蛋白質(zhì)與多酚的互作機(jī)制及其應(yīng)用

王遠(yuǎn)利，康心蕊，陶 亮，*，張 權(quán)，王紫琳，田 洋

（1 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院 昆明650000 2 食藥同源資源開發(fā)與利用教育部工程研究中心 昆明650000 3 云南省藥食同源功能食品工程研究中心 昆明650000 4 云南省精準(zhǔn)營養(yǎng)與個性化食品制造重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 昆明 650000）

蛋白質(zhì)是由20 種不同氨基酸相互連接而成的一種結(jié)構(gòu)高度復(fù)雜的多聚體。作為生命活動的物質(zhì)基礎(chǔ)，蛋白質(zhì)不僅是人體六大營養(yǎng)素之一，也是食品加工中的重要組成成分，廣泛存在于奶制品、肉類、蛋類、谷物、豆類和油籽中[1]。多酚是植物產(chǎn)生的一種次生代謝產(chǎn)物，根據(jù)其碳架的結(jié)構(gòu)，多酚可分酚酸類、單寧類以及黃酮類化合物[2]。研究表明，多酚具有抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)腸道菌群的能力，并具有抗癌、抗心血管疾病、抗肥胖、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用，是人類利用的天然植物化學(xué)物質(zhì)的主要來源之一[3-4]。

在活體植物中，蛋白質(zhì)和多酚以嚴(yán)格的分子結(jié)構(gòu)和特定的細(xì)胞內(nèi)腔形式存在，避免了相互作用的發(fā)生。然而，復(fù)雜的食品加工過程會對細(xì)胞組織造成損害，導(dǎo)致多酚穿過液泡邊界與蛋白質(zhì)（尤其是與位于細(xì)胞壁的蛋白質(zhì)）結(jié)合。同時，由于破壞了細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，細(xì)胞內(nèi)的多酚將暴露在來自環(huán)境大氣的氧氣及其它氧化化合物中，進(jìn)而產(chǎn)生一系列物化反應(yīng)，使蛋白質(zhì)、多酚在加工過程中出現(xiàn)新的結(jié)構(gòu)并改變其生物功能[5]，發(fā)生氧化、吸附、增溶、沉淀等現(xiàn)象，影響食物的感官和營養(yǎng)品質(zhì)，如多酚與唾液蛋白相互作用導(dǎo)致紅酒等飲品澀味的形成，單寧的存在使蛋白質(zhì)的消化率下降，植物性飲料中添加蛋白質(zhì)（沉淀單寧）可改善飲料穩(wěn)定性和口感，與蛋白質(zhì)形成的復(fù)合物可能通過掩蓋酚類化合物的抗氧化特性，降低其功能性等[6]。

為了有效控制食品加工、流通過程中蛋白質(zhì)和多酚的分子結(jié)構(gòu)、功能及營養(yǎng)特性，指導(dǎo)富含蛋白質(zhì)與多酚產(chǎn)品的開發(fā)與利用，突破二者應(yīng)用場景的局限性，充分了解蛋白質(zhì)與酚類物質(zhì)的相互作用，本文綜述蛋白質(zhì)-多酚互作機(jī)制及其研究方法，功能特性及其潛在應(yīng)用，為其在新型健康食品和生物醫(yī)藥等應(yīng)用場景的高值化應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 蛋白質(zhì)-多酚互作機(jī)制

蛋白質(zhì)與多酚的相互作用受其組成、含量及反應(yīng)環(huán)境條件的影響，并進(jìn)一步影響復(fù)合物的理化特性。一般來說與蛋白質(zhì)作用最密切的多酚類化合物是具有分子質(zhì)量大、結(jié)合位點(diǎn)多等特點(diǎn)的單寧酸；對蛋白質(zhì)而言較松散的結(jié)構(gòu)（精氨酸和脯氨酸含量高）以及較高的疏水性，可使其分子靈活度增大，空間位阻減小，有助于提高其與多酚的親和力[7]。此外蛋白質(zhì)、多酚在共存體系中相應(yīng)的濃度、pH 值、溫度、離子強(qiáng)度等也顯著影響二者的相互作用及復(fù)合物結(jié)構(gòu)，具體如圖1 所示。兩者間的相互作用力類型主要包括共價和非共價兩個類型。有研究報道，隨著周圍條件的改變，這兩種作用可以同時發(fā)生或從非共價相互作用轉(zhuǎn)移到共價相互作用[8]。

圖1 蛋白質(zhì)-多酚相互作用影響因素[8]Fig. 1 Factors affecting protein-polyphenol interactions[8]

