低溫等離子體耦合微酸性電解水對三文魚的保鮮作用

朱文慧，譚桂芝，2，步 營，李學鵬，勵建榮*，崔方超，檀茜倩，孟玉瓊，馬 睿，郭曉華

（1 渤海大學食品科學與工程學院 遼寧省高校重大科技平臺“食品貯藏加工及質(zhì)量安全控制工程技術研究中心”遼寧錦州121013 2 海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心 大連工業(yè)大學 遼寧大連116034 3 青海大學 西寧810016 4 山東美佳集團有限公司 山東日照 276800）

三文魚被譽為“水中珍品”，營養(yǎng)豐富，在世界各地備受歡迎。然而，在加工、貯藏運輸及銷售過程中新鮮三文魚很容易被微生物污染，從而導致其新鮮度變差，營養(yǎng)價值降低或腐敗變質(zhì)[1]。微生物增殖是造成三文魚腐敗變質(zhì)的主要原因，因此迫切需要找到能有效滅活三文魚體的微生物，并能保持其良好品質(zhì)的方法。熱處理雖可以殺死微生物，但會對食品的物理化學性質(zhì)及感官品質(zhì)產(chǎn)生不良影響；而高壓二氧化碳、超聲波、冷等離子體、電子束輻照和脈沖電場技術等非熱食品加工技術既可以滅活微生物，延長保質(zhì)期，又能最大程度上保持肉的良好品質(zhì)屬性[2]。

近年來，低溫等離子體（Cold plasma，CP）已成為國內(nèi)外食品冷殺菌的研究熱點。低溫等離子體中產(chǎn)生的多種活性物質(zhì)，如羥自由基、過氧化氫、活性氧和活性氮等是導致微生物失活的主要原因[3]。然而，低溫等離子體技術不能對產(chǎn)品表面進行均勻處理[4]，產(chǎn)生的活性物質(zhì)也會加速脂質(zhì)氧化[5]。低溫等離子體裝置通過在水表面或水面下進行等離子體放電，就可以制出等離子體活化水（Plasma activated water，PAW），當CP 與不同液體介質(zhì)相互作用時，會發(fā)生各種復雜的化學反應，導致反應物種的產(chǎn)生，處理溶液的pH 值、氧化還原電位和電導率等物理化學性質(zhì)會發(fā)生巨大變化[6]。與傳統(tǒng)的低溫等離子技術相比，PAW 具有靈活、安全等優(yōu)點，能對產(chǎn)品表面進行均勻殺菌處理，目前已廣泛應用于肉、新鮮農(nóng)產(chǎn)品和魚等產(chǎn)品中[7]。微酸性電解水（Slightly acidic electrolyzed water，SAEW）是通過電解氯化鈉溶液或稀鹽酸溶液而產(chǎn)生的一種新型的消毒劑[8]，具有強殺菌能力，低成本，方便制取等特點，被廣泛用于雞蛋、肉類、水果和水產(chǎn)品等的殺菌[9]。于福田等[10]研究發(fā)現(xiàn)有效氯質(zhì)量濃度為35.00 mg/L、浸泡時間為22 min、料液比為1∶6 時，微酸性電解水對新鮮羅非魚片的殺菌率為（81.59±0.04）%，且對品質(zhì)的影響最小。另一些研究表明，微酸性電解水可以促進脂肪氧化和蛋白質(zhì)氧化，這可能與其所含的活性物質(zhì)（HOCl，Cl2和OCl-）的濃度有關[11]。對于非熱殺菌技術，如何在保證高殺菌效果的前提下，有效防止產(chǎn)品的脂肪氧化和蛋白氧化，是迫切需要解決的問題。

本研究以菌落總數(shù)為指標，通過單因素實驗和響應面試驗優(yōu)化低溫等離子體耦合微酸性電解水對三文魚的最佳殺菌條件，并對比研究等離子體活化水、微酸性電解水及低溫等離子體耦合微酸性電解水對三文魚冷藏期間的抑菌效果、脂肪氧化、蛋白質(zhì)氧化及品質(zhì)變化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三文魚，山東日照鼎好食品有限公司。通過冷鏈運輸至實驗室于-80 ℃冷藏。平板計數(shù)瓊脂，青島海博生物技術有限公司。氯化鈉、硫代硫酸鈉、丙二醛、碘化鉀、三氯乙酸、無水乙醇等試劑均為分析純級。

