石花菜醇提物成分分析

田永奇，羅海濤，丁 婷，王奇升，鄧尚貴，汪少蕓*

（1 福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院 福州350108 2 浙江海洋大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院 浙江舟山 316022）

石花菜（Gelidium amansii，G.amansii）屬于石花菜科（Gelidiaceae）石花菜屬（Gelidium）。石花菜藻體一般為紫紅色或紅黃色，在不同的海區(qū)因陽光輻照強(qiáng)度而使顏色存在一定差異。藻體直立、叢生，髙一般在10～20 cm 范圍，也可達(dá)25 cm[1]。石花菜是中國、韓國、日本等亞洲國家常見的食用海藻，具有豐富的營養(yǎng)價值?！堕}書》記載石花菜夏季可煮成凍，《南越筆記》 記載石花菜食之可去上焦浮熱，清熱解毒[2]?，F(xiàn)閩南地區(qū)將石花菜熬制成膏，用刨刀刮成絲狀，做成“四果湯”。石花菜為食藥兩用，還能作藥引，有滋陰降火、潤肺化痰、清熱解毒、化瘀散結(jié)、緩下驅(qū)蛔等功效，可清熱解毒、抗腫瘤和利腸道通便[3]。人們常用石花菜治療矽肺、體癬、甲狀腺腫大、肛門腫痛等疾病[4-5]。

石花菜含有大量碳水化合物、蛋白質(zhì)、粗纖維及多種微量元素，長期以來，石花菜的研究主要聚焦于多糖的研究，關(guān)于石花菜醇提物的研究報道較少[6-7]。實(shí)際上，石花菜醇提物廣泛的生物活性，值得研究人員深入研究。Seo 等[8]及Lee 等[9]研究發(fā)現(xiàn)石花菜醇提物能有效抑制活性氧的生成。Park等[10]和Kang 等[11]發(fā)現(xiàn)石花菜醇提物能有效降低小鼠的體質(zhì)量，具有一定的降血脂作用。林雄平等[12]、孫杰等[13]研究發(fā)現(xiàn)石花菜醇提物有較強(qiáng)的抑制真菌和細(xì)菌作用。國內(nèi)外對于石花菜醇提物的研究主要集中于生物活性方面，對其成分的研究幾乎是空白。

為彌補(bǔ)這一缺陷，挖掘石花菜的食藥兩用的價值，本試驗采用薄層色譜、液相-質(zhì)譜聯(lián)用方法分析石花菜醇提物的化學(xué)成分的豐富度；運(yùn)用通過硅膠柱、高效液相等色譜方法對其進(jìn)行分離純化，運(yùn)用氣-質(zhì)譜聯(lián)用、核磁結(jié)合文獻(xiàn)確證化合物結(jié)構(gòu)；并對部分化合物抗氧化活性進(jìn)行測定。本試驗首次系統(tǒng)研究了石花菜醇提物的化學(xué)成分，為石花菜功能食品研發(fā)及其高值化利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

300～400 目硅膠，安徽良臣硅源材料有限公司；HSGF254 薄層硅膠板，煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司；色譜純級甲醇，美國J.T.BAKER 公司；色譜純級乙腈、色譜純級甲酸，美國J.T.BAKER 公司；SIGMA-ALDRICH 氘代氯仿，上海貿(mào)易有限公司；分析純級香草醛，國藥集團(tuán)有限公司；其它分析純級化學(xué)試劑，國藥集團(tuán)有限公司。試驗用石花菜樣品于2020 年9 月采集于福建福州、漳州海域。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ5200DE 超聲清洗儀，昆山超聲儀器有限公司；RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海榮生化儀器廠；WFH-203B 三用紫外分析儀，上海精科有限公司；Primaide 半制備型高效液相色譜儀，天美科學(xué)儀器有限公司；UV-100 紫外-可見分光光度計，上海美普達(dá)儀器有限公司；Bruker AV II-600 MHz 核磁共振儀，布魯克科技有限公司；Agilent 1260 HPLC-6500 系列Q-TOF 液質(zhì)聯(lián)用儀，安捷倫科技有限公司；氣-質(zhì)譜聯(lián)用儀GC×GC HRT 4D plus，美國LECO 公司。

