茉莉酸在L-谷氨酸誘導(dǎo)的番茄果實(shí)抗性中的作用

楊佳麗，韓 笑，王騰飛，狄建兵，劉亞平，王 愈*

（1 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 山西晉中030801 2 山西省果蔬貯藏保鮮與加工技術(shù)創(chuàng)新中心 山西晉中 030801）

鏈格孢菌（Alternaria alternata）是番茄果實(shí)發(fā)生病害的重要病原菌之一，由其引起的黑斑病不僅造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，而且產(chǎn)生的毒素會(huì)對(duì)人類健康產(chǎn)生巨大的威脅[1]。鑒于當(dāng)前廣泛使用化學(xué)殺菌劑所帶來(lái)的生態(tài)環(huán)境和食品安全問(wèn)題，迫切需要尋求更為安全、環(huán)保、有效的替代產(chǎn)品和技術(shù)[2-4]。目前，利用生物源或非生物源激發(fā)子通過(guò)誘導(dǎo)植物產(chǎn)生或提高自身抗性防御病害已成為研究熱點(diǎn)[5-8]。生物防治（如拮抗細(xì)菌、酵母菌和真菌等）作為近年來(lái)控制果蔬病害較為有潛力的新途徑，雖已有商業(yè)化產(chǎn)品上市，但仍有其不可忽視的局限性。相較于生物類激發(fā)子，化學(xué)類激發(fā)子實(shí)施簡(jiǎn)單、易操作，受周圍環(huán)境因素影響較小，防效穩(wěn)定，同時(shí)生產(chǎn)和貯藏成本也較低。常見(jiàn)的化學(xué)激發(fā)子有水楊酸及其類似物苯丙噻重氮、茉莉酸及茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MeJA）、殼聚糖、幾丁質(zhì)、碳酸氫鹽類、可溶性鈣鹽、β-氨基丁酸和γ-氨基丁酸等。前期研究發(fā)現(xiàn)L-谷氨酸（以下簡(jiǎn)稱“谷氨酸”）可以作為一種化學(xué)激發(fā)子，有效抑制果實(shí)上多種采后病原菌的侵染，且綠色安全，容易獲得，生產(chǎn)使用成本低，具有廣闊的商業(yè)應(yīng)用前景，然而有關(guān)谷氨酸的誘抗機(jī)制研究較為有限[9-11]。近期有報(bào)道顯示，谷氨酸可能通過(guò)介入宿主的植物激素信號(hào)路徑來(lái)調(diào)控其對(duì)病原菌的抗性反應(yīng)[12]。Goto 等[13]的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析表明，擬南芥根部經(jīng)谷氨酸處理后會(huì)誘導(dǎo)水楊酸路徑相關(guān)的基因上調(diào)表達(dá)。Kadotani 等[14]利用谷氨酸處理水稻根部后提高了葉片組織對(duì)稻瘟病的抗性，其抗性機(jī)制可能部分依賴于水楊酸信號(hào)路徑。為進(jìn)一步解析谷氨酸的誘抗機(jī)制，本文探討谷氨酸對(duì)另一種植物激素——茉莉酸相關(guān)路徑的影響。