1.2 儀器與設備

TS-APJ03 低溫噴射等離子體，深圳市東信高科自動化設備有限公司；微酸性電解水發(fā)生器，丹麥DCW 公司；PHS-3C pH 計，上海儀電科學儀器股份有限公司；K9840 海能凱氏定氮，海能未來技術集團股份有限公司；CR-400 色差計，日本Konica-Minol-ta 公司；UV-2550 紫外-可見分光光度計，日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 單因素條件對殺菌效果的影響 室溫條件下，以菌落總數(shù)為指標，以功率（160，220，300，380 W），活化時間（1，3，5，7 min），料液比（1∶2，1∶4，1∶6，1∶8），浸泡時間（5，10，15，20，25 min），有效氯質(zhì)量濃度（10，20，30，40，50 mg/L）為單因素，考察不同條件下低溫等離子體耦合微酸性電解水對殺菌效果的影響。

1.3.2 響應面法優(yōu)化低溫等離子體耦合微酸性電解水殺菌效果的試驗設計 利用Design-Expert 10.0 軟件上的Box-Behnken 功能模塊，在單因素實驗結果的基礎上進行了響應面優(yōu)化設計，以活化時間、低溫等離子體功率、浸泡時間為因變量，菌落總數(shù)為響應值，試驗因素和水平如表1 中所示。

表1 Box-Behnken 試驗因素水平Table 1 Box-Behnken test factors and levels

1.3.3 低溫等離子體耦合微酸性電解水（PASW）的制備和樣品處理

1.3.3.1 PAW 的制備 大氣壓等離子體射流在冰水浴中活化蒸餾水（400 mL）。

1.3.3.2 SAEW 的制備 由DCW 微酸性電解水發(fā)生器制備，其中SAEW 的pH 值、氧化還原電位和有效氯質(zhì)量濃度分別為6.09，810 mV 和50 mg/L。

1.3.3.3 PASW 的制備 大氣壓等離子體射流在冰水浴中活化SAEW（400 mL）。

1.3.3.4 樣品前處理 將三文魚浸沒在含有不同溶液（PAW、SAEW、PASW）的無菌袋中，置于4 ℃冰箱貯藏，分別記為PAW、SAEW、PASW 處理組，PASW 處理組按照響應面最優(yōu)結果處理，SAEW與PAW 的處理條件與PASW 一致，新鮮三文魚設為對照組。

1.3.4 菌落總數(shù)測定 按照GB 4789.2-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》中的方法測定。

1.3.5 pH 值測定 參考GB 5009.237-2016 《食品安全國家標準 食品pH 值的測定》中的方法測定。

1.3.6 TVB-N 測定 參考GB 5009.228-2016《食品安全國家標準 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》中的方法測定，樣品中TVB-N 含量（X）按照下式計算[12]。

式中，V1——樣品消耗鹽酸體積，mL；V2——空白消耗鹽酸體積，mL；m——樣品質(zhì)量，g；c——鹽酸濃度，mol/L。

1.3.7 TBARS 值和羰基測定 TBARS 值和羰基含量參考Zhu 等[13]的方法測定。

1.3.8 色差測定 取適量的魚片用色差計進行檢測并讀取L*、a*、b*值。每組做6 次平行。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理與分析 數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 軟件進行顯著性分析，多重比較采用Duncan 檢驗。響應面模型擬合采用Design-Expert 10.0 軟件統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果與分析

以浸泡時間20 min、料液比1∶6、有效氯質(zhì)量濃度50.00 mg/L 和功率300 W 為條件進行實驗，研究了不同活化時間處理對菌落總數(shù)（Total viable count，TVC）的影響。如圖1a 所示，隨著活化時間的延長，TVC 逐漸減 少，3 min 和5 min 時TVC 差異不大，在5～7 min 時變化比較平緩。因此，選取5 min 為0 水平進行響應面試驗。