1.3 方法

1.3.1 石花菜醇提物的制備 稱取干燥石花菜1 kg，用粉碎機(jī)將其打碎，制成石花菜粉末，60%乙醇溶液浸泡提取3 次，過濾，合并提取液，減壓濃縮，得到石花菜醇提物20 g。用甲醇將其配制成10 mg/mL，用于后續(xù)的分析。

1.3.2 石花菜醇提物薄層色譜（TLC）分析 將石花菜醇提物分別用石油醚及乙酸乙酯萃取得到石油醚層和乙酸乙酯層；將石花菜醇提物小樣過Flash 柱分離（石油醚-乙酸乙酯體系）得到不同極性段。將上述不同極性段分別溶于合適溶劑，用V石油醚∶V乙酸乙酯=1∶1 展開，硫酸香草醛顯色劑加熱顯色。

1.3.3 石花菜醇提物液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）分析 采用Agilent 1260 HPLC-6500 系列Q-TOF 液-質(zhì)譜聯(lián)用儀對石花菜醇提物的化合物進(jìn)行分析，波長為210 nm，離子源為+ESI，質(zhì)量掃描范圍為m/z 90～820 u，色譜柱為AA12S05-1546WT C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫為35 ℃，體積流量為1.0 mL/min；進(jìn)樣量為5 μL；流動相為水（A）和乙腈（B），梯度洗脫（0～30 min，5%～100% B；31～40 min，100% B）。

1.3.4 石花菜醇提物氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）成分鑒定頂空萃取瓶中加入5 mL 石花菜醇提物樣品，再加入1 g NaCl 和10 μL 內(nèi)標(biāo)物2-辛醇（10 mg/L），蓋上瓶蓋，在轉(zhuǎn)速600 r/min 和水溫40 ℃水浴下溫育20 min，使易揮發(fā)成分更好的從溶液中揮發(fā)出來。插入固相微萃取針，萃取纖維吸附易揮發(fā)成分30 min。將萃取完成后的萃取針插入GC-MS 中分析。柱溫箱起始溫度50 ℃，保留0.2 min，然后以20 ℃/min 升溫至200 ℃，最后再以6 ℃/min 升溫至300 ℃，保留10 min。

1.3.5 石花菜醇提物的分離與純化 取石花菜醇提物浸膏進(jìn)行正相硅膠柱色譜分離，以不同石油醚-乙酸乙酯體積比（100∶1→50∶1→20∶1→10∶1→5∶1→2∶1→1∶1）混合液為溶劑進(jìn)行梯度洗脫，經(jīng)薄層色譜檢識合并得到13 個組分（標(biāo)記為Fr.1～13）。組分經(jīng)硅膠柱、半制備液相色譜等反復(fù)分離得到純化合物。

1.3.6 抗氧化活性研究 DPPH 及ABTS 自由基清除活性的測定參照文獻(xiàn)[14-15]進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

本試驗對石花菜醇提物化學(xué)成分進(jìn)行了分析，運(yùn)用GC-MS 鑒定出29 個化合物，類型包括脂肪酸、苯衍生物、生物堿、甾醇等；運(yùn)用硅膠柱、半制備液相色譜等對石花菜醇提物反復(fù)分離，得到化合物1（產(chǎn)量為176 mg）、化合物2（產(chǎn)量為13 mg）、化合物3（產(chǎn)量為4.8 mg）、化合物4（產(chǎn)量為16 mg）、化合物5（產(chǎn)量為65 mg）、化合物6（產(chǎn)量為8.8 mg）、化合物7（產(chǎn)量為9.6 mg）、化合物8（產(chǎn)量為2.4 mg）、化合物9（產(chǎn)量為21 mg）。運(yùn)用核磁、質(zhì)譜等手段分離和鑒定了它們的結(jié)構(gòu)，分別為膽甾醇（1）、1，2-二醇植烯（2）、帕格甾醇C（3）、6-羥基-膽甾-4-烯-3-酮（4）、膽甾-5-烯-7-酮（5）、膽甾-5-烯-3β，7α 二醇（6）、膽甾-5-烯-3β，7β 二醇（7）、膽甾-4-烯-6-酮（8）、3-羥乙基-2-甲基-馬來酰亞胺（9），化合物3、8、9 為新天然產(chǎn)物（圖1）。以下將詳細(xì)闡明這些化合物的鑒定過程及數(shù)據(jù)。

