，果皮藍(lán)色，果肉近白色，呈圓形，口感細(xì)膩，甜度適中，籽小皮薄[1]。藍(lán)莓富含膳食纖維、類(lèi)黃酮、多酚、維生素等多種活性物質(zhì)，是“漿果之王”，被聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織列為人類(lèi)五大健康食品之一[2]。

花青素是植物界中含量最多的可溶于水的色素之一，是類(lèi)黃酮化合物中的一個(gè)亞類(lèi)[3-4]，普遍存在于藍(lán)莓、紫薯、葡萄和黑米等果蔬中，主要有矢車(chē)菊色素、天竺葵色素、芍藥色素、飛燕草色素、牽?；ㄉ?、錦葵色素6 類(lèi)?；ㄇ嗨亟Y(jié)構(gòu)中含有多個(gè)羥基，性質(zhì)極不穩(wěn)定，在自然界中主要是通過(guò)糖苷鍵與葡萄糖苷、鼠李糖苷、半乳糖苷、阿拉伯糖苷等形成花色苷?；ㄉ站哂锌寡趸?、抗炎、抗癌、降血脂、保護(hù)視力等多種功能活性[5]，由于其水溶性強(qiáng)，容易受到水分子的親核攻擊引起褪色，且難以通過(guò)被動(dòng)運(yùn)輸進(jìn)入細(xì)胞中發(fā)揮作用，同時(shí)加工過(guò)程中的pH 值、溫度、光照、金屬離子、氧化還原劑和糖等也會(huì)影響其穩(wěn)定性。本文綜述了藍(lán)莓花色苷的功能活性、提取純化方法和穩(wěn)態(tài)化技術(shù)研究進(jìn)展，以期為藍(lán)莓花色苷的高效利用和應(yīng)用提供參考。

1 花色苷的簡(jiǎn)介

1.1 花色苷的結(jié)構(gòu)特性

花青素具有C6-C3-C6 碳骨架結(jié)構(gòu)，其母核為2-苯基苯并吡喃[4]，化學(xué)性質(zhì)活潑，通常以糖苷化的花色苷存在，根據(jù)苷元和糖苷配體的不同可形成多種花色苷，其結(jié)構(gòu)如圖1 所示。

圖1 花色苷的基本結(jié)構(gòu)Fig. 1 Basic structure of anthocyanins

1.2 花色苷的理化特性

花色苷可溶于水、乙醇、甲醇等溶劑，在水溶液中以黃鹽陽(yáng)離子、醌型堿、假堿、查耳酮形式存在，這幾種形式隨水溶液的pH 值變化而發(fā)生可逆改變，同時(shí)，溶液的顏色也隨結(jié)構(gòu)改變而改變，在酸性條件下呈紅色，在中性條件下呈無(wú)色，在堿性條件下呈藍(lán)色[6]?；ㄉ站哂? 種不同的吸收波段，分別是465～560 nm 的可見(jiàn)光區(qū)和270～280 nm 的紫外光區(qū)。

1.3 花色苷的功能活性

1.3.1 抗腫瘤 花色苷離體細(xì)胞試驗(yàn)顯示其具有抗腫瘤活性[7]，主要是通過(guò)調(diào)控多個(gè)基因的表達(dá)和激活，其中涉及到了磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶（PI3K/AKT）、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）、應(yīng)激活化蛋白激酶（JNK）與絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路中的基因?；ㄇ嗨貙?duì)胃腸道癌癥的預(yù)防主要是由于其具有抗氧化、抗炎和抗增殖特性，以及其調(diào)節(jié)基因表達(dá)和代謝途徑以及誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的能力。Xue 等[8]的研究表明，藍(lán)莓提取物能夠提高HepG2 細(xì)胞的活性氧（ROS）含量，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而將HepG2 細(xì)胞阻滯在S期。

1.3.2 保護(hù)心血管 花色苷在血管內(nèi)皮中可通過(guò)雙鏈轉(zhuǎn)運(yùn)酶進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)，激活內(nèi)皮一氧化氮合酶信號(hào)減少氧化應(yīng)激[9]，可作為血管舒張劑[10]。低密度脂蛋白（LDL）的氧化會(huì)導(dǎo)致巨噬細(xì)胞白細(xì)胞在動(dòng)脈壁的積累，斑塊破裂將氧化膽固醇沉積到動(dòng)脈壁上引起動(dòng)脈粥樣硬化，花色苷能增加血清抗氧化能力從而防止LDL 氧化和預(yù)防心血管疾病。