1.1 機(jī)理

1.1.1 非共價相互作用 蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物形成所涉及的非共價相互作用主要涉及范德華力、疏水、靜電、氫鍵相互作用（圖2），比共價相互作用弱1～2 個數(shù)量級。其中，疏水相互作用是主要作用力，發(fā)生在蛋白質(zhì)疏水位點(diǎn)與多酚的非極性芳香環(huán)之間，如脯氨酸殘基的吡咯環(huán)以及亮氨酸、賴氨酸或脯氨酸等氨基酸的非極性側(cè)鏈[9]。氫鍵產(chǎn)生在蛋白質(zhì)羰基的N、O 或S 原子等電負(fù)性原子與多酚羥基的氫原子之間[10]，同時氫鍵的存在會促進(jìn)疏水相互作用的提升[11]。Chanphai 等[12]研究表明，酪蛋白能夠通過Phe23、Phe24、Phe28、Phe32、Val31 等氨基酸殘基與兒茶素發(fā)生氫鍵及疏水相互作用。此外，蛋白質(zhì)表面賴氨酸的ε-氨基基團(tuán)和多酚羥基之間的靜電相互作用，可能起到次要作用[5]。

圖2 蛋白質(zhì)-多酚相互作用類型Fig. 2 Types of protein-polyphenol interactions

Charlton 等[13]認(rèn)為蛋白質(zhì)與多酚的非共價作用分為3 個階段。第1 階段，疏水相互作用為主，多酚芳香環(huán)疏水面與蛋白質(zhì)脯氨酸殘基吡咯環(huán)上的多個作用位點(diǎn)可逆締合形成小的可溶性配合物；第2 階段，氫鍵為主，配合物交聯(lián)締合形成更大的不溶性復(fù)合物；第3 階段，復(fù)合物聚集生成沉淀。

蛋白質(zhì)-多酚間的非共價相互作用雖然具有可逆、低能量和不穩(wěn)定的特點(diǎn)，但卻在自然界中廣泛存在，并在食品工業(yè)中扮演著重要角色，例如：在啤酒、紅酒、茶等富含多酚的飲料中常存在渾濁現(xiàn)象，其最重要的原因之一就是蛋白質(zhì)與多酚的非共價相互作用使復(fù)合物溶解度降低[11，14]。

1.1.2 共價相互作用 蛋白質(zhì)與多酚間不可逆形式的共價作用主要包括共價鍵和離子鍵。多酚的雙酚基活性較高，可經(jīng)由酶促及分子氧氧化反應(yīng)生成鄰醌或半醌，并進(jìn)一步與多肽的氨基或巰基側(cè)鏈反應(yīng)形成共價化合物[14]。蛋白質(zhì)-多酚的共價結(jié)合主要有堿法、自由基接枝法、酶催化法3 種。堿法：在堿性（pH 9.0）及有氧條件下，多酚被氧化成半醌自由基，隨后重新排列成醌。這些更具活性的親電中間體易通過C-N 或C-S 共價鍵與蛋白質(zhì)側(cè)鏈中的親核殘基結(jié)合，生成穩(wěn)定的復(fù)合物[15]。自由基接枝法：利用抗壞血酸和過氧化氫作為引發(fā)系統(tǒng)的氧化還原對，生成羥自由基，攻擊特定蛋白質(zhì)側(cè)鏈基團(tuán)（如氨基和巰基）的氫原子，產(chǎn)生中間產(chǎn)物。然后，這些中間體與酚環(huán)上羥基的鄰位和對位發(fā)生反應(yīng)，形成蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物（蛋白質(zhì)-X-多酚）[14]。酶催化法：一般是基于對鄰苯二酚氧化酶、酪氨酸酶和過氧化物酶等酚氧化酶的利用[16]，酚酶誘導(dǎo)多酚氧化成鄰二酚，在氧氣存在下，鄰苯二酚酶（漆酶）將鄰苯二酚轉(zhuǎn)化為鄰醌，醌很容易與蛋白質(zhì)鏈中的親核氨基酸殘基發(fā)生相互作用，生成交聯(lián)蛋白質(zhì)或聚合物。對于食品工業(yè)而言，形成的共價鍵產(chǎn)物作用力強(qiáng)且穩(wěn)定[17]?，F(xiàn)根據(jù)上述內(nèi)容繪制圖2。

2 蛋白質(zhì)與多酚相互作用表征方法

當(dāng)前，結(jié)合常數(shù)、結(jié)合部位、作用力類型、構(gòu)象變化等，是表征蛋白質(zhì)-多酚相互作用的主要指標(biāo)[18]，然而由于蛋白質(zhì)-多酚相互作用的復(fù)雜性，單一技術(shù)無法提供全面的信息，一般通過多種技術(shù)聯(lián)合進(jìn)行表征[11]，主要包括光譜、熱力學(xué)、微觀結(jié)構(gòu)、分子對接模擬等，并由此探究蛋白質(zhì)與多酚的結(jié)合機(jī)制。本文對常見分析方法進(jìn)行簡單總結(jié)，如表1所示。