圖1 從石花菜醇提物中鑒定的化合物Fig. 1 Compounds identified from the ethanol extract of G.amansii

2.1 石花菜醇提物化學(xué)成分豐富度分析

運(yùn)用TLC 和LC-MS 檢測石花菜醇提物化學(xué)成分的豐富度。經(jīng)萃取分級后，石花菜醇提物石油醚層和乙酸乙酸乙酯層均具有較多的代謝產(chǎn)物，且類型較為相近（圖2a）。醇提物經(jīng)Flash 柱分離，展現(xiàn)出更為豐富的代謝產(chǎn)物，硫酸香草醛顯色呈紫色、藍(lán)色、黃色，提示結(jié)構(gòu)中可能含有有機(jī)酸、甾體、萜類等成分。石花菜醇提物按1.3.3 節(jié)的色譜及質(zhì)譜條件進(jìn)行分析，得到其HPLC 圖及在正離子模式下的BPC 圖（見圖2b）。石花菜醇提物雖在小極性段（30 min 后）有豐富的代謝產(chǎn)物，但在質(zhì)譜BPC 圖上沒有對應(yīng)的峰出現(xiàn)，這提示了其不容易電離，很可能是甾體類成分。孫杰等[13]也以氯仿-濃硫酸試驗推測石花菜醇提物中可能含有甾體皂甙類成分。

圖2 石花菜醇提物的豐富度檢測Fig. 2 Detection of the richness of the ethanol extract of G.amansii

2.2 石花菜醇提物GC-MS 分析

將石花菜醇提物通過氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析得到圖3。不同的峰對應(yīng)著不同的化合物，以80%匹配度，篩選出29 個化合物，羅列得到表1。由表1 中可知，石花菜醇提物主要由脂肪酸、甾醇、生物堿、萜類等組成，其中含量較高的為棕櫚酸（46.76%）、棕櫚酸乙酯（13.82%）、膽甾醇（7.20%）、膽甾-4，6-二烯（4.99%）。石花菜中的甾醇主要以膽甾醇及其類似物為主，分別為膽甾醇、膽甾-4，6-二烯、膽甾-5-烯-7-酮、膽甾-4，6-二烯-3-酮、3β-（Benzoyloxy）-膽甾-5-烯-7β-醇。紅藻中富含膽甾醇，國偉杰等[16]、夏歡等[17]、馮強(qiáng)等[18]從鴨毛藻、江蘺、壇紫菜3 種紅藻中也發(fā)現(xiàn)了膽甾醇及其衍生物。

表1 GC-MS 鑒定的石花菜醇提物中的化合物Table 1 Compounds in the ethanol extract of G.amansii identified by GC-MS

圖3 石花菜醇提物的GC-MS 圖Fig. 3 GC-MS diagram of the ethanol extract of G.amansii

2.3 石花菜醇提物化學(xué)成分精細(xì)分離及結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色粉末，極性較小，硫酸香草醛顯色為紅色；EIMS m/z 386.35 [M]+；核磁數(shù)據(jù)顯示結(jié)構(gòu)中有1 個雙鍵信號，剩余為典型的甾醇信號，和標(biāo)準(zhǔn)品及文獻(xiàn) [16] 比對鑒定為膽甾醇（Cholesterol），具體核磁數(shù)據(jù)如下：1H-NMR（600 MHz，CDCl3）δH5.35（1H，m，H-6），3.54（1H，m，H-3），1.02（3H，s，H3-19），0.96（3H，d，J=6.5 Hz，H3-21），0.88（3H，d，J=6.6 Hz，H3-26），0.87（3H，d，J=6.6 Hz，H3-27），0.68（3H，s，H3-18）；13C-NMR（150 MHz，CDCl3）δC139.7（C-5），122.6（CH-6），71.9（CH-3），56.7（CH-14），56.0（CH-17），50.0（CH-9），42.3（C-13），39.7（CH2-12），39.7（CH2-24），38.1（CH2-4），37.0（CH2-1），36.6（C-10），36.2（CH2-22），36.1（CH-20），31.9（CH2-7），31.9（CH-8），28.3（CH2-16），28.0（CH-25），27.8（CH2-2），24.3（CH2-15），24.3（CH2-23），23.0（CH3-27），22.7（CH3-26），21.0（CH2-11），19.3（CH3-19），18.8（CH3-21），11.8（CH3-18）。