1.3.3 神經(jīng)保護(hù) 腦組織由于需氧量大，且抗氧化防御能力較低，因此對(duì)ROS 和活性氮（RNS）特別敏感[11]，花色苷由于具有一個(gè)或幾個(gè)羥基的芳香環(huán)的化學(xué)結(jié)構(gòu)，因此使其能夠接受來(lái)自ROS 或RNS 的未配對(duì)電子，穿過(guò)血腦屏障進(jìn)入腦組織清除自由基，降低患神經(jīng)退行性疾病和認(rèn)知能力下降的風(fēng)險(xiǎn)。

1.3.4 減輕氧化應(yīng)激反應(yīng) 低濃度活性氧對(duì)人體免疫系統(tǒng)、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和其它正常身體功能很重要，而ROS 過(guò)量則會(huì)引起細(xì)胞損傷，導(dǎo)致炎癥、心血管疾病、癌癥和衰老等退行性疾病[12]。線(xiàn)粒體是細(xì)胞內(nèi)ROS 的主要來(lái)源，通過(guò)呼吸鏈滲漏電子，ROS 在線(xiàn)粒體中的積累會(huì)導(dǎo)致線(xiàn)粒體膜的去極化，在心肌細(xì)胞等高能量消耗細(xì)胞中，線(xiàn)粒體活性受損會(huì)干擾葡萄糖和脂肪酸代謝引起心肌疾病，而花色苷及其代謝物原兒茶酸可以降低線(xiàn)粒體ROS 濃度減輕損傷[13]。

1.3.5 預(yù)防肥胖和糖尿病 肥胖是能量攝入和消耗不平衡引起的脂肪組織積累過(guò)多，通常與各種代謝紊亂有關(guān)，也增加了患2 型糖尿病、心血管疾病、糖尿病、脂肪肝、癡呆和骨關(guān)節(jié)炎等疾病的風(fēng)險(xiǎn)?；ㄉ湛筛纳浦炯?xì)胞功能，緩解代謝綜合征和肥胖。尤麗等[14]研究發(fā)現(xiàn)，藍(lán)莓花色苷能提高2型糖尿病模型小鼠糖代謝水平，促進(jìn)胰島素分泌，減少胰島抵抗，顯著降低總膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白LDL 的含量，升高高密度脂蛋白（HDL）膽固醇的含量，且為劑量-效應(yīng)關(guān)系。

1.3.6 調(diào)節(jié)腸道菌群 腸道菌群的變化被認(rèn)為是多種疾病的原因[15-20]，如胃腸道疾?。ㄑ装Y性腸?。?、神經(jīng)系統(tǒng)疾病（精神分裂癥和帕金森?。⒋x綜合征、心血管疾病和糖尿病等?；ㄉ战?jīng)過(guò)小腸代謝吸收后，不能被降解的部分（酰基化的花色苷）會(huì)進(jìn)入結(jié)腸作為益生元調(diào)節(jié)菌群，如促進(jìn)乳桿菌和雙歧桿菌等的定植[21]。Huang 等[22]研究表明灌胃11 周矢車(chē)菊素-3-葡萄糖苷【7.2 mg/（kg·d）】和花色苷提取物【8.0 mg/（kg·d）】可以調(diào)節(jié)高脂肪高糖飲食引起的小鼠腸道菌群變化，增加了門(mén)擬桿菌門(mén)細(xì)菌的豐度，降低了厚壁菌門(mén)細(xì)菌的豐度。

1.3.7 改善視力 隨著手機(jī)和電腦等電子產(chǎn)品的普及，越來(lái)越多的人因?yàn)橛醚圻^(guò)度導(dǎo)致眼酸、眼脹，誘發(fā)多種眼部疾病。藍(lán)莓花色苷可有效保護(hù)眼部微血管、改善血液循環(huán)，加速視紫質(zhì)再生。楊丹等[23]研究表明藍(lán)莓花色苷可通過(guò)調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路蛋白，使糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠的視網(wǎng)膜視野灰度值、黃斑水腫厚度下降，減輕視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng)。

