烏衣紅曲黃酒年份特征揮發(fā)性物質指紋圖譜分析

蘇 昊，李維新*，林曉姿，何志剛，梁璋成，任香蕓

（1 福建省農業(yè)科學院農產品加工研究所 福州350003 2 農業(yè)農村部亞熱帶特色果蔬菌加工重點實驗室 福州350003 3 福建省農產品（食品）加工重點實驗室 福州 350003）

黃酒的風味在黃酒質量評價中雖占有重要地位，但其風味的形成受酒中的各種化學成分的影響。同時因黃酒中的化學成分非常復雜，通過感官評定或個別成分的分析來評價其風味及質量品質，易受人為等外界因素的影響[1-2]。雖然個別成分的分析不能反映黃酒的整體品質，但是GC-MS 指紋圖譜技術的應用可以解決這些問題[3]，使黃酒的品質評價更加的準確，并可為黃酒基酒的酒齡鑒別提供支撐。酒類指紋圖譜是借用中藥指紋圖譜的發(fā)展和應用而來的，最先發(fā)展起來的是基于高效液相色譜（HPLC）和氣相色譜（GC）技術的酒類化學成分色譜指紋圖譜[4]。朱潘煒等[5]以乙酸乙酯、3-甲基丁醇、β-苯乙醇等5 種特征成分峰為指紋峰，利用平均值法構建1～10 年陳浙江古越龍山紹興黃酒基酒的標準指紋圖譜用于黃酒的品質和酒齡分析，并證實揮發(fā)性物質指紋圖譜的可靠性。

福建烏衣紅曲黃酒是具有地區(qū)特色的黃酒品種，是以糯米、秈米、粳米等為原料，以烏衣紅曲為糖化發(fā)酵劑釀造而成的低酒度、高營養(yǎng)的飲料酒[6]。烏衣紅曲黃酒的陳釀時間是其品質的重要指標[7]，其對黃酒品質的影響最終體現在風味上[8]。因釀造用曲和釀造工藝的不同導致烏衣紅曲黃酒的揮發(fā)性物質差異，進而影響黃酒的風味品質[9]。目前對烏衣紅曲黃酒的酒齡和品質的評定尚無統(tǒng)一的標準，也無揮發(fā)性指紋圖譜的相關研究報道。建立一套科學的產品質量評價方法，是促進紅曲黃酒行業(yè)健康蓬勃發(fā)展的當務之急。烏衣紅曲黃酒揮發(fā)性物質指紋圖譜和感官評價作為檢測和反映烏衣黃酒品質的重要手段[10]，是其質量評價體系的重要組成部分。該指紋圖譜的建立，有利于全程監(jiān)控黃酒產品質量，為福建烏衣紅曲黃酒基酒產品陳釀質量的評價提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酒樣為陳釀時間為2，4，5，6，7，8，9，10，12 年和15 年的烏衣紅曲黃酒基酒，每年份各取3 個批次，由福建山里陳酒業(yè)有限公司提供。

標準品：2-辛醇，sigma 公司。

1.2 儀器

島津GCMS-TQ8040 三重四極桿型氣相色譜質譜聯用儀，日本島津公司；SPME 手動進樣裝置，50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取頭，美國SUPELCO 公司；頂空瓶15 mL，Agilent 公司；恒溫水浴鍋，上海市實驗儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 萃取頭老化 將萃取頭于270 ℃下老化1 h，至無干擾峰出現。

1.3.2 色譜條件 采用色譜柱HP-INNOWAX（30 m×0.25 μm×0.25 μm）。初始柱溫40 ℃保持3 min，后以6 ℃/min 升溫至100 ℃，以10 ℃/min 升溫至230 ℃，保持7 min。進樣口溫度均為250 ℃，不分流模式進樣。

接口溫度280 ℃，EI 電子原，掃描范圍（m/z）33～550 u，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，采集方式為全掃描模式。