化合物2：無色油狀物；ESIMS m/z 313.30[M+H]+；1H NMR（500 MHz，CDCl3）δH5.15（1H，s，H-17），4.99（1H，s，H-17），4.22（1H，J=6.8，2.7 Hz，H-2），3.72（1H，d，J=10.0 Hz，H-1a），3.55（1H，dd，J=10.0，6.4 Hz，H-1b），2.36（1H，br s，OH），2.15～1.90（2H，m），1.04～1.55（20H，m），0.86～0.89（12H，m，H3-16，18，19，20），13C-NMR（125 MHz，CDCl3）δC148.7/148.6（C-3），110.5（CH2-17），75.1/75.0（CH-2），65.7（CH2-1），39.4（CH2-14），37.4（CH2-8），37.3（CH2-10），37.3（CH2-12），36.9（CH2-6），33.0（CH2-4），32.80（CH-11），32.7（CH-7），28.0（CH-15），25.5（CH2-5），24.8（CH2-13），24.5（CH2-9），22.7（CH3-20），22.6（CH3-16），19.8（CH3-19），19.70/19.71（CH3-18）。數(shù)據(jù)中C-2，C-3，C-18，C-10 碳譜都出現(xiàn)2 組不同的化學(xué)位移，推測為2 位羥基的異構(gòu)造成的，以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19-20]對照，鑒定化合物2 為1，2-二醇植烯（Phytene-1，2-diol），且該化合物為差向異構(gòu)體的混合物（2 位羥基）。

化合物3：無色油狀物；HREIMS m/z 400.3341 [M]+；核磁譜上明顯可以看出1 個醛基信號[δC189.7，δH9.97，CH-6]，1 個雙鍵信號（δC168.9，C-5；139.4，C-6），剩余是甾醇的典型信號（圖4），具體數(shù)據(jù)如下：1H-NMR（500 MHz，CDCl3）δH9.97（1H，s，H-6），3.71（1H，m，H-3），3.47（1H，ddd，J=2.0，4.5，14.5 Hz，H-4a），2.55（1H，dt，J=4.0，11.0 Hz，H-8），2.05（1H，m，H-4b），0.95-1.96（22H，m），0.93（3H，s，H3-19），0.92（3H，d，J=6.5 Hz，H3-21），0.87（3H，d，J=6.5 Hz，H3-26），0.85（3H，d，J=6.5 Hz，H3-27），0.73（3H，s，H3-18）；13C-NMR（125 MHz，CDCl3）δC189.7（CH-6），168.9（C-5），139.3（C-7），70.9（CH-3），60.2（CH-9），55.4（CH-17），54.5（CH-14），46.3（C-10），46.2（CH-8），45.2（C-13），39.8（CH2-12），39.5（CH2-24），36.2（CH2-1），36.1（CH2-22），35.6（CH-20），33.9（CH2-4），31.3（CH2-2），28.5（CH2-16），28.0（CH-25），26.6（CH2-15），23.9（CH2-23），22.8（CH3-26），22.5（CH3-27），20.7（CH2-11），18.9（CH3-21），15.6（CH3-19），12.5（CH3-18）。該化合物為帕格甾醇A（Parguesterol A）的類似物，2008 年由Wei 等[21]合成，未命名，本文將其命名為帕格甾醇C（Parguesterol C），為新天然產(chǎn)物。帕格甾醇類化合物顯示出很好的抗分枝結(jié)核桿菌活性[22]。