1.3.8 其它功效活性 藍(lán)莓花色苷還具有抗衰老[24]、抗疲勞[25]、抗抑郁[26]、提高認(rèn)知功能[27]等作用。王紫玉等[25]利用含藍(lán)莓花色苷的谷物（LH）發(fā)酵物灌胃小鼠，結(jié)果表明，LH 干預(yù)組的小鼠負(fù)重游泳時(shí)間顯著增加，且體內(nèi)乳酸的積累量顯著降低，肝糖原儲(chǔ)備量顯著增高。羅麗平等[26]用乙醇提取藍(lán)莓花色苷并灌胃抑郁小鼠，可顯著提升抑郁小鼠的糖水偏好，顯著縮短小鼠懸尾時(shí)間。Boespflug等[27]研究表明，連續(xù)16 周在日常飲食中加入藍(lán)莓補(bǔ)充劑，受試者在工作記憶負(fù)荷的情況下表現(xiàn)出大腦活動(dòng)明顯增強(qiáng)。

2 藍(lán)莓花色苷的提取與純化

2.1 藍(lán)莓花色苷的提取方法

藍(lán)莓花色苷的提取方法主要包括溶劑萃取法、酶法提取、微波輔助提取法、超聲輔助提取法、超臨界流體萃取法、超高壓輔助提取法、亞臨界水提取法等，詳見(jiàn)表1。其中，溶劑提取是基于相似相溶的原理，利用甲醇、乙醇、丙酮等有機(jī)試劑進(jìn)行提取，因操作簡(jiǎn)單而被廣泛使用，還可輔助酶法和超聲等技術(shù)加速細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，促進(jìn)花色苷釋放，以縮短提取時(shí)間和提高提取效率。

表1 藍(lán)莓花色苷的提取方法Table 1 Extraction methods of blueberry anthocyanins

2.2 藍(lán)莓花色苷的純化方法

經(jīng)過(guò)初提之后的花色苷粗提物通常還有有機(jī)試劑和糖類(lèi)、蛋白質(zhì)、脂肪等大分子雜質(zhì)的殘留，因此需進(jìn)一步純化。花色苷純化的方法主要有大孔樹(shù)脂純化、制備型高效液相色譜、離子交換樹(shù)脂層析、膜分離法，詳見(jiàn)表2。其中大孔樹(shù)脂法因具有價(jià)廉、操作簡(jiǎn)單、純化效果好等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛使用，同時(shí)，也可將多種純化方法聯(lián)合使用，逐級(jí)分離，獲得高純度花色苷樣品。

表2 藍(lán)莓花色苷的純化方法Table 2 Purification methods of blueberry anthocyanins

3 藍(lán)莓花色苷的穩(wěn)態(tài)化研究

3.1 花色苷微膠囊化技術(shù)

花色苷的活性作用主要取決于其在機(jī)體內(nèi)的生物利用度，由于體內(nèi)酸堿性環(huán)境和酶等的作用，其生物利用度較低?；ㄉ帐紫冉?jīng)口攝入，雖然口腔pH 值為7.4 且含有大量唾液淀粉酶，但由于作用時(shí)間較短，因此只有少部分花色苷會(huì)被降解，大部分花色苷則進(jìn)入胃腸道中。胃部pH 值為1～3，因此花色苷能夠穩(wěn)定存在，只有少量花色苷在鈉依賴(lài)性葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)體1 的作用下以完整的形式被細(xì)胞吸收[46]。腸道是花色苷吸收的主要部位，花色苷在腸道pH 值6～7 的環(huán)境下發(fā)生大量分解，降解產(chǎn)物通過(guò)小腸黏膜進(jìn)入血液，參與體循環(huán)，經(jīng)腸細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化后轉(zhuǎn)運(yùn)到肝細(xì)胞，引起一系列水溶性偶聯(lián)代謝產(chǎn)物迅速釋放到肝腸循環(huán)系統(tǒng)并隨尿液排出?；ㄉ瘴茨苓M(jìn)入體循環(huán)的降解產(chǎn)物最終進(jìn)入pH 值為7～8 的結(jié)腸中，被微生物分解成小分子的酚酸。多項(xiàng)研究表明，由于花色苷在機(jī)體內(nèi)環(huán)境中的不穩(wěn)定性，使其未達(dá)吸收部位就會(huì)被降解，攝入富含花色苷的食物或花色苷提取物后，在血漿中檢測(cè)到的預(yù)測(cè)代謝物僅占攝入含量的1%。目前，包埋遞送技術(shù)是保護(hù)花色苷不被降解和提高生物利用度的有效手段，主要有噴霧干燥、冷凍干燥、乳化、凝膠、層層自組裝、多電解質(zhì)絡(luò)合等。

