劉 敏,邢 倩,柯 勝,周中凱*
(1 天津科技大學食品科學與工程學院 天津300457 2 石河子大學 農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全控制重點實驗室 新疆石河子 832003)
淀粉是一種來源豐富的天然生物聚合物,由直鏈淀粉和支鏈淀粉構(gòu)成,廣泛存在于谷類、薯類、豆類等植物中[1]。直鏈淀粉和支鏈淀粉含量和比例的差異是解釋淀粉的理化性質(zhì)和功能性質(zhì)差異的因素之一[2]。天然淀粉具有易老化、耐水性差、凝膠能力較差、熱不穩(wěn)定性等缺陷,這在很大程度上限制了天然淀粉的應用。通常采用物理(微波、輻照和超聲等)、化學(交聯(lián)、酯化和氧化等)、生物(酶改性)等方法對天然淀粉進行改性,增強或抑制其固有性質(zhì),以滿足特定應用的要求[3]。酶解改性具有反應條件溫和可控、效率高、產(chǎn)品安全等優(yōu)勢,已逐漸成為淀粉改性的關鍵方法[4]。普魯蘭酶(Pullulanase)是一種淀粉脫支酶,能選擇性地水解支鏈淀粉中的α-1,6 糖苷鍵,減小淀粉的分支化度,形成低分子質(zhì)量的線性短直鏈分子[5]。這些線性短鏈分子具有更大的流動性,能夠促進分子排列和聚集,使其具有良好的凝膠和重結(jié)晶性能,在食品和藥物制劑中有很廣闊的應用前景[6]。
殼聚糖(Chitosan,CS)是天然多糖中唯一的堿性氨基多糖,來源于甲殼素[7]。CS 具有良好的生物相容性、生物黏附性、抗氧化性、成膜性,廣泛應用于食品、醫(yī)藥、化妝品等行業(yè)[8]。此外,它對人體健康有很大的影響,如降低膽固醇,抑制脂肪吸收,改善腸道代謝,抗菌,保護人體組織和器官[9]。近年來,越來越多的研究集中在淀粉與多糖的相互作用[10]。有研究報道CS 的加入有利于蓮子淀粉-殼聚糖共混物中形成有序的分子結(jié)構(gòu),并且CS 可以改善蓮子淀粉的流變學行為[11]。Diao 等[12]研究表明淀粉與CS 經(jīng)干熱處理后的相互作用改善了其理化性質(zhì)(如糊化溫度、溶脹度、消化率等)。在淀粉加工過程中添加多糖可提高淀粉的穩(wěn)定性和產(chǎn)品質(zhì)量。
近年來,許多研究利用天然淀粉與殼聚糖的相互作用來克服淀粉加工性能的不足,提高加工的穩(wěn)定性,而DBS 與CS 之間的相互作用有待進一步研究。DBS 與天然淀粉的結(jié)構(gòu)完全不同,推測其功能也是不同的。本試驗用普魯蘭酶對玉米淀粉進行脫支處理,研究脫支處理前、后玉米淀粉與殼聚糖復合的外貌形態(tài)、結(jié)晶結(jié)構(gòu)、熱穩(wěn)定性和流變學特性,獲得一種新型的復合物改性淀粉,為其的工業(yè)應用提供理論參考。
玉米淀粉(直鏈淀粉含量為28.7%),山東富陽生物科技有限公司;普魯蘭酶(1 500 U/mL),江蘇瑞陽生物有限公司;殼聚糖(CAS:9012-76-4,脫乙酰度>90%),山東奧康生物科技有限公司;茚三酮、氘代二甲基亞砜(DMSO-d6),上海源葉生物科技有限公司;其它試劑均為分析純級。
SU1510 掃描電子顯微鏡,日本電子株式會社;Better2600 激光粒度分析儀,丹東百特儀器有限公司;AV Ⅲ400MHz 核磁共振波譜儀,北京布魯克科技有限公司;DMAX2500 X-射線衍射儀,日本理學株式會社;Q50 熱重分析儀,上海斯邁歐分析儀器有限公司;IS50 傅里葉變換紅外光譜、MARS 60 動態(tài)流變儀,德國賽默飛世爾科技有限公司;ALPHA1-2LD 冷凍干燥機,德國CHRIST 公司;CT62A 全自動高壓蒸汽滅菌鍋,上海馳通儀器有限公司。