2.1 光譜法

熒光分析（包括熒光猝滅、同步熒光和三維熒光）是一種提供分子微環(huán)境信息的有用技術(shù)，經(jīng)常用于蛋白質(zhì)-多酚相互作用和結(jié)合親和力的研究。蛋白質(zhì)在240～280 nm 激發(fā)時，由于芳香氨基酸的存在，將在340～350 nm 范圍內(nèi)誘導(dǎo)熒光發(fā)射，而蛋白質(zhì)與猝滅分子的結(jié)合將引起熒光強(qiáng)度的降低[24]。結(jié)合Stern-Volmer、雙對數(shù)曲線等方程進(jìn)一步分析猝滅數(shù)據(jù)將獲得猝滅常數(shù)、結(jié)合親和力和結(jié)合位點(diǎn)等信息[19，25]?；诖?，熒光猝滅法已經(jīng)被廣泛用于研究包括葛根素-牛血清蛋白、花青素-溶菌酶在內(nèi)的多種蛋白質(zhì)-酚類化合物相互作用的結(jié)合常數(shù)，同時，基于測定不同溫度下[25-26]的熒光猝滅試驗(yàn)表明，在較高溫度下親和力下降是由疏水作用力介導(dǎo)的熵增、焓增過程，親和力下降則是典型的氫鍵介導(dǎo)的熵減、焓減過程。同步熒光光譜通過在固定間隔波長下同步掃描激發(fā)波長和發(fā)射波長，可以得到色氨酸和酪氨酸微環(huán)境變化信息[17]。Dai 等[27-28]利用同步熒光光譜法分別對大米谷蛋白-原花青素、沒食子酸復(fù)合物進(jìn)行了表征。三維熒光光譜峰a 用于表征酪氨酸和色氨酸殘基的微環(huán)境，峰b 則表征蛋白質(zhì)的多肽鏈骨架[17]。Al-Shabib 等[29]采用三維熒光光譜法對蘆丁和β-乳球蛋白結(jié)合的分子行為進(jìn)行了研究。

紫外-可見光譜法是通過吸收帶的位移或熒光強(qiáng)度變化，判斷蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化和復(fù)合物形成的方法。其中，蛋白質(zhì)200 nm 處的吸收光譜可反映蛋白質(zhì)多肽鏈主鏈結(jié)構(gòu)信息，280 nm 處反映芳香族氨基酸情況[30]。Wang 等[31]研究發(fā)現(xiàn)玉米醇溶蛋白-阿魏酸復(fù)合物在CaCl2溶液中，隨CaCl2濃度上升，吸收帶藍(lán)移，峰值上升，作者認(rèn)為鈣離子的加入誘導(dǎo)了發(fā)色團(tuán)局部環(huán)境極性的修飾和蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化。

圓二色譜（CD）和傅里葉紅外光譜（FTIR）可對由酚類化合物的作用引起的蛋白質(zhì)二、三級結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)行表征。CD 遠(yuǎn)紫外區(qū)（185～245 nm）是肽鍵的吸收峰范圍，反映蛋白質(zhì)主鏈的構(gòu)象。近紫外區(qū)（245～320 nm）表征中，蛋白質(zhì)的圓二色性主要受偶極取向、芳香族氨基酸、半胱氨酸（或SS 二硫鍵）殘基對偏振光的吸收以及環(huán)境因素的影響，反映蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的變化[18-19]。FTIR 光譜特征吸收帶主要有Ⅰ、Ⅱ、III 帶，酰胺Ⅰ帶的長度約為1 700～1 600 cm-1，是肽鏈中最常見的振動，主要由C=O 伸縮振動（約占80%）以及CN 伸縮和NH 彎曲振動（約占20%）引起。同CD 一樣，能給出蛋白質(zhì)的α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲等多種結(jié)構(gòu)信息，而在生理?xiàng)l件下，1 645～1 640 cm-1左右水彎曲模式的強(qiáng)烈吸收，與隨機(jī)線圈和α-螺旋帶分量重疊，使其應(yīng)用受到限制。酰胺Ⅱ帶（1 600～1 500 cm-1）則由C-N 拉伸和N-H 彎曲引起。然而，該條帶受到與氨基酸側(cè)鏈的其它特征條帶重疊的強(qiáng)烈影響，如酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。酰胺III 帶（（1 310～1 175 cm-1）主要與CN 伸展和NH 彎曲振動（各占30%）、CC 伸展（20%）和CH 彎曲（占10%）有關(guān)。雖然酰胺III 帶的強(qiáng)度較低，約比酰胺I 低5 倍，但它對蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)也非常敏感，而且不受吸水率的影響[20，32]。上述兩種方法都可以得到蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)元素比例的定量變化，區(qū)別在于，圓二色譜適合測定液體樣品的α-螺旋結(jié)構(gòu)，而傅里葉變換紅外光譜適合檢測固體和β-折疊[33]。部分研究同時采用這兩種方法分析了甘氨酸[34]、溶菌酶[35]、大豆[36]蛋白與花青素、β-乳球蛋白[37]與綠原酸、阿魏酸、EGCG 形成復(fù)合物后二級結(jié)構(gòu)的變化。