圖1 活化時間（a）、功率（b）、浸泡時間（c）、有效氯質(zhì)量濃度（d）、料液比（e）對三文魚菌落總數(shù)的影響Fig. 1 Effects of activation time（a），power（b），soak time（c），available chlorine concentration（d），solid-liquid ratio（e）on total viable counts of salmon

以料液比1∶6、有效氯質(zhì)量濃度50.00 mg/L、浸泡時間20 min，活化時間5 min 進行實驗，研究不同低溫等離子體活化功率影響結果。如圖1b 所示，經(jīng)不同功率處理的三文魚的TVC 明顯少于對照組，且隨功率的增加，TVC 顯著降低，當功率為300 W 時，TVC 減少了0.93 lg（CFU/g），當功率為380 W 時，TVC 減少了1.00 lg（CFU/g）。因此，選取300 W 為0 水平進行響應面試驗。

以料液比1∶6、功率300 W、有效氯質(zhì)量濃度50.00 mg/L、活化時間5 min 進行實驗，研究不同浸泡時間影響。結果如圖1c 所示，隨著浸泡時間的延長TVC 逐漸減少，在0～5 min TVC 的量明顯降低，而在5～20 min 變化比較平緩，在浸泡時間為20 min 時，細菌總數(shù)減少了0.95 lg（CFU/g），在浸泡時間為25 min 時，TVC 減少了1.17 lg（CFU/g）。因此，20 min 為0 水平進行響應面試驗。

以料液比1∶6、浸泡時間20 min、功率300 W、活化時間5 min 進行實驗，研究不同有效氯質(zhì)量濃度的影響。結果如圖1d 所示，隨著有效氯質(zhì)量濃度的不斷增加，魚肉中的TVC 不斷減少，在有效氯質(zhì)量濃度為10～40 mg/L 時TVC 變化不明顯，可能是因為在等離子體的激發(fā)過程中對微酸性電解水中的活性物質(zhì)產(chǎn)生了一定的消減。有研究表明隨著微酸性電解水有效氯濃度的增大，會對魚肉的顏色產(chǎn)生一定的影響。在本試驗中有效氯質(zhì)量濃度為50.00 mg/L 時，未發(fā)現(xiàn)低溫等離子體活化微酸性電解水對三文魚顏色有影響，因而選擇有效氯質(zhì)量濃度為50.00 mg/L 進行后續(xù)試驗。

以活化時間5 min、功率300 W、浸泡時間20 min、有效氯質(zhì)量濃度50.00 mg/L 進行實驗，研究不同料液比的影響。如圖1e 所示，隨料液比量的不斷增大，魚肉的TVC 逐漸減少（P<0.05），當料液比為1∶6 和1∶8 時，TVC 分別減少了0.67 lg（CFU/g）和0.98 lg（CFU/g）。隨著料液比的增大，魚片可充分地與活化水接觸，從而有助于減菌，而比例增大會對導致三文魚產(chǎn)生一定的褪色，因而選擇1∶6 進行后續(xù)試驗。

2.2 Box-Behnken 試驗結果分析

2.2.1 模型建立與方差分析 低溫等離子體耦合微酸性電解水殺菌Box-Behnken 試驗結果如表2所示，對表2 中的數(shù)據(jù)進行分析，得到二次多項式擬回歸方程：Y=2.91 -0.09A+0.01B -0.1C -0.03AB+0.07AC+0.01BC+0.15A2-0.04B2+0.13C2（其中，Y：殺菌對數(shù)值，A：功率，B：浸泡時間，C：活化時間）。在響應面建模、擬合和優(yōu)化過程中所產(chǎn)生的誤差會影響模型的可行性，當模型中的P<0.05，并且失擬項值>0.05 時證明該模型可行[14]。由表3 可知，試驗模型極顯著（P<0.01），失擬項P 值為0.173>0.05，不顯著，說明該模型與實際情況擬合良好；模型的R2=0.97，R2adj=0.97，證明該模型擬合程度良好，適用于優(yōu)化菌落總數(shù)殺菌效果[15]。