1.3.3 樣品分析 稱取1 g 酒樣，吸取5 μL 質量濃度為0.5 mg/mL 2-辛醇溶液，加入15 mL 頂空瓶中，加蓋后放入恒溫水浴鍋中50 ℃預熱10 min，將老化后的萃取頭插入頂空瓶，推出纖維頭，使其暴露于樣品液面上方，放入恒溫水浴鍋中50℃吸附50 min。當樣品萃取時間結束時，立即將萃取頭插入氣相色譜儀的進樣口，熱解吸5 min 后啟動氣相色譜儀采集數據。

1.4 揮發(fā)性物質的定性和定量

采用氣相氣質色譜儀器配置的NIST14 揮發(fā)性物質數據庫對化合物進行定性。以2-辛醇為內標，對黃酒中會揮發(fā)性化合物含量進行定量。

1.5 揮發(fā)性物質指紋圖譜的建立與驗證

以基酒中已定性的揮發(fā)性物質為研究對象，采用正交偏最小二乘判別分析及Spearman 相關性分析方法，篩選出與陳釀時間密切相關的關鍵揮發(fā)性物質，再以這些關鍵揮發(fā)性物質作為特征指紋峰構建年份特征揮發(fā)性物質對照指紋圖譜，這些揮發(fā)性物質檢測方法穩(wěn)定性參照指紋圖譜構建的要求進行方法學考察[11]；指紋圖譜的可靠性驗證，是通過第2 次在原基酒廠取樣，以年份特征揮發(fā)性物質為指標，比較基酒樣品與對照指紋圖譜的相似程度，并加以評估。

1.6 數據分析

基酒相似度計算采用夾角余弦法[5]，使用EXCEL 2019 軟件完成；圖譜繪制采用Origin 2018軟件；主成分分析采用SIMCA14 軟件；Spearman相關性分析采用R 語言。

2 結果與分析

2.1 福建烏衣紅曲黃酒基酒揮發(fā)性物質解析

揮發(fā)性成分是影響黃酒風味的重要因素，它的組成、氣味閾值和相互作用對酒體整體的風味感知具有重要影響。隨著陳釀時間的延長，紅曲黃酒的揮發(fā)性成分也相應發(fā)生變化，某些具有特征意義的揮發(fā)性成分，與陳釀年份具有一定的相關性。采用HS-SPME-GC-MS 技術，對收集到的不同年份烏衣紅曲黃酒樣品分別進行檢測，對其中的122 種揮發(fā)性成分進行了定性和定量，其中包含酯類49 種、醇類17 種、酸類11 種、醛類8 種、烷烴類6 種、苯環(huán)芳香烴類10 種（表1）。

表1 烏衣紅曲黃酒基酒中揮發(fā)性成分Table 1 Volatile components in red koji yellow rice wine base wine

2.2 烏衣紅曲黃酒基酒年份特征揮發(fā)性風味物質的確定

基于不同年份烏衣紅曲黃酒揮發(fā)性風味物質的分析結果，對其中檢測到的122 種揮發(fā)性風味物質，采用OPLS-DA 分析，不同陳釀時間不同批次的分析歸類結果（P＜0.05）見圖1。根據聚類分析，將不同年份的烏衣紅曲黃酒基酒劃分為3 類：2～4 年陳，5～9 年陳，10～15 年陳，表明烏衣紅曲黃酒基酒陳陳釀可以分為3 個較為穩(wěn)定的階段，在某一階段內，其揮發(fā)性物質種類和含量變化雖較小，但不同階段則變化較大。