2.2 熱力學(xué)法

等溫滴定熱量法（ITC）通過檢測蛋白質(zhì)與多酚相互作用過程中引起的熱量變化來檢測結(jié)合平衡，不僅可以得到如反應(yīng)結(jié)合常數(shù)、熵變、晗變、比熱容以及化學(xué)計(jì)量數(shù)的信息，還能透過熱力學(xué)數(shù)據(jù)定性定量表征多酚與蛋白質(zhì)之間的相互作用及結(jié)構(gòu)變化[19]。Zhan 等[38]通過等溫滴定量熱法研究單寧酸及酪氨酸鈉結(jié)合的熱力學(xué)行為，發(fā)現(xiàn)隨著單寧酸的加入，酪氨酸鈉的熱穩(wěn)定增加，自由能為負(fù)值，說明反應(yīng)自發(fā)進(jìn)行，負(fù)的焓值和熵值，證實(shí)結(jié)合過程是由氫鍵和靜電力介導(dǎo)的焓驅(qū)動過程。另一方面，采用差示掃描量熱法（DSC）可研究蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物的熱誘導(dǎo)行為，通過DSC 測定配體存在時蛋白質(zhì)的熱變性溫度和展開焓的變化是表征配體結(jié)合效應(yīng)的最有效方法之一[22]。Shreyada 等[39]采用差示掃描量熱法對茶多酚-人血清蛋白復(fù)合物進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，EGCG 結(jié)合后，人血清蛋白質(zhì)的熱變性溫度升高，焓值下降，說明EGCG 與蛋白質(zhì)的結(jié)合提高了蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。

2.3 顯微法

掃描電子顯微鏡（SEM）、透射電子顯微鏡（TEM）和原子力顯微鏡（AFM）是3 種常用的顯微鏡方法，可用于分析蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物的微觀結(jié)構(gòu)。通過掃描電鏡可以得到復(fù)合物微觀形貌、表面組成分布、發(fā)光式樣結(jié)構(gòu)缺陷等信息[19]。Zhao 等[40]利用掃描電鏡觀察了多酚對酪蛋白粒子的影響，結(jié)果表明，酪蛋白-單寧酸（CS-T）結(jié)構(gòu)致密，而酪蛋白-沒食子酸（CS-G）結(jié)構(gòu)疏松，且與單一多酚相比，混合多酚（CS-T-G）的加入表現(xiàn)出更明顯的網(wǎng)狀纖維結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步采用原子力顯微鏡對其進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)CS-T、CS-G、CS-T-G 的微觀結(jié)構(gòu)表面粗糙，分子腫脹，高度明顯增加，這可能是由于分子間的疏水相互作用使蛋白質(zhì)聚集所致。與原子力顯微鏡類似，透射電子顯微鏡也可用于分析蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物的納米級表面形貌，區(qū)別在于，原子力顯微鏡用于固體樣品的分析，而透射電鏡用于溶液中復(fù)合物結(jié)構(gòu)分析[8]。Desquiret-Dumas等[41]通過透射電鏡檢測了添加白藜蘆醇后牛奶蛋白的微觀結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)復(fù)合物呈膠束狀聚集體。

2.4 分子對接

分子對接是一種計(jì)算機(jī)模擬方法。通過分子對接可以得出蛋白質(zhì)與多酚之間的結(jié)合自由能、結(jié)合位點(diǎn)、結(jié)合構(gòu)象和相互作用力等，從理論上模擬相互作用的可行性和作用情況，可實(shí)現(xiàn)最真實(shí)的反應(yīng)預(yù)測[19，42]。Zhong 等[43]利用分子對接模擬茶多酚/HP-β-CD 包合物與靶蛋白受體結(jié)合位點(diǎn)的位置和相互作用，結(jié)果表明二者的結(jié)合以氫鍵、疏水相互作用和離子鍵為主，其最佳結(jié)合能為-40.84 kJ/mol。如圖3 所示，Yu 等[44]通過分子對接研究了兒茶素與牛血清蛋白的相互作用機(jī)制，結(jié)果表明兒茶素的C-3 位置在與蛋白質(zhì)的結(jié)合中起著重要作用，其主要驅(qū)動力為氫鍵，且酯類兒茶素比非酯類兒茶素具有更高的結(jié)合親和力。