植物在與病原菌的長(zhǎng)期斗爭(zhēng)和協(xié)同進(jìn)化中形成了一系列行之有效的防御體系，這一過(guò)程受到復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，其中植物激素在該信號(hào)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，且不同的植物與病原菌互作會(huì)啟動(dòng)或依賴不同的信號(hào)路徑[15-18]。植物激素在植物體內(nèi)發(fā)揮其生理作用的機(jī)制較為復(fù)雜，從其合成、運(yùn)輸、與膜受體結(jié)合，到完成信號(hào)感知傳遞，進(jìn)而誘導(dǎo)特定的基因表達(dá)和生理反應(yīng)，是一個(gè)連續(xù)且互為影響的過(guò)程[19]。茉莉酸作為植物激素中一類重要的信號(hào)分子，不僅調(diào)節(jié)植物多個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，而且參與植物對(duì)生物和非生物脅迫的逆境響應(yīng)[20-21]。一般來(lái)說(shuō)，茉莉酸在植物體內(nèi)的合成始于亞麻酸，而后經(jīng)過(guò)脂氧合酶（Lipoxygenase，LOX）、丙二烯氧化物合酶（Allene oxide synthase，AOS）、丙二烯氧化物環(huán)化酶（Allene oxide cyclase，AOC）和12-氧植物二烯酸還原酶（12-oxo-Phytodieenoic acid reductase，OPR）催化和3 個(gè)β-氧化反應(yīng)而形成[22]。當(dāng)植物遭受到外界脅迫時(shí)，其體內(nèi)的茉莉酸水平迅速上升，并在茉莉酸氨基酸合成酶（Jasmonate amino acid synthase，JAR）的催化下與異亮氨酸（Ile）結(jié)合生成茉莉酸的活性形式——JA-Ile 復(fù)合物，再與冠菌素不敏感蛋白1（Coronatine insensitive 1，COI1）COI1 結(jié)合，誘導(dǎo)JAZ（Jasmonate ZIM-domain，JAZ）蛋白釋放所結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子MYC2，最終啟動(dòng)茉莉酸響應(yīng)基因的應(yīng)答[23-24]。然而，植物在應(yīng)對(duì)病原菌侵染時(shí)，其體內(nèi)的茉莉酸路徑是提高宿主對(duì)病原菌的抗性還是敏感性，這與具體的植物和病原菌互作體系密切相關(guān)。本文在前期研究基礎(chǔ)上，以番茄果實(shí)與鏈格孢菌互作為研究對(duì)象，從轉(zhuǎn)錄水平上分析谷氨酸對(duì)茉莉酸合成路徑和信號(hào)路徑的影響，解析谷氨酸響應(yīng)病原菌侵染的抗性機(jī)制，為谷氨酸的商業(yè)化應(yīng)用提供理論依據(jù)，也為采后病害控制策略提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試的“千禧”番茄果實(shí)（Solanum lycopersicum L.cv.Qianxi）采摘于紅熟階段，選取無(wú)機(jī)械傷口及病蟲(chóng)害侵染的果實(shí)備用；鏈格孢菌（CGMCC3.4578）購(gòu)于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。

L-谷氨酸，茉莉酸甲酯，上海阿拉丁生化科技股份有 限公司；RNAiso Plus、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒，日本Takara Bio 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

NanoDrop l000 超微量分光光度計(jì)、ABI QuantStudio 6 Flex 熒光定量PCR 儀，美國(guó)Thermo Fisher 公司；Thermal Cycler PCR儀，美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 病原菌孢子懸浮液制備 將鏈格孢菌接種到PDA 培養(yǎng)基上后置于25 ℃的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)7 d 后刮取適量孢子于無(wú)菌水中，利用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)方法將孢子懸浮液調(diào)整至供試濃度。

1.3.2 果實(shí)處理 番茄果實(shí)在0.1%次氯酸鈉溶液中處理2 min，用水沖洗干凈后備用。參考Yang等[9]和Guo 等[25]的方法，將果實(shí)隨機(jī)分為2 組，分別浸泡于水（對(duì)照組）和0.1 mg/mL 谷氨酸溶液10 min，取出晾干后再將每組果實(shí)分別置入含有0 mmol/L 和0.1 mmol/L MeJA 的密閉容器中，處理24 h 后在果實(shí)赤道位置穿刺并形成大小深度統(tǒng)一的傷口（直徑3 mm，深2 mm），隨即接種10 μL 鏈格孢菌孢子懸浮液（104CFU/mL）。將處理完成的番茄貯藏于恒溫恒濕箱內(nèi)（25 ℃，相對(duì)濕度約90%），定期觀察記錄果實(shí)的發(fā)病率。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)25 個(gè)番茄果實(shí)。