表2 Box-Behnken 試驗設計結果Table 2 Box-Behnken test design and results

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance for regression models

由表3 方差分析可知，各因素對菌落總數(shù)指標的影響順序依次為：功率（A）>活化時間（C）>浸泡時間（B）。一次項A、C，二次項A2、C2，交互項AC 對菌落總數(shù)影響極顯著（P<0.01），交互項AB對菌落總數(shù)影響顯著（P<0.05）；而浸泡時間（B）、浸泡時間與活化時間（BC）之間的交互性對其響應值影響不顯著（P>0.05）。

2.2.2 交互作用分析 圖2 為低溫等離子體耦合微酸性電解水功率、浸泡時間、活化時間的兩兩交互項對試驗結果的影響圖。各因素及其交互作用對TVC 含量的影響可以通過響應面及其等高線圖直觀的反映出來，響應面圖的曲線越陡峭，說明這3 個因素的相互作用就越顯著[16]。由圖2 可知，功率與浸泡時間（AB）、功率與活化時間（BC）響應面坡度較為陡峭，說明功率與浸泡時間、功率與活化時間之間交互作用大，對試驗結果的影響顯著；浸泡時間與活化時間的響應面坡度較為平緩，說明浸泡時間與活化時間之間的交互作用對試驗結果的影響不顯著。

圖2 試驗因素間的交互作用對三文魚表面減菌效果的影響Fig. 2 Effect of interaction of experimental factors on the decontamination of salmon surface

2.2.3 回歸模型最優(yōu)解的確定與驗證 通過響應面模型優(yōu)化低溫等離子體耦合微酸性電解水殺菌條件，預測得最優(yōu)參數(shù)為：功率318 W，浸泡時間19.33 min，活化時間5.44 min。結合實際將模型最優(yōu)解修正為：功率320 W，浸泡時間20 min，活化時間5 min。在此條件下經(jīng)過3 次平行試驗，試驗結果與預測值基本一致（見表4），說明采用響應面優(yōu)化得到的低溫等離子體耦合微酸性電解水處理三文魚魚片的殺菌工藝參數(shù)準確可靠，具有可行性。

表4 最優(yōu)條件下的預測值及實際值Table 4 The predicted and experimental values under the optimum process conditions

2.3 低溫等離子體耦合微酸性電解水處理對三文魚貯藏期間TVC 的影響

PASW 處理對三文魚貯藏期間TVC 的影響如圖3 所示。由圖3 可知，隨著貯藏時間延長，各處理組間三文魚TVC 持續(xù)上升；在貯藏初期，對照組的TVC 值為（3.35±0.20）lg（CFU/g），說明樣品較新鮮；在貯藏過程中，其它3 組樣品TVC 值的增長速度明顯比對照組的慢；在第6 天，對照組的菌落總數(shù)含量超過了菌落總數(shù)的上限值6.00 lg（CFU/g）。一般來說，TVC 值為5.00 lg（CFU/g）表示海鮮產(chǎn)品的新鮮度閾值，TVC 值低于6.00 lg（CFU/g）表示質(zhì)量可接受[17]。此 外，PASW、SAEW 和PAW 組樣品在第8 天的菌落總數(shù)為（7.09±0.04）、（7.47±0.09）lg（CFU/g）和（6.98±0.06）lg（CFU/g），說明PAW、PASW 能夠顯著延緩對三文魚微生物的生長，這可能是由于低溫等離子體產(chǎn)生了豐富的活性物質(zhì)ROS 或RNS，如H2O2。

圖3 不同處理方式下三文魚菌落總數(shù)隨貯藏時間的變化Fig. 3 Changes of the total baterial account of salmon with storage time under different treatments

2.4 低溫等離子體耦合微酸性電解水處理對三文魚貯藏期間pH 值的影響

pH 值的變化被認為是反映貯藏過程中理化性質(zhì)的一個指標[18]。由圖4 可知，所有組別樣品的pH 值變化趨勢基本一致，均呈先降后升的趨勢，且各組之間pH 值差異不顯著，樣品pH 值降低的原因可能與CO2的溶解或乳酸的積累有關；而pH 值升高則與蛋白質(zhì)等含氮類物質(zhì)在微生物和內(nèi)源酶的作用下被分解為胺、三甲胺等揮發(fā)性堿有關[19-20]。