圖4 帕格甾醇C 的結(jié)構(gòu)鑒定圖Fig. 4 Structural characterization of parguesterol C

化合物4：白色粉末；EIMS m/z 400.33 [M]+；核磁譜上顯示結(jié)構(gòu)中存在1 個酮羰基（δC200.5，C-3），1 個雙鍵信號（δC126.3，δH 5.81，CH-4；δC168.6，C-5），1 個連氧的次甲基信號（δC73.2，δH4.34，CH-6），剩余為典型的甾醇信號，具體數(shù)據(jù)如下：1H-NMR（500 MHz，CDCl3）δH5.82（1H，s，H-4），4.36（1H，t，J=4.4 Hz，H-6），2.52（1H，m，H-2a），2.40（1H，dt，J=16.5，3.0 Hz，H-2b），1.46-2.06（13H，m），1.34（3H，s，H3-19），1.00-1.33（11H，m），0.92（3H，d，J=6.6 Hz，H3-21），0.88（3H，d，J=6.6 Hz，H3-26），0.87（3H，d，J=6.6 Hz，H3-27），0.75（3H，s，H3-18）；13C-NMR（125 MHz，CDCl3）δC200.5（C-3），168.6（C-5），126.3（CH-4），73.2（CH-6），56.1（CH-14），55.9（CH-17），53.6（CH-9），42.5（C-13），39.6（CH2-12），39.5（CH2-24），38.5（CH2-7），38.0（C-10），37.1（CH2-1），36.1（CH2-22），35.7（CH-20），34.2（CH2-2），29.7（CH-8），28.1（CH2-16），28.0（CH-25），24.1（CH2-23），23.8（CH2-15），22.8（CH3-26），22.6（CH3-27），21.0（CH2-11），19.5（CH3-19），18.7（CH3-21），12.2（CH3-18）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[23-25]對照，故鑒定化合物4 為6-羥基-膽甾-4-烯-3-酮（6-Hydroxy-cholesterol-4-en-3-one）。

化合物5：白色粉末；EIMS m/z 400.33 [M]+；核磁譜上顯示結(jié)構(gòu)中存在1 個雙鍵信號（δC136.0，δH5.69，CH-6；δC165.6，C-5），1 個連氧的次甲基信號（δC73.2，δH3.67，CH-3），剩余為典型的甾醇信號，具體數(shù)據(jù)如下：1H-NMR（500 MHz，CDCl3）δH5.69（1H，s，H-6），3.67（1H，m，J=1.1 Hz，H-3），2.51（1H，m），2.40（2H，m），2.03（1H，m），1.94（3H，m），1.46-1.66（6H，m），1.23-1.40（9H，m），1.20（3H，s，H3-19），1.00-1.17（7H，m），0.92（3H，d，J=6.6 Hz，H3-21），0.88（3H，d，J=6.6 Hz，H3-26），0.86（3H，d，J=6.6 Hz，H3-27），0.68（3H，s，H3-18）；13C-NMR（125 MHz，CDCl3）δC202.6（C-7），165.6（C-5），126.0（CH-6），70.3（CH-3），54.8（CH-17），50.0（CH-14），49.9（CH-9），45.4（CH-8），43.1（C-13），41.8（CH2-12），39.5（CH2-24），38.7（CH2-4），38.3（C-10），36.4（CH2-1），36.2（CH2-22），35.7（CH-20），31.2（CH2-2），28.5（CH2-16），28.0（CH-25），26.3（CH2-15），23.8（CH2-23），22.8（CH3-26），22.5（CH3-27），21.2（CH2-11），18.9（CH3-21），17.3（CH3-19），12.0（CH3-18）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[26]對照，故鑒定化合物5 為膽甾-5-烯-7-酮（Cholest-5-en-7-one）。

化合物6、7 是一對差向異構(gòu)體，TLC 板顯色呈藍(lán)色，它們極性非常接近。波譜學(xué)特征也非常接近（圖5）。化合物6：白色固體；EIMS m/z 402.35[M]+，核磁譜上顯示結(jié)構(gòu)中存在1 個雙鍵信號（δC123.9，δH5.63，CH-6；δC146.3，C-5），1 個連氧的次甲基信號（δC65.4，δH3.87，CH-7），剩余為典型的甾醇信號，具體數(shù)據(jù)如下：1H-NMR（600 MHz，CDCl3）δH5.63（1H，dd，J=5.3，1.8 Hz，H-6），3.87（1H，m，H-7β），3.62（1H，m，H-3），2.36（1H，ddd，J=13.1，5.0，1.7 Hz，H-4a），2.30（1H，td，J=13.1，2.3 Hz，H-4b），2.02（1H，dt，J=12.9，3.9 Hz），1.85-1.94（3H，m），1.72（1H，m），1.37-1.58（10H，m），1.29-1.36（5H，m），1.10-1.25（11H，m），1.01（3H，s，H3-19），0.94（3H，d，J=6.7 Hz，H3-21），0.89（3H，d，J=6.6 Hz，H3-26），0.87（3H，d，J=6.6 Hz，H3-27），0.71（3H，s，H-18）；13C-NMR（150 MHz，CDCl3）δC146.3（C-5），123.9（CH-6），71.3（CH-3），65.4（CH-7），55.9（CH-17），49.4（CH-14），42.3（CH-9），42.2（C-13），42.0（CH2-4），39.5（CH2-12），39.2（CH2-24），37.5（CH-8），37.4（C-10），37.0（CH2-1），36.2（CH2-22），35.8（CH-20），31.4（CH2-2），28.3（CH2-16），28.0（CH-25），24.3（CH2-15），23.7（CH2-23），22.8（CH3-26），22.6（CH3-27），20.7（CH2-11），18.8（CH3-19），18.3（CH3-21），11.6（CH3-18）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[27-28]對照，故鑒定化合物6 為膽甾-5-烯-3β，7α 二醇（Cholest-5-ene-3β，7α diol）。