噴霧干燥是最常用的包埋技術(shù)之一，得到的顆粒含水量較低，而干燥過(guò)程中設(shè)備進(jìn)風(fēng)口溫度通常為130～170 ℃，會(huì)引起花色苷發(fā)生降解[47]，冷凍干燥技術(shù)可有效解決以上問(wèn)題，多項(xiàng)研究表明，冷凍干燥可以更好的保持花色苷的抗氧化活性和穩(wěn)定性。然而，物料經(jīng)過(guò)冷凍干燥后易結(jié)塊，存在粒度難以控制、制備的顆粒滲透性高等問(wèn)題[47]。

分子包埋法[48]是通過(guò)氫鍵、范德華力和疏水作用將一種材料從分子層次上嵌入到另外一種材料中，此法生產(chǎn)的制品，其芯、壁結(jié)合牢固，顆粒大小分布均勻，具有較好的穩(wěn)定性。然而，該方法對(duì)內(nèi)芯材料的要求較高，若芯材超過(guò)壁材分子的疏水區(qū)容納能力則無(wú)法實(shí)現(xiàn)芯材的有效包埋。

反溶劑沉淀法[49]是將壁材物質(zhì)溶解在一種沸點(diǎn)比水低、與水不相溶且易揮發(fā)的有機(jī)溶劑中，再加入芯材和表面活性劑后形成的油包水型乳狀液。在此基礎(chǔ)上，制備含有膠體穩(wěn)定劑的水溶液，將油包水乳化液加入其中，揮發(fā)去除有機(jī)溶劑后凍干獲得微膠囊。此法所制得的微球，其粒徑可達(dá)到納米級(jí)別，但包埋率低，約達(dá)40%。

凝聚微膠囊化是指一種或多種水膠體與初始溶液分離，使用同樣的反應(yīng)介質(zhì)，在懸浮或乳化的活性組分周?chē)恋沓鲂碌哪巯?，常用的壁材一般為蛋白質(zhì)、多糖等大分子成分，根據(jù)選擇壁材的數(shù)量可劃分為簡(jiǎn)單凝聚和復(fù)合凝聚兩種類(lèi)型，前者是只有一種壁材，后者則是通過(guò)改變?nèi)芤旱膒H值使多糖和蛋白質(zhì)帶著相反電荷，再利用靜電相互作用、氫鍵、疏水相互作用等聚合形成微膠囊。復(fù)合凝聚法具有制備條件溫和、芯材損耗少、包埋率較高、高溫高濕條件下穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，但存在成本高、僅能包埋不溶于水的芯材等缺點(diǎn)。Shaddel等[50]通過(guò)對(duì)花色苷進(jìn)行雙重乳化，形成W1/O/W2型乳液后加入明膠和阿拉伯膠溶液，通過(guò)靜電相互作用實(shí)現(xiàn)花色苷的高效包埋，其包埋率可以達(dá)到81.12%，載藥量為33.53%。

3.2 藍(lán)莓花色苷微膠囊化壁材

常見(jiàn)的包埋材料包括乳清蛋白、酪蛋白、明膠、殼聚糖、阿拉伯膠、果膠等，這些成分因具有良好的生物相容性、生物可降解性、成膜性、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，通常被用作生物活性成分的遞送。同時(shí)，由于蛋白質(zhì)和多糖的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，使其在體內(nèi)能夠?qū)γ浮H 值等條件的改變做出響應(yīng)，實(shí)現(xiàn)芯材的靶向釋放。

3.2.1 多糖 多糖在遞送系統(tǒng)中具有較高的包封效率、高耐酸性、高溶解性和高耐熱性等優(yōu)點(diǎn)?？捎糜诨ㄉ瞻竦亩嗵侵饕屑讱に豙51]、殼聚糖及其衍生物[52-53]、果膠[54]、黃原膠[55]、麥芽糊精[56]、海藻酸鹽[57]、卡拉膠[58]、硫酸軟骨素[59]等，這些物質(zhì)的羥基、羧基和氨基等親水官能團(tuán)可在上皮和黏膜的糖蛋白中與生物分子共價(jià)結(jié)合；還可通過(guò)氫鍵相互作用、疏水相互作用、靜電相互作用等方式和花色苷結(jié)合。

由于單一的多糖無(wú)法達(dá)到穩(wěn)定花色苷和靶向釋放的效果，因此在包埋過(guò)程中多采用2 種或者3 種具有不同性能的多糖進(jìn)行復(fù)合，詳見(jiàn)表3。

表3 用于花色苷遞送的多糖基壁材Table 3 Polysaccharide base wall materials for anthocyanin delivery