圖1 OPLS-DA 主成分分析Fig. 1 Principal component analysis of OPLS-DA

對上述檢測的揮發(fā)性風味物質，繼續(xù)采用OPLS-DA 分析進行變量投影重要性預測VIP 值解析（圖2），初篩出對風味起較大貢獻的風味物質（VIP 值＞1）共45 種。進一步采用Spearman 相關性分析法解析烏衣紅曲黃酒基酒年份特征揮發(fā)性風味物質（P＜0.05 且相關性|r|＞0.5）共20 種，結果見圖3，其中與陳釀時間呈正相關關系的成分有8種：N-苯甲酰甘氨酸乙酯、6-庚烯酸乙酯、乙酸-2-苯乙酯、3-（2-呋喃基）-2-丙烯醛、苯乙酸乙酯、2-十五烷基-1，3-二氧雜環(huán)庚烷、苯甲醛、苯并噻唑；與陳釀時間呈負相關關系的成分有12 種：庚酸乙酯、辛酸、2-呋喃甲醇、辛酸乙酯、1-辛烯-3-醇、1-辛醇、α-亞乙基-苯乙醛、2-乙氧基四氫-2H-吡喃、二氫-5-甲基-2（3H）-呋喃酮、丙酸-2-甲基-3-羥基-2，2，4-三甲基戊酯、十九酸乙酯、2，4-二叔丁基苯酚。

圖2 OPLS-DA 分析變量投影重要性預測值（VIP 值）Fig. 2 Predicted value of projection importance of OPLS DA analysis variables（VIP value）

2.3 烏衣紅曲黃酒年份基酒相似度分析

以篩選出的與年份基酒年份緊密相關的20種揮發(fā)性物質為對象，計算不同年份基酒之間的相似度（表2）。結果表明，2，4 年陳烏衣紅曲黃酒與2，4 年陳烏衣紅曲黃酒間的相似度在1.000～0.9720 之間，與5，6，7，8，9 年陳黃酒間的相似度在0.9622～0.9420 之間，與10，12，15 年陳黃酒間的相似度在0.9369～0.9342 之間。同樣，結合前面分析的結果，同一陳釀區(qū)間的相似度較高，不同陳釀區(qū)間相似度則較低，因而根據年份特征性揮發(fā)性成分的相似度，也可將烏衣紅曲黃酒基酒劃分為2～4，5～9 年和10～15 年3 個不同陳釀階段，分別命名為：青陳酒、中陳酒和老陳酒。

2.4 烏衣紅曲黃酒年份基酒揮發(fā)性物質特征指紋圖譜構建

以年份相關性|r|＞0.5 成分為特征峰，保留時間為X 軸，吸收峰強度為Y 軸，繪制青、中、老不同陳釀區(qū)間的紅曲黃酒年份特征揮發(fā)性物質對照指紋圖譜（圖4），圖譜中特征峰吸收強度分別為2～4，5～9，10～15 年特征峰強度的平均值，其余非特征揮發(fā)性物質峰未在圖譜中顯示。其中，在青陳酒中，N-苯甲酰甘氨酸乙酯未發(fā)現，隨著陳釀時間的延長，在5～15 年陳釀階段含量逐漸增加，其指紋圖譜應由除N-苯甲酰甘氨酸乙酯外的19 種特征揮發(fā)性物質組成；在老陳酒中，2-呋喃甲醇、α-亞乙基-苯乙醛和2，4-二叔丁基苯酚在2～4 年陳釀階段含量最高，隨著陳釀時間的延長逐漸減少，在10～15 年基酒中未檢測到，因而其指紋圖譜由除以上3 種成分外的17 種特征揮發(fā)性物質構成；中陳酒特征揮發(fā)性物質組成介于青、老陳酒之間，其指紋圖譜由對照圖譜中標示的20 種揮發(fā)性物質作為特征峰構建而成。

圖4 青、中、老陳紅曲黃酒對照指紋圖譜Fig. 4 Comparison fingerprints of youth age，middle age and old age Hongqu Huangjiu

2.5 揮發(fā)性物質特征指紋圖譜驗證

為驗證建立的指紋圖譜的可靠性，距第1 次取樣間隔約2 年后從基酒原廠再次取樣，樣品陳釀時間分別為6 年和11 年?；邳S酒基酒年份特征成分的OPLS-DA 分析（圖5）及基酒與對照圖譜相似度比較（表3）的結果顯示，6 年基酒與中陳酒（5～9 年）更接近，11 年基酒與老陳酒（10～15年）更接近，結果得到了互相驗證，表明所構建的揮發(fā)性物質特征指紋圖譜能夠較好地區(qū)分不同陳釀時期的烏衣紅曲黃酒基酒。