1.3.3 茉莉酸路徑相關(guān)基因表達(dá)量的測(cè)定 按照

1.3.2 節(jié)所述處理方法，果實(shí)經(jīng)水（對(duì)照組）或0.1 mg/mL 谷氨酸溶液處理后，將其貯藏于恒溫恒濕條件下，分別于12，24 h 和48 h 用手術(shù)刀切取番茄表皮組織，而后用液氮立即將組織樣品冷凍處理，并放置于-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

參考Yang 等[9]的方法，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法測(cè)定茉莉酸路徑相關(guān)基因（SlLOX1、SlAOS2、SlAOC1、SlCOI1、SlJAZ1、SlMYC2、SlPI-II）的表達(dá)量。番茄果實(shí)組織總RNA 的提取參照RNAiso Plus 試劑盒具體步驟說(shuō)明進(jìn)行，并利用超微量分光光度計(jì)確定樣品RNA 的質(zhì)量和濃度，而后借助PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒合成cDNA，保存在-20 ℃冰箱中備用。利用ABI QuantStudio 6 Flex 熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR 反應(yīng)，其反應(yīng)條件參照SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒進(jìn)行，并稍作修改：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，然后在60 ℃條件下復(fù)性30 s，往復(fù)循環(huán)42 次；溶解曲線的條件為95 ℃15 s，60℃1 min，95 ℃15 s。

Primer Premier 7.0 軟件（PREMIER Biosoft International）用于設(shè)計(jì)擴(kuò)增目的基因引物，引物序列如表1 所示。以SlActin 為內(nèi)參基因，基因的相對(duì)表達(dá)量利用2-ΔΔCt方法計(jì)算[26]。

表1 番茄果實(shí)茉莉酸路徑相關(guān)基因引物序列Table 1 Primer sequences of jasmonate pathway related genes in tomato fruits

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

本試驗(yàn)重復(fù)2 次以上直到2 次結(jié)果保持一致。試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行Ducan's 多重差異分析，P<0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源MeJA 和谷氨酸對(duì)番茄果實(shí)黑斑病的影響

植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中為了應(yīng)對(duì)周圍逆境對(duì)其產(chǎn)生的傷害，形成了多重復(fù)雜的防御機(jī)制。在病原菌或其它化學(xué)和物理因子的誘導(dǎo)下，會(huì)使得植物體內(nèi)某些潛在的抗性反應(yīng)激發(fā)出來(lái)，進(jìn)而使其獲得對(duì)生物或非生物逆境的抗性[5-8]。為了明確谷氨酸誘導(dǎo)抗性與植物茉莉酸路徑的相關(guān)性，利用外源谷氨酸和MeJA 處理番茄果實(shí)后觀察其對(duì)鏈格孢菌抗性的影響。如圖1 結(jié)果顯示，單獨(dú)經(jīng)谷氨酸處理的果實(shí)發(fā)病率顯著低于對(duì)照組，這與前期研究結(jié)果一致，谷氨酸作為一種理想的化學(xué)誘導(dǎo)因子可以有效提高番茄果實(shí)對(duì)黑斑病的抗性[9]。然而，果實(shí)經(jīng)MeJA 處理后與對(duì)照組的發(fā)病率無(wú)顯著差異，即使結(jié)合谷氨酸也未能進(jìn)一步降低果實(shí)的發(fā)病率，推測(cè)茉莉酸在谷氨酸誘導(dǎo)番茄對(duì)鏈格孢菌的抗性中可能沒(méi)有發(fā)揮積極作用。

圖1 谷氨酸和MeJA 對(duì)番茄果實(shí)發(fā)病率的影響Fig. 1 Effects of glutamate and MeJA on disease incidence of tomato fruit