2.5 其它方法

除上述方法外，隨著技術(shù)和設(shè)備的不斷發(fā)展，基于光譜法的核磁共振波譜、光散射以及質(zhì)譜、色譜等方法也逐漸應(yīng)用到此領(lǐng)域的研究。核磁共振波譜法可以獲得蛋白質(zhì)的聚集狀態(tài)、動力學(xué)、穩(wěn)定性的信息；動態(tài)光散射（DLS）可以短時間內(nèi)得到形成的蛋白質(zhì)-酚類復(fù)合物的動力學(xué)參數(shù)及粒徑分布；X 射線小角散射可以用作研究生物大分子及其配合物包括形狀、大小、內(nèi)部結(jié)構(gòu)和域組織在內(nèi)的的低分配率結(jié)構(gòu)并提供分子折疊和組裝等過程的動力學(xué)信息；基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF）可用于分析蛋白質(zhì)-多酚綴合物的分子質(zhì)量；電噴霧電離質(zhì)譜（ESI-MS）可用于檢測、表征和評價形成的非共價蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物的穩(wěn)定性；尺寸排阻色譜法（SEC）或凝膠滲透色譜法（GPC）通常用于評估蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的變化和酚類物質(zhì)誘導(dǎo)的可溶性聚集體的形成；通過反相高效液相色譜（RP-HPLC）結(jié)合紫外檢測器，可以測定殘留酚的含量以及生成的配合物的疏水/親水特征；高效親和層析法（HPAC）可以研究不同多酚結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)的結(jié)合率；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）可用于鑒定相關(guān)加合物的結(jié)合位點(diǎn)和化學(xué)結(jié)構(gòu)等；單分子的超快動力學(xué)可用于研究蛋白質(zhì)的折疊和擴(kuò)散；熒光共振能量轉(zhuǎn)移用于體內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用構(gòu)象動力學(xué)的監(jiān)測[5，16，22]。

上述方法可以通過直接識別蛋白質(zhì)多肽鏈上的特定結(jié)合位點(diǎn)，或間接檢測兩種反應(yīng)物性質(zhì)的變化來分析蛋白質(zhì)-酚類復(fù)合物。根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康?，適當(dāng)?shù)亟Y(jié)合這些方法，將有助于明確蛋白質(zhì)-多酚相互作用。

3 蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物對蛋白質(zhì)功能特性的影響

蛋白質(zhì)和多酚相互作用會影響分子中靜電荷和分子的表面性質(zhì)等[45]，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度、乳化性、熱穩(wěn)定性、凝膠性等功能的變化。

3.1 溶解性和熱穩(wěn)定性

3.1.1 溶解度 溶解度是蛋白質(zhì)在各類基質(zhì)中發(fā)揮功能特性的先決條件。多酚對蛋白質(zhì)的溶解具有雙重作用，這取決于系統(tǒng)的性質(zhì)。如Jiang 等[46]研究綠原酸（CA）對乳清分離蛋白（WPI）和酪蛋白（CS）的影響，發(fā)現(xiàn)二者發(fā)生非共價結(jié)合后，溶解性得到了提高，這是因?yàn)镃A 與蛋白質(zhì)暴露的疏水性基團(tuán)的結(jié)合降低了表面的疏水性，同時，作為CA 羧基的酚羥基進(jìn)一步增強(qiáng)了蛋白質(zhì)表面的親水性，導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解性的增加。然而，綠原酸在pH≥8.0 的條件下，將通過非酶氧化形成醌，從而使得溶菌酶溶解度下降[47]。Ma 等[48]研究發(fā)現(xiàn)中性條件下絲素蛋白的加入，將使縮合單寧抗溶性增強(qiáng)。因此，蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物的溶解度受蛋白質(zhì)、多酚類型、pH 值等因素的綜合影響。

3.1.2 熱穩(wěn)定性 蛋白質(zhì)與多酚相結(jié)合，引入分子間及分子內(nèi)的作用力，改善蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，從而提高蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性[14]。如Zhang等[49]研究發(fā)現(xiàn)，綠豆蛋白與多酚相互作用后，隨熱處理溫度的提高，配合物結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，這說明多酚的結(jié)合提高了綠豆蛋白的熱穩(wěn)定性。近年來也有部分研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)-多酚的結(jié)合將使熱穩(wěn)性下降，例如乳鐵蛋白與多酚結(jié)合后，由于α-螺旋結(jié)構(gòu)減少，使得蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆聚集并削弱了其熱穩(wěn)定性[50]。對于多酚與蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的影響，可能受蛋白種類、結(jié)合形式及周圍環(huán)境等多種因素的共同作用。

3.2 乳化性

蛋白質(zhì)作為一種典型的食品乳化劑，可以降低界面張力，在均質(zhì)過程中促進(jìn)液滴分裂，并在界面處形成穩(wěn)定膜，從而減緩食品乳液絮凝、聚結(jié)、沉淀、脫油等現(xiàn)象的發(fā)生。然而由于某些蛋白質(zhì)水溶性低、疏水性高、分子質(zhì)量大以及靜電斥力低，不利于穩(wěn)定乳液的形成。近年來，已有大量研究表明親水性多酚與蛋白質(zhì)的結(jié)合可增加蛋白質(zhì)的不規(guī)則卷曲，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)表面親水-疏水基團(tuán)的平衡，優(yōu)化吸附行為，同時抑制它們的自聚集傾向，從而提高乳化活性[51-52]。Zhang 等[49]使用堿法將綠豆蛋白與多酚偶聯(lián)，由于多酚在蛋白質(zhì)表面形成多層吸附膜，提高了蛋白質(zhì)降低油水界面張力的能力，進(jìn)而提高了蛋白質(zhì)的乳化穩(wěn)定性，然而多酚含量進(jìn)一步增加時，其與球蛋白相互作用形成不溶性聚集體，從界面膜上解離，降低了界面膜的機(jī)械強(qiáng)度，進(jìn)而降低復(fù)合乳液的乳化穩(wěn)定性，在利用多酚提高蛋白乳化特性時需要考慮多酚的添加量。Chen 等[53]研究發(fā)現(xiàn)與單獨(dú)的豬血漿蛋白水解物相比，氧化單寧酸（OTA）或氧化綠原酸（OCA）修飾的豬血漿蛋白水解物（PPPH）具有更高的乳化穩(wěn)定性指數(shù)和更強(qiáng)的抗氧化活性，即PPPH-OTA 和PPPH-OCA 復(fù)合物可以作為高效的抗氧化劑和潛在的乳化劑在乳劑食品體系中應(yīng)用。