化合物7：白色固體；EIMS m/z 402.35 [M]+，核磁譜與化合物6 類似，最大的區(qū)別在于化合物7 中6 位氫往高場移動，由原來的δH5.63（dd），轉(zhuǎn)變?yōu)棣腍5.32（t）（圖5）。綜合判斷這是C-7 位手性變化所導(dǎo)致的，數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[28]對照，故鑒定化合物7 為膽甾-5-烯-3β，7β 二醇（Cholest-5-ene-3β，7β diol），具體數(shù)據(jù)如下：1H-NMR（600 MHz，CDCl3）δH5.32（1H，t，J=2.1 Hz，H-6），3.87（1H，dt，J=8.0，2.3 Hz，H-7α），3.58（1H，m，H-3），2.35（1H，m），2.27（1H，m），2.04（1H，m），1.08（3H，s，H-19），0 94（3H，d，J=6.5 Hz，H3-21），0.89（3H，d，J=6.6 Hz，H3-26），0.87（3H，d，J=6.6 Hz，H3-27），0.71（3H，s，H-18）；13C-NMR（150 MHz，CDCl3）δC143.5（C-5），125.4（CH-6），73.4（CH-7），71.4（CH-3），56.0（CH-14），55.5（CH-17），48.3（CH-9），42.9（C-13），41.7（CH2-4），40.9（CH-8），39.6（CH2-12），39.5（CH2-24），36.9（CH2-1），36.4（C-10），36.2（CH2-22），35.7（CH-20），31.6（CH2-2），28.6（CH2-16），28.0（CH-25），26.4（CH2-15），23.8（CH2-23），22.8（CH3-26），22.6（CH3-27），21.1（CH2-11），19.2（CH3-21），18.8（CH3-19），11.8（CH3-18）。

化合物8：白色固體；EIMS m/z 386.35 [M]+，核磁譜上顯示結(jié)構(gòu)中存在1 個碳基信號（δC203.2，C-6）和1 個雙鍵信號（δC146.9，C-5；δC132.6，δH6.17，C-4），剩余為典型的甾醇信號，具體數(shù)據(jù)如下：1H-NMR（600 MHz，CDCl3）δH6.17（1H，t，J=2.2 Hz，H-4），4.26（1H，m，H-3），2.57（1H，dd，J=16.0，3.7 Hz，H-7a），2.08（2H，m），1.02（3H，s，H-19），0 93（3H，d，J=6.5 Hz，H3-21），0.89（3H，d，J=6.6 Hz，H3-26），0.87（3H，d，J=6.6 Hz，H3-27），0.71（3H，s，H-18）；13C-NMR（150 MHz，CDCl3）δC203.2（C-6），146.9（C-5），132.6（CH-4），67.3（CH-3），56.7（CH-14），56.0（CH-17），51.3（CH-9），46.4（CH2-7），42.6（C-13），39.5（CH2-24），39.4（CH2-12），38.4（C-10），36.1（CH2-22），35.7（CH-20），34.8（CH2-1），34.2（CH-8），28.4（CH2-2），28.0（CH2-16），28.0（CH-25），24.0（CH2-15），23.8（CH2-23），22.8（CH3-26），22.6（CH3-27），20.8（CH2-11），19.8（CH3-21），18.7（CH3-19），12.0（CH3-18）。根據(jù)這些數(shù)據(jù)及相關(guān)文獻(xiàn)[29]，化合物8 被確證為膽甾-4-烯-6-酮（Cholest-4-ene-6-one），為新天然產(chǎn)物。