圖4 不同處理方式下三文魚pH 值隨貯藏時間的變化Fig. 4 Changes of pH value of salmon with storage time under different treatments

2.5 低溫等離子體耦合微酸性電解水處理對三文魚貯藏期間TVB-N 的影響

揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）被用作檢測魚類新鮮度的重要指標，魚死后腐敗細菌的迅速生長導致含氮化合物分解代謝產(chǎn)生氨從而使TVB-N 值迅速增加[21]。圖5 所示，隨著貯藏時間的延長，4組三文魚魚片的TVB-N 含量值均呈上升的趨勢。4 ℃貯藏期間，PAW、SAEW、PASW 組三文魚TVB-N 含量明顯低于對照組，說明PAW、SAEW、PASW 處理能延緩魚肉腐敗變質(zhì)的程度。貯藏第0 天時，與對照組相比，PAW、SAEW、PASW 組三文魚TVB-N 含量分別下降3.62，4.39，4.32 mg/100 g，說明貯藏初期PAW、SAEW、PASW 對腐敗細菌及內(nèi)源酶有一定的抑制作用。有研究表明海水魚TVB-N 的上限值為30 mg/100 g[22]，貯藏至第8 天時，對照、PAW、SAEW、PASW 組TVB-N 值分別為33.36，28.47，29.15，28.23 mg/100 g。其中，對照組的三文魚已超過食用限度值，達到了腐敗程度。結果表明，PAW、SAEW、PASW 可以顯著減少三文魚片中TVB-N 的形成，從而提高了三文魚的新鮮程度。

圖5 不同處理方式下三文魚TVB-N 含量隨貯藏時間的變化Fig. 5 Changes of TVB-N content in salmon with storage time under different treatments

2.6 低溫等離子體耦合微酸性電解水處理對三文魚貯藏期間TBARS 值和羰基含量的影響

脂質(zhì)氧化是由氫的提取觸發(fā)的一種自由基鏈式反應，過氧化氫是第一個穩(wěn)定的產(chǎn)物，然而過氧化氫分解后可能產(chǎn)生二級脂質(zhì)氧化產(chǎn)物，如脂質(zhì)過氧自由基的各種加成、重排或錯位反應形成的醛或酮[23]。因此，充分評估脂質(zhì)氧化并測定脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物顯得尤為重要。硫代巴比妥酸反應產(chǎn)物可被用作為衡量脂質(zhì)過氧化的指標。低溫等離子體產(chǎn)生的硝酸鹽及亞硝酸鹽（RONS）可能在豬肉、牛肉、雞肉和海鮮等表面引發(fā)脂質(zhì)氧化[24]。三文魚在貯藏期間TBARS 含量的變化如圖6a 所示，隨著貯藏期的延長，各組的TBARS 值均呈現(xiàn)上升趨勢。PAW 組與SAEW 組的TBARS 值明顯高于對照組，而經(jīng)PASW 處理后的三文魚TBARS 值最低。TBARS 值為8 mg MDA/kg 通常被認為是魚類可接受的極限，有研究表明，TBARS 在大于3 mg MDA/kg 時就有明顯的酸味[25]。上述數(shù)據(jù)表明，將三文魚浸泡在PAW、SAEW 和PASW 中，對三文魚的TBARS 值產(chǎn)生較小的影響，而且這些值都在可接受的范圍內(nèi)。

圖6 不同處理條件下三文魚TBARS（a）和羰基（b）含量隨貯藏時間的變化Fig. 6 Changes of TBARS（a）and carbonyl content（b）of salmon with storage time under different treatments

在蛋白質(zhì)的變性過程中，蛋白質(zhì)主鏈通過α-酰胺化和β-剪斷以及脯氨酸、精氨酸、賴氨酸和蘇氨酸等氨基酸側鏈的直接或間接氧化而發(fā)生斷裂，從而形成羰基衍生物，羰基含量的增加與蛋白氧化呈正相關[26]。不同處理組的三文魚魚片羰基含量的變化如圖6b 所示，隨著貯藏期的延長，羰基含量逐漸增加，對照組的羰基含量從第0 天的0.21 nmol/mg 增加到第8 天的1.00 nmol/mg。在貯藏初期，各處理組的羰基含量無明顯差異（P>0.05），隨著時間的延長，可觀察到經(jīng)PAW 與SAEW 處理的三文魚蛋白氧化程度與對照接近或略高于對照組，而經(jīng)PASW 處理過的三文魚羰基含量顯著低于對照，說明PASW 組能抑制蛋白的氧化。