3.3 膠凝性質(zhì)

蛋白質(zhì)的凝膠化是使食品具有理想質(zhì)地的主要方法之一。蛋白質(zhì)與多酚發(fā)生交聯(lián)，將改善蛋白質(zhì)的凝膠特性。如Staszewski 等[54]發(fā)現(xiàn)多酚可以促進(jìn)蛋白質(zhì)分子之間的結(jié)合，且隨著茶多酚濃度的增加，β-乳球蛋白凝膠化程度及黏彈特性提高，凝膠溫度降低，凝膠時間縮短，這一發(fā)現(xiàn)與Harbourne 等[55]的研究結(jié)果類似，在酸性牛奶中添加單寧酸可增加氫鍵的含量，進(jìn)而改善蛋白質(zhì)凝膠的流變學(xué)性質(zhì)。Cao 等[56]研究發(fā)現(xiàn)綠原酸的存在雖然可以抑制蛋白質(zhì)羰基的形成，但不能阻止氧化引起的巰基和胺基的損失，并因此增強(qiáng)了氧化在構(gòu)建彈性凝膠網(wǎng)絡(luò)中的積極作用。然而，過高濃度的綠原酸會破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，屏蔽活性官能團(tuán)，從而阻止凝膠基質(zhì)中有序蛋白網(wǎng)絡(luò)的形成。這也是為什么富含酚的香料加工肉類往往表現(xiàn)出不同的質(zhì)地特性的原因。當(dāng)植物酚提物加入肉制品原料中，進(jìn)一步被氧化產(chǎn)生醌類物質(zhì)，與蛋白質(zhì)中的電子密集基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，可使凝膠性能發(fā)生改變[57]。

3.4 其它性質(zhì)

除上述性質(zhì)外，蛋白質(zhì)-多酚相互作用對蛋白質(zhì)的發(fā)泡性、油水結(jié)合性、彈性、可塑性等功能性質(zhì)的影響，也是科學(xué)家們關(guān)注的熱點(diǎn)問題。Sui等[36]發(fā)現(xiàn)，花青素可增強(qiáng)大豆蛋白的起泡性及起泡穩(wěn)定性。Ma 等[58]證實(shí)，綠茶可起到增強(qiáng)植物蛋白完整性、硬度、切割強(qiáng)度，減弱蛋白質(zhì)黏結(jié)性、彈性、持水性、氮溶解指數(shù)的作用。蛋白質(zhì)的這些功能性質(zhì)與食品質(zhì)量密切相關(guān)，下一步實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)加強(qiáng)蛋白質(zhì)及多酚生產(chǎn)、儲運(yùn)與應(yīng)用時的穩(wěn)態(tài)化研究，拓展其應(yīng)用范圍。

4 蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物對其生物活性及食品感官特性的影響

4.1 蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物對生物活性的影響

抗氧化活性是蛋白質(zhì)多酚復(fù)合物的重要性質(zhì)之一。研究表明，由于自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)受阻，蛋白質(zhì)抗氧化活性將顯著增強(qiáng)。Jiang 等[46]研究發(fā)現(xiàn)酪蛋白和乳清蛋白與綠原酸非共價結(jié)合后ABTS 自由基清除能力顯著增強(qiáng)，且具有劑量依賴性。同樣，EGCG-大豆多肽[38]，甘草酚-豌豆多肽[59]也表現(xiàn)出類似的協(xié)同抗氧化現(xiàn)象。與之相反，有研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)可以通過阻斷酚類化合物的反應(yīng)基團(tuán)從而掩蓋酚類化合物的抗氧化能力。Qie 等[60]的研究表明，β-乳球蛋白作用使EGCG 分子中活性羥基部分被占據(jù)，導(dǎo)致抗氧化活性下降，且隨二者結(jié)合強(qiáng)度增強(qiáng)，下降更加明顯。也有例外，根據(jù)Dai等[27]的研究，與大米蛋白的相互作用增強(qiáng)了原花青素的自由基清除和鐵離子還原能力。上述研究的矛盾可能與復(fù)合物種類、作用力類型不同，以及用于測定抗氧化能力的方法不同有關(guān)。