2.2 谷氨酸對(duì)番茄果實(shí)茉莉酸合成路徑的影響

植物體內(nèi)的茉莉酸是由亞麻酸經(jīng)LOX、AOS、AOC、OPR 等一系列酶催化和3 個(gè)β-氧化反應(yīng)合成，為了進(jìn)一步分析谷氨酸對(duì)番茄果實(shí)茉莉酸路徑的影響，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 測(cè)定了茉莉酸合成路徑上編碼關(guān)鍵酶的基因如SlLOX1、SlAOS2和SlAOC1 的相對(duì)表達(dá)量。如圖2a 所示，經(jīng)谷氨酸處理后SlLOX1 基因的轉(zhuǎn)錄水平在12 h 和48 h 顯著低于對(duì)照組，分別為對(duì)照的0.66 倍和0.15 倍；SlAOS2 在24 h 和48 h 時(shí)也被谷氨酸顯著下調(diào)表達(dá)，尤其在48 h 時(shí)基因相對(duì)表達(dá)量約為對(duì)照組的0.61 倍（圖2b）；對(duì)于SlAOC1，圖2c 結(jié)果顯示其轉(zhuǎn)錄水平在整個(gè)處理期間被谷氨酸下調(diào)。以上結(jié)果說(shuō)明谷氨酸對(duì)果實(shí)的茉莉酸合成可能有一定的抑制作用。

圖2 谷氨酸對(duì)番茄果實(shí)茉莉酸合成路徑相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig. 2 Effect of glutamic on the expression of genes related to the jasmonate synthesis pathway in tomato fruits

2.3 谷氨酸對(duì)番茄果實(shí)茉莉酸信號(hào)路徑的影響

在植物體內(nèi)，茉莉酸作為植物激素或信號(hào)分子誘導(dǎo)的一系列反應(yīng)依賴于其信號(hào)傳導(dǎo)路徑。茉莉酸可通過(guò)其活性形式JA-Ile 結(jié)合COI1 誘導(dǎo)JAZ 降解，進(jìn)而釋放轉(zhuǎn)錄因子MYC2，誘導(dǎo)茉莉酸應(yīng)答基因的表達(dá)[23-24]。如圖3a 所示，作為茉莉酸信號(hào)系統(tǒng)核心元件之一的COI1，其轉(zhuǎn)錄水平在谷氨酸的刺激下被迅速?gòu)?qiáng)烈下調(diào)表達(dá)，在12 h 時(shí)約為對(duì)照組的0.34 倍。對(duì)于信號(hào)系統(tǒng)的負(fù)調(diào)控因子JAZ，編碼JAZ 蛋白的SlJAZ1 基因經(jīng)谷氨酸處理后則上調(diào)表達(dá)。同時(shí)，轉(zhuǎn)錄因子SlMYC2 在谷氨酸處理24 h 之前其基因表達(dá)被顯著抑制，分別為對(duì)照組的0.47 倍（12 h）和0.65 倍（24 h）。另外，由茉莉酸誘導(dǎo)的蛋白酶抑制劑SlPI-II 與SlCOI1 變化規(guī)律一致，其基因表達(dá)水平也被谷氨酸快速下調(diào)，在12 h 和24 h 時(shí)分別為對(duì)照組的0.34 倍和0.50倍。也就是說(shuō)，谷氨酸處理番茄果實(shí)后可能從轉(zhuǎn)錄水平上抑制了茉莉酸誘導(dǎo)的信號(hào)路徑。

圖3 谷氨酸對(duì)番茄果實(shí)茉莉酸信號(hào)路徑相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig. 3 Effect of glutamic on the expression of jasmonate signaling pathway related genes in tomato fruits