2.7 低溫等離子體耦合微酸性電解水處理對三文魚貯藏期間色差的影響

色澤是評價肉制品品質(zhì)的重要指標之一，它直接影響消費者對其的接受程度[27-28]。其中，L*表示亮暗，+表示偏亮，-表示偏暗；a*表示紅綠，+表示偏紅，-表示偏綠；b*表示黃藍，+表示偏黃，-表示偏藍。經(jīng)不同殺菌處理的三文魚在4 ℃貯藏后L*、a*、b*值變化如表5 所示，各處理組之間L*、a*值逐漸增大，而b*沒有明顯的變化；此外，在貯藏期的前4 d，各處理組之間的L*、a*、b*值差異不顯著，至貯藏第8 天，其差異顯著。其中，經(jīng)過PASW處理的L*值為49.45，較對照組（44.42）、PAW 組（48.00）、SAEW 組（46.58）均要大，說明亮度高。經(jīng)過PASW 處理的a*值為8.85，較對照組（6.57）、PAW 組（7.46）、SAEW 組（7.01）均要大，說明三文魚片顏色偏紅，并且PASW 組紅度值最高，顏色最紅。

表5 不同處理方式對三文魚色澤隨貯藏時間的變化Table 5 Changes of the color of salmon with storage time under different treatments

肌紅蛋白（Mb）存在于肌肉纖維細胞中，是三文魚體內(nèi)最重要的色素物質(zhì)。一般來說，三文魚肌肉的鮮紅色主要與氧合肌紅蛋白（OxyMb）有關。在長時間的低溫冷凍保存下，OxyMb 極易氧化為棕色的高鐵肌紅蛋白（MetMb）[29]，從而導致三文魚的褐變，大大影響其商業(yè)價值。三文魚富含不飽和脂肪酸，因此其在儲存過程中特別是隨著溫度的波動容易發(fā)生脂肪氧化[30]。有學者提出脂質(zhì)氧化和肌紅蛋白氧化是相互促進的：一方面鐵可以在肌紅蛋白變性后從血紅素中釋放出來，促進脂質(zhì)氧化；另一方面，脂質(zhì)氧化的中間產(chǎn)物（如自由基）可以破壞肌肉中的色素，使其易于褐變[31]。在本試驗中低溫等離子體耦合微酸性電解水組三文魚顏色最好，也說明低溫等離子體耦合微酸性電解水緩解了Mb 氧化，減少了棕色的高鐵肌紅蛋白生成，這也與低溫等離子體耦合微酸性電解水可以緩解脂肪氧化和蛋白氧化的結果相對應。

3 結論

本研究以菌落總數(shù)為指標，結合單因素實驗和響應面試驗，確定功率320 W、浸泡時間20 min、活化時間5 min、有效氯質(zhì)量濃度為50 mg/mL、料液比為1∶6 為最佳殺菌條件。經(jīng)等離子體活化水、微酸性電解水及低溫等離子體耦合微酸性電解水處理后，研究不同預處理方式對三文魚冷藏期間抑菌效果、脂肪氧化及品質(zhì)的影響。結果表明，隨著貯藏時間延長，各組樣品微生物數(shù)量、pH值、TVB-N 值均升高，與其它處理組相比，低溫等離子體耦合微酸性電解水處理能明顯降低三文魚魚片脂肪與蛋白氧化，綜合考慮，低溫等離子體聯(lián)合微酸性電解水處理組保鮮效果最佳。較對照組而言，低溫等離子體耦合微酸性電解水處理可使三文魚魚片冷藏貨架期延長2 d。因此，低溫等離子體耦合微酸性電解水的前處理方式可有效延長三文魚的貨架期，為水產(chǎn)品冷藏保鮮工業(yè)化應用提供新思路。