消化性是蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物的重要生物活性，了解蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物形成對二者消化性的影響具有重要的營養(yǎng)學(xué)意義。研究表明，單寧酸可通過抑制蛋白酶對酪蛋白的水解，從而使蛋白質(zhì)消化率下降[40]；綠原酸與蛋白質(zhì)結(jié)合，破壞必須氨基酸結(jié)構(gòu)，抑制胰蛋白酶和胃蛋白酶活性，導(dǎo)致蛋白質(zhì)消化率下降[61]。此外，豆莢多酚和菜豆蛋白形成難溶復(fù)合物，也可抑制蛋白質(zhì)消化[62]。相反，添加咖啡酚[63]、綠原酸[48]、花青素[64]、兒茶素[65]可使大豆蛋白、酪蛋白以及花生蛋白消化性上升，這可能是由于酚類與蛋白質(zhì)相互作用過程中，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，溶解性上升，與蛋白酶結(jié)合位點(diǎn)增多所致。另一方面，蛋白質(zhì)對多酚的生物利用度也有雙重影響。例如在面包制作前加入生咖啡酚可提高酚類化合物的可及性[66]，而乳蛋白對水果酚、咖啡酚的生物利用度產(chǎn)生負(fù)面影響[67]。目前，二者相互作用對消化率及生物利用度的影響機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步研究。

除抗氧化性和消化性外，蛋白質(zhì)-多酚相互作用對蛋白質(zhì)致敏性、酚類物質(zhì)的抗菌、抗癌、抗炎、抗肥胖以及抗糖尿病等生物活性也會產(chǎn)生影響。例如：有研究發(fā)現(xiàn)酚類化合物可能會通過降低lgE的結(jié)合能力、減輕肥大細(xì)胞/嗜堿性粒細(xì)胞脫粒以及促進(jìn)過敏原的消化吸收來降低蛋白質(zhì)食品的致敏性。蛋白質(zhì)可能掩蓋多酚的活性位點(diǎn)，降低多酚的抗菌性[8]。目前蛋白質(zhì)-多酚相互作用對二者生物活性影響的作用機(jī)理尚不明確，還需進(jìn)一步研究，這將對功能性食品和藥品的開發(fā)利用產(chǎn)生積極影響。

4.2 蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物對食品感官特性的影響

表2 蛋白質(zhì)-多酚相互作用對食品感官特性的影響Table 2 Effects of protein-polyphenol interactions on food sensory properties

蛋白質(zhì)-多酚相互作用會引起食品質(zhì)構(gòu)、顏色、口感等感官特性的改變，了解其對產(chǎn)品質(zhì)量影響，分析其作用機(jī)制對高品質(zhì)產(chǎn)品開發(fā)具有重要意義。以下重點(diǎn)歸納了已報道的常見蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物對食品感官特性的影響。

5 蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物的應(yīng)用潛力

5.1 乳劑

蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物因其優(yōu)異的乳化性能和抗氧化活性，成為了潛在的食品乳液穩(wěn)定劑。如Sui 等[36]研究發(fā)現(xiàn)，無論花青素與大豆蛋白之間存在何種相互作用，大豆蛋白的乳化能力指數(shù)、乳液穩(wěn)定性指數(shù)、ζ 電位絕對值增加與花青素濃度呈正相關(guān)，即絡(luò)合后大豆蛋白乳化性能提高，這一發(fā)現(xiàn)為花青素在植物飲料中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。乳化活性的提高歸因于改性蛋白表面疏水性的增加，而乳液穩(wěn)定性的提高是由于復(fù)合物包覆液滴之間具有更強(qiáng)的斥力。Li 等[77]發(fā)現(xiàn)單寧酸的加入可以增加玉米醇溶蛋白水解物在油水界面上的吸附，并在油顆粒周圍形成一個保護(hù)結(jié)構(gòu)，由此提高水包油納米乳液的乳化及氧化穩(wěn)定性。形成更小的液滴與更強(qiáng)的排斥相互作用是乳液物理穩(wěn)定性的重要因素，液滴表面的抗氧化多酚可進(jìn)一步提高其化學(xué)穩(wěn)定性，一些蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物，如乳鐵蛋白-綠原酸[78]，已被證實(shí)可用作抗氧化乳劑，在水包油乳液模型中保留β-胡蘿卜素。因此蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物可作為乳化液食品中的抗氧化乳化劑。