3 討論

作為植物體內(nèi)的一種基本氨基酸，谷氨酸不僅參與多種蛋白或非蛋白氨基酸的合成（如γ-氨基丁酸、脯氨酸和精氨酸等與抗逆性相關(guān)的物質(zhì)），且在響應(yīng)逆境脅迫中發(fā)揮著重要作用。當(dāng)植物受到外界環(huán)境脅迫時(shí)，其體內(nèi)的某些生理代謝過(guò)程可能通過(guò)谷氨酸相關(guān)路徑參與調(diào)控，從而增強(qiáng)對(duì)各種逆境脅迫的適應(yīng)性[27]。在鹽脅迫下，植物體內(nèi)的谷氨酸水平會(huì)通過(guò)谷氨酰胺合成酶的激活發(fā)生變化以應(yīng)對(duì)外界脅迫[28]。在干旱脅迫下，由谷氨酸介導(dǎo)的脯氨酸和γ-氨基丁酸合成路徑會(huì)大大增強(qiáng)[29]。在鈣脅迫下，谷氨酰胺合成酶的同工酶被誘導(dǎo)表達(dá)以加強(qiáng)谷氨酰胺的合成，同時(shí)對(duì)不同細(xì)胞內(nèi)的其它氮代謝關(guān)鍵酶如谷氨酸合成酶、谷氨酸脫氫酶也有一定影響[30]。然而，關(guān)于谷氨酸在植物響應(yīng)病原菌侵染中的報(bào)道還較少。有研究發(fā)現(xiàn)谷氨酸還可以作為植物體內(nèi)一種遠(yuǎn)距離傳遞的傷信號(hào)分子，同時(shí)因其綠色安全、使用方便簡(jiǎn)單、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)也被視為一種理想的化學(xué)抗性誘導(dǎo)因子，有效激發(fā)植物的抗病反應(yīng)[31]。然而，目前有關(guān)谷氨酸對(duì)植物的抗性調(diào)控機(jī)制依然知之甚少。最近的證據(jù)顯示，谷氨酸介入了植物激素水楊酸合成和信號(hào)路徑，其對(duì)病原菌的抗性機(jī)制可能部分依賴于水楊酸路徑[12]。前期的研究也證實(shí)，番茄果實(shí)經(jīng)谷氨酸誘導(dǎo)處理后其體內(nèi)的水楊酸合成路徑和信號(hào)路徑相關(guān)基因上調(diào)表達(dá)[9]。以上研究促使繼續(xù)探究另外一種植物激素茉莉酸在谷氨酸誘導(dǎo)抗性機(jī)制中的作用。