3.2.2 蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)因具有乳化性、溶解性、凝膠性、生物可降解性、生物相容性等優(yōu)點(diǎn)可用于花色苷的遞送。目前涉及的蛋白質(zhì)基遞送系統(tǒng)主要包括乳清蛋白[62]、酪蛋白[63-65]、大豆蛋白[66]、牛血清白蛋白[67]等。在油-水或氣-液界面上，蛋白分子側(cè)鏈上的親水基團(tuán)（如賴(lài)氨酸、天冬氨酸或脯氨酸）及疏水基團(tuán)（如酪氨酸或色氨酸）可在輸送系統(tǒng)中起到乳化劑的作用[58]。由于花色苷和蛋白質(zhì)之間的非共價(jià)鍵、氫鍵、靜電相互作用、范德華力和親核基團(tuán)之間的共價(jià)鍵等可使其自發(fā)結(jié)合[59]，結(jié)合類(lèi)型取決于花色苷分子的性質(zhì)以及蛋白質(zhì)的側(cè)鏈基團(tuán)和酰胺鍵，結(jié)合強(qiáng)度可改變花色苷-蛋白質(zhì)聚集顆粒的功能，詳見(jiàn)表4。

表4 用于花色苷遞送的蛋白質(zhì)基壁材Table 4 Protein base wall materials for anthocyanin delivery

花色苷與蛋白質(zhì)結(jié)合后能顯著提高其抗氧化活性和穩(wěn)定性，防止褪色和失活。蛋白質(zhì)與花色苷的相互作用也可以改變蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而改善其性能。相比于單一的蛋白質(zhì)或花色苷分子，二者結(jié)合之后形成的顆粒的總粒徑可能會(huì)有所增加，在較高的花色苷濃度下，分子之間的相互作用以及基團(tuán)之間的物理振動(dòng)和拉伸可能會(huì)使得尺寸減小。由于具有較小粒徑的分子更容易被機(jī)體吸收，因此在選擇花色苷的包封材料時(shí)，粒徑的顆粒之間的分散性應(yīng)該作為包封效果的評(píng)價(jià)指標(biāo)之一。蛋白質(zhì)基遞送系統(tǒng)容易受到生物機(jī)體內(nèi)蛋白酶的消解作用，蛋白質(zhì)具有的等電點(diǎn)使其容易受到pH 值的影響發(fā)生聚集和沉淀，導(dǎo)致生物利用率下降。Lang 等[65]對(duì)比了α-酪蛋白和β-酪蛋白對(duì)藍(lán)莓花色苷的穩(wěn)定效果，兩種蛋白均能提高藍(lán)莓花色苷在腸道消化過(guò)程中的穩(wěn)定性，保護(hù)其抗氧化能力，且α-酪蛋白的效果優(yōu)于β-酪蛋白。

3.2.3 多糖-蛋白質(zhì) 單一的包埋壁材并不能完全實(shí)現(xiàn)花色苷的控制釋放和靶點(diǎn)遞送，因此可將多種類(lèi)型壁材復(fù)合使用以彌補(bǔ)單一材料的缺陷。如多糖和蛋白質(zhì)復(fù)配的遞送體系中，多糖提供穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)來(lái)防止蛋白質(zhì)降解沉淀，蛋白質(zhì)則提供良好的乳化和溶解作用，協(xié)同花色苷發(fā)揮生理功效。Cui 等[68]通過(guò)酪蛋白（CA）和羧甲基纖維素（CMC）的自組裝制備納米復(fù)合物來(lái)包埋藍(lán)莓花色苷，結(jié)果表明配合物Ⅲ（CA-CMC-ACNs）的尺寸最小為209.9 nm，而配合物II（CMC-ACNs-CA）的包埋率（EE）最高（44.23%）。Ma 等[69]使用明膠和殼聚糖包埋藍(lán)莓花色苷，包埋率為83.81%，在室溫下穩(wěn)定，15 d 后的保留率為50%。

4 結(jié)語(yǔ)

我國(guó)藍(lán)莓資源十分豐富，其主要活性成分花色苷雖具有多種功能活性，但存在穩(wěn)定性差、體內(nèi)生物利用度低等問(wèn)題。傳統(tǒng)的花色苷提取純化技術(shù)大多集中在有機(jī)溶劑提取上，因此，有必要從綠色環(huán)保和節(jié)能增效兩方面出發(fā)，創(chuàng)新花色苷綠色提取純化和穩(wěn)態(tài)化調(diào)控技術(shù)，實(shí)現(xiàn)花色苷功能及應(yīng)用的品質(zhì)提升，為促進(jìn)我國(guó)水果產(chǎn)業(yè)健康高質(zhì)量和可持續(xù)發(fā)展提供參考。