圖5 基于基酒年份特征成分的OPLS-DA 分析Fig. 5 OPLS-DA analysis based on the age characteristics of base liquor

表3 6 年和11 年陳基酒與對照圖譜的相似度Table 3 Similarity between 6-year and 11-year old base liquor with comparison fingerprints

3 討論與結論

黃酒在其生命期內，品質也會隨著貯藏時間的延長在不斷地發(fā)生變化。新釀制出來的基酒通過“陳化”可以有效促進酒精分子之間以及酒精分子與水分子之間的締合，促進醇與酸之間的酯化，使酒香味馥郁，口味甘順、柔和[12]。黃酒的揮發(fā)性物質成分是決定黃酒質量的重要因素之一，影響黃酒的感官評價質量與風格確定。黃酒的風味主要來源于原料、發(fā)酵過程中的微生物活動與陳化等[18-19]。酒類香氣成分分析技術日益成熟且研究較多，常見的預處理技術有液液萃取、蒸餾萃取、動態(tài)或靜態(tài)頂空法、固相萃取和固相微萃取等[20-21]。其中固相微萃取結合頂空分析建立起來的樣品預處理技術集采樣、萃取、濃縮于一體，綠色環(huán)保、方便快捷、成本低、重現性好，已成為酒類揮發(fā)性成分分析主流的技術之一[22-23]。

在本研究中烏衣紅曲黃酒基酒中揮發(fā)性物質以酯類為主，其含量達到約一半，其次是醇類，其中篩選出的年份特征成分中除了1-辛烯-3-醇、苯甲醛等在黃酒風味物質的報道中已有報道[13-15]，還有一些少有報道6-庚烯酸乙酯、乙酸-2-乙基苯酯、3-（2-呋喃基）-2-丙烯醛等成分，可見不同產地、釀造工藝生產的黃酒[16-17]，對黃酒成分尤其微量成分的組成影響較大，而這些成分隨著陳釀時間的變遷而消長，其成為陳釀品質的重要標志之一。N-苯甲酰甘氨酸乙酯在2～4 年陳酒中未發(fā)現，5～9 年酒中開始出現，10～15 年酒中顯著增加，而2-呋喃甲醇、α-亞乙基-苯乙醛和2，4-二叔丁基苯酚則隨著陳釀時間的延長逐漸減少，在10 年及以上基酒中未檢出，因而成為烏衣紅曲黃酒基酒陳釀時間的重要特征成分。

指紋圖譜能從整體反映出酒類產品的質量，故近年來對酒類指紋圖譜技術研究越來越廣泛，因釀造用曲和工藝的不同導致紅曲黃酒的揮發(fā)性物質差異，從而使不同的紅曲黃酒的指紋圖譜不同。本研究中構建的烏衣紅曲黃酒基酒特征揮發(fā)性物質指紋圖譜，將2～15 年陳黃酒區(qū)分為3 個陳釀階段，這可能是由于烏衣紅曲黃酒基酒的陳釀是一個循序漸進的過程，陳釀間隔期短，其中的揮發(fā)性物質變化并不顯著，導致區(qū)間內基酒間相似度高，不足以將各年份嚴格地區(qū)分開來，并準確的判定基酒的陳釀時間。因此，將烏衣紅曲黃酒基酒根據陳釀的不同階段加以區(qū)分，而不是某一年，更為貼近黃酒生產中的實際情況。

本研究基于篩選年份特征揮發(fā)性物質，構建烏衣紅曲黃酒基酒年份基酒指紋圖譜，可用于山里陳紅曲黃酒陳釀期判別，該結果為烏衣紅曲黃酒基酒的質量控制以及年份鑒別提供了技術參考。