本研究中，外源施加谷氨酸可以顯著提高番茄果實(shí)對(duì)腐生型真菌鏈格孢菌的防御能力，有效抑制病原菌的侵染進(jìn)程，然而當(dāng)其結(jié)合MeJA 處理則明顯降低了果實(shí)的抗性，這暗示茉莉酸可能在谷氨酸的誘導(dǎo)抗性機(jī)制中起著負(fù)向調(diào)控作用。事實(shí)上，有研究顯示茉莉酸路徑通過(guò)促進(jìn)番茄植株體內(nèi)真菌的生長(zhǎng)提高了對(duì)鏈格孢菌侵染的敏感性，且侵染過(guò)程依賴于JAI1 調(diào)節(jié)的茉莉酸路徑[32]。Egusa 等[33]比較了鏈格孢菌對(duì)番茄茉莉酸缺失型突變體DEF1 與野生型植株的侵染能力，發(fā)現(xiàn)DEF1 對(duì)病原菌的抗性較高，也就是說(shuō)在番茄與鏈格孢菌互作中，茉莉酸路徑可能促進(jìn)了寄主的發(fā)病過(guò)程。為了進(jìn)一步明確茉莉酸在谷氨酸抗性機(jī)制中的作用，本文研究了谷氨酸對(duì)番茄果實(shí)茉莉酸合成路徑和信號(hào)路徑的影響。結(jié)果顯示，茉莉酸合成路徑上編碼關(guān)鍵酶的SlLOX1、SlAOS2 和SlAOC1 基因表達(dá)不同程度的被谷氨酸所抑制。同時(shí)，在茉莉酸合成受到抑制的情況下，作為茉莉酸活性形式JA-Ile 受體的SlCOI1 也被谷氨酸顯著下調(diào)表達(dá)，致使其誘導(dǎo)JAZ 降解的程度下降（Sl-JAZ1 上調(diào)表達(dá)）。相應(yīng)地，由于JAZ 無(wú)法移除從而釋放轉(zhuǎn)錄因子MYC2，使得MYC2 轉(zhuǎn)錄水平也顯著下降?？梢?jiàn)，谷氨酸處理也抑制了果實(shí)中茉莉酸誘導(dǎo)的信號(hào)路徑。另外，茉莉酸路徑標(biāo)志物-蛋白酶抑制劑SlPI-II 基因的下調(diào)表達(dá)也進(jìn)一步證明了谷氨酸對(duì)茉莉酸路徑的抑制作用。這與前人結(jié)果類似，Jia 等[17]和Zhang 等[32]的研究發(fā)現(xiàn)番茄植株的茉莉酸不敏感突變體JAI1 對(duì)鏈格孢菌的抗性提高可能與茉莉酸路徑上相關(guān)基因如LOXD、AOS2、PI-II 的表達(dá)受到抑制有關(guān)，尤其是PI-II基因在突變體JAI1 中幾乎無(wú)表達(dá)。張麗平[19]以鏈格孢菌產(chǎn)生的毒素與番茄葉片互作體系為研究對(duì)象，揭示了茉莉酸合成路徑和信號(hào)路徑正向參與調(diào)控了由毒素所誘導(dǎo)的細(xì)胞程序化死亡，這有利于以死亡細(xì)胞或組織為營(yíng)養(yǎng)來(lái)源的腐生型病原菌的侵染。事實(shí)上，植物在應(yīng)對(duì)病原菌侵染時(shí)，宿主細(xì)胞處于活性還是死亡狀態(tài)與谷氨酸代謝相關(guān)路徑密切相關(guān)[34]。前期研究報(bào)道了谷氨酸可以有效誘導(dǎo)谷氨酸代謝路徑（如谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合成酶循環(huán)、γ-氨基丁酸支路、三羧酸循環(huán)等）上的關(guān)鍵酶和基因表達(dá)，同時(shí)還可以提高抗氧化酶系統(tǒng)活性，也就是說(shuō)谷氨酸可能是通過(guò)激活上述路徑抑制活性氧的大量積累和宿主細(xì)胞死亡來(lái)抵御腐生型病原菌的侵染[9]。綜上推斷，本研究中谷氨酸可能是通過(guò)抑制番茄果實(shí)的茉莉酸相關(guān)路徑來(lái)降低由病原菌誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，從而提高果實(shí)對(duì)鏈格孢菌侵染的防御能力。

4 結(jié)論

在番茄果實(shí)與鏈格孢菌互作中，谷氨酸對(duì)病原菌的抗性機(jī)制可能與茉莉酸路徑被抑制有關(guān)。有趣的是，前期研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)谷氨酸處理的番茄果實(shí)其體內(nèi)的水楊酸路徑被激活，這與水楊酸和乙烯/茉莉酸信號(hào)路徑相互拮抗的多項(xiàng)研究報(bào)道一致。植物體內(nèi)的各條激素信號(hào)路徑并非孤立存在，而是有錯(cuò)綜復(fù)雜的交談機(jī)制，精細(xì)調(diào)控著植物的防御系統(tǒng)。然而，本文僅對(duì)茉莉酸路徑做了初步探討，后續(xù)還需對(duì)不同植物激素信號(hào)路徑之間的互作做進(jìn)一步的研究，為谷氨酸在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域內(nèi)的商業(yè)化應(yīng)用提供更為充分的理論依據(jù)，同時(shí)也為控制病害策略提供新的視角。