5.2 薄膜

基于蛋白質(zhì)薄膜的生物可降解、可再生和生態(tài)友好的特點(diǎn)，在開發(fā)替代食品包裝材料方面受到了極大的關(guān)注[15]。如向日葵蛋白、花生蛋白、南瓜油餅蛋白、榛子粉蛋白和蓖麻豆餅蛋白等食品工業(yè)的副產(chǎn)品已被研究作為生物材料包裝可能的植物蛋白來源。然而，由于蛋白質(zhì)固有的親水性，誘導(dǎo)與水的相互作用，引起腫脹和明顯的厚度改變，其耐水蒸氣透過性受到限制[79]。為克服這一缺點(diǎn)，通常向成膜液中加入油脂等疏水性物質(zhì)，而油脂氧化提供了參與美拉德反應(yīng)的糖基化合物，使得蛋白質(zhì)膜極易發(fā)生氧化[80]，多酚作為抗氧化劑被添加到蛋白質(zhì)薄膜中，已被證明可以降低脂質(zhì)的氧化變色[81]，如添加兒茶素可以延緩魚類肌肉蛋白膜儲藏期間的脂質(zhì)氧化，并增強(qiáng)抗菌活性[82]。Rodsamran 等[83]發(fā)現(xiàn)加入椰子水中提取的多酚物質(zhì)增加了椰子蛋白質(zhì)膜的溶解性、改善了薄膜的抗拉強(qiáng)度等機(jī)械性能以及抗氧化性能。此外，復(fù)合物制備的薄膜呈深棕色，因此可用于食品的防紫外線包裝。Girard 等[84]綜述了單寧-谷蛋白相互作用在生物聚合物薄膜方面的應(yīng)用，單寧可以通過氫鍵和疏水相互作用使面筋交聯(lián)，進(jìn)一步增加蛋白質(zhì)基質(zhì)的密度來增強(qiáng)面筋的抗氧化作用，同時提高膜的抗拉強(qiáng)度、靈活性以及降低氣體滲透性。

5.3 遞送系統(tǒng)

生物活性物質(zhì)對人體健康具有重要促進(jìn)作用，是制備功能性食品的良好原料，而受其穩(wěn)定性、長效性、共混性、靶向遞送、可控釋放及生物利用低等問題的影響，這些活性物質(zhì)健康益處的發(fā)揮及應(yīng)用場景的開發(fā)利用極為受限。蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物因具有良好的功能特性可幫助建立優(yōu)良的活性物質(zhì)遞送系統(tǒng)[85]，其整個消化遞送系統(tǒng)如圖4所示。如Wei 等[86]采用EGCG 對乳蛋白進(jìn)行共價修飾，與天然乳蛋白相比，復(fù)合物中多酚的存在提高了乳液中β-胡蘿卜素的熱穩(wěn)定性、紫外光穩(wěn)定性以及抗氧化性能，表明蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物乳狀液具有封裝、保護(hù)和提供疏水性的潛在利用價值。Liu 等[87]研究發(fā)現(xiàn)姜黃素和白藜蘆醇被包裹在由玉米醇溶蛋白-EGCG 偶聯(lián)物制備的納米顆粒中時，姜黃素和白藜蘆醇的生物可及性均得到了提高，這一發(fā)現(xiàn)為設(shè)計(jì)食品級共軛基給藥系統(tǒng)提供了依據(jù)。Lau 等[88]認(rèn)為牛血清白蛋白-單寧酸膜是水溶性和脂溶性食品源生物活性化合物微膠囊化的潛在材料?，F(xiàn)有研究基礎(chǔ)表明，以pH 值驅(qū)動、微流控、界面重構(gòu)、自組裝、靜電沉積等技術(shù)為手段，以蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物為基礎(chǔ)構(gòu)建乳液、脂質(zhì)體、納米粒、凝膠等新興食品運(yùn)載體，通過調(diào)控食品包埋運(yùn)載體的環(huán)境響應(yīng)特性和機(jī)制效應(yīng)可有效實(shí)現(xiàn)活性物質(zhì)的靶向遞送、可控釋放、高效生物轉(zhuǎn)化和吸收利用。

圖4 蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物應(yīng)用潛力Fig. 4 Application potential of protein-polyphenol complexes

圖5 蛋白質(zhì)-多酚遞送系統(tǒng)消化示意圖[16]Fig. 5 Schematic diagram of protein-polyphenol delivery system digestion[16]

6 總結(jié)

目前，人們已對蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系進(jìn)行了較深入的研究。蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物的功能與二者間的相互作用密切相關(guān)。這些相互作用是由內(nèi)部因素（蛋白質(zhì)特征、多酚類型、濃度等）和外部因素（溫度、剪切力）引起的。蛋白質(zhì)多酚復(fù)合物可以改善蛋白質(zhì)包括乳化、熱穩(wěn)定、溶解以及凝膠在內(nèi)的一系列功能特性，從而提高了其在乳液、薄膜、遞送系統(tǒng)等食品與生物醫(yī)藥領(lǐng)域方面的應(yīng)用潛力。同時，還需要深入開展不同食品來源的蛋白質(zhì)和多酚的結(jié)合差異、特性改良及作用機(jī)制研究，為個性化健康食品、功能食品及生物醫(yī)藥產(chǎn)品的研發(fā)提供理論參考及技術(shù)支撐。