化合物9：黃色粉末；HRESIMS m/z 333.1059[2M+Na]+，推測分子式為：C7H9NO3；核磁譜（圖7）給出2 個甲基信號、1 個次甲基信號、1 個烯碳信號、1 個羰基信號、1 個連氧的碳信號、2 個酮羰基信號，具體核磁數(shù)據(jù)如下：1H-NMR（500 MHz，CD3OD）δH4.80（1H，q，J=6.8 Hz，H-5），2.06（3H，s，H3-7），1.42（3H，d，J=6.8 Hz，H3-6）；13C-NMR（125 MHz，CD3OD）δC174.7（C-1），139.3（C-2），143.7（C-3），173.8（C-4），63.4（CH-5），8.6（CH3-6），22.5（CH3-7）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[30]對照，故鑒定化合物8 為3-羥乙基-2-甲基-馬來酰亞胺 【2-（1-Hydroxyethyl）-3-methylmaleimide】。

圖7 3-羥乙基-2-甲基-馬來酰亞胺結(jié)構(gòu)鑒定圖Fig. 7 Structural characterization of 2-（1-Hydroxyethyl）-3-methylmaleimide

2.4 部分化合物的抗氧化活性

由圖8a 可知，質(zhì)量濃度為0～2.0 mg/mL 時，不同化合物清除DPPH 自由基能力隨質(zhì)量濃度增大而增大。由圖8b 可知，化合物7 清除DPPH 自由基的IC50值最小，為0.18 mg/mL?；衔?、4、5、6，IC50值分別 為1.13，0.78，0.24 mg/mL 和0.20 mg/mL。VC 的IC50值為0.08 mg/mL，化合物7 清除DPPH 自由基能力接近VC。綜上，化合物7 清除DPPH 自由基能力最好，化合物1 清除DPPH 自由基能力最弱。

圖8 不同化合物清除DPPH 自由基能力及IC50 值Fig. 8 DPPH free radical scavenging ability and IC50 value of different compounds

由圖9a 可以看出，質(zhì)量濃度為0～30 μg/mL時，純化合物隨著質(zhì)量濃度增加，清除ABTS 自由基能力增強(qiáng)。由圖9b 可知，VC 的IC50值為1.3 μg/mL，化合物1、4、5、6、7 清除ABTS 自由基能力均低于VC，化合物中清除ABTS+自由基的IC50值大小順序為：7＜6＜5＜4＜1，表明化合物7 清除ABTS 自由基能力最好，其IC50值為12.2 μg/mL。

圖9 不同化合物清除ABTS 自由基能力及IC50 值Fig. 9 ABTS free radical scavenging ability and IC50 value of different compounds

3 結(jié)論

為了彌補(bǔ)石花菜醇提物化學(xué)成分的研究空白，本文綜合運(yùn)用TLC、HPLC、LC-MS、GC-MS、NMR 等多種色譜波譜手段，系統(tǒng)鑒定了其化學(xué)成分。TLC、LC-MS 分析表明石花菜醇提物中含有豐富的次級代謝產(chǎn)物，且很可能是甾醇類成分。運(yùn)用GC-MS 從石花菜乙醇浸膏中鑒定到29 個化合物，其中5 個為甾醇類化合物。經(jīng)正向硅膠柱和HPLC 分離，NMR 鑒定，得到9 個單體化合物，分別為膽甾醇（1）、1，2-二醇植烯（2）、帕格甾醇C（3）、6-羥基-膽甾-4-烯-3-酮（4）、膽甾-5-烯-7-酮（5）、膽甾-5-烯-3β，7α 二醇（6）、膽甾-5-烯-3β，7β 二醇（7）、膽甾-4-烯-6-酮（8）、3-羥乙基-2-甲基-馬來酰亞胺（9）；化合物7 清除DPPH 自由基和ABTS 自由基能力最好，其IC50值分別為180 μg/mL 和12.2 μg/mL。本文首次系統(tǒng)研究了石花菜的化學(xué)成分，化合物3、8、9 為新天然產(chǎn)物；部分甾醇類化合物展現(xiàn)出一定的抗氧化活性。本試驗的研究結(jié)論明晰了石花菜醇提物活性的物質(zhì)基礎(chǔ)，為石花菜功能食品的研發(fā)及高值化利用提供了依據(jù)。