1.3.1 脫支淀粉-殼聚糖復合物的制備 脫支淀粉的制備參照Lu 等[4]的方法并做了下調(diào)整。將10 g 玉米淀粉溶于100 mL 蒸餾水中,置于121 ℃高壓蒸汽滅菌鍋中20 min 使其完全糊化。將糊化淀粉冷卻至58 ℃,加200 μL 普魯蘭酶進行酶解脫支5 h,滅酶,冷卻至室溫即可得到脫支玉米淀粉溶液(DBS)。
用1%乙酸溶液配制質(zhì)量分數(shù)為0%,1%,1.5%和2%的殼聚糖溶液(CS)[13]。將脫支淀粉溶液與不同質(zhì)量分數(shù)的殼聚糖溶液混合,調(diào)整pH 值至4.8~5.0,在4 ℃下攪拌24 h。離心(4 000 r/min,10 min)取沉淀物進行冷凍干燥后研磨過100 目篩,即可制備得不同質(zhì)量分數(shù)的脫支玉米淀粉-殼聚糖復合物(DBS-CS)。以未進行脫支處理的玉米淀粉為空白對照,按相同的程序制備原玉米淀粉-殼聚糖復合物(MS-CS)。
1.3.2 復合率的測定 參考Panda 等[14]的方法,用茚三酮顯色法測定樣品的復合率。取1.3.1 節(jié)離心后的上清液0.4 mL,與2 mL HAc-NaAc 緩沖液(0.2 mol/L,pH 5.5)和1 mL 茚三酮溶液(10.00 g/L)混合,加水至5.00 mL,在沸水浴保持20 min。冷卻至室溫后,用60%乙醇溶液定容至10 mL,充分混勻,靜置15 min 后在波長570 nm 處測定吸光度,按照式(1)計算復合率(P)。
式中,P——復合率,%;m總——殼聚糖總質(zhì)量,g;m上——上清液中殼聚糖質(zhì)量,g。
1.3.3 微觀結(jié)構(gòu)觀察 利用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察脫支前、后玉米淀粉-殼聚糖復合物的結(jié)構(gòu)變化。將樣品用導電膠固定并噴金。在5 kV的加速電壓下進行樣品形貌觀察。
1.3.4 粒徑分布測定 采用濕法進樣,用蒸餾水懸浮淀粉樣品,在循環(huán)泵速為1 600 r/min 的轉(zhuǎn)速下攪拌,水和樣品的折射率分別為1.33 和1.52。當系統(tǒng)顯示遮光率范圍在5%~10%時即可進行粒徑分布測定。
1.3.5 傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)分析 將干燥樣品與KBr(質(zhì)量比1∶150)混合壓片,在400~4 000 cm-1的掃描范圍和4 cm-1的分辨率下,掃描32 次獲得了FTIR 光譜圖。波數(shù)范圍在1 200~800 cm-1的所有光譜進行傅里葉去卷積,半峰寬為45.5 cm-1和增強因子為1.9 的條件下通過1 047 cm-1/1 022 cm-1處的吸收峰強度比來表征淀粉樣品的短程有序性[15]。
1.3.6 熱力學性質(zhì)(TGA)分析 精確稱取5.0 mg樣品均勻分散在氧化坩堝中,使用熱重分析儀測量樣品的熱特性。設置樣品升溫范圍為30~600℃,升溫速率為20 ℃/min,測試過程中保持氮氣流速為60 mL/min。
1.3.7 X-射線衍射(XRD)分析 在40 kV 的電壓和40 mA 的電流條件下用Cu-Kα 輻射探測器(λ=0.154 nm)進行X-射線衍射分析。掃描范圍為2θ=4°~45°,掃描速度為2°/min,步長0.02°。采用MDI jade 5.0 進行圖形處理,并按照式(2)計算相對結(jié)晶度(RC)。
式中,RC——相對結(jié)晶度,%;Ac——結(jié)晶區(qū)域面積;Aa——無定形區(qū)域面積。
1.3.8 核磁共振氫譜(1H NMR)分析 參照Li 等[16]的方法并作如下調(diào)整。稱取10 mg 樣品溶于500 μL DMSO-d6中,在95 ℃下混合20 min 使其完全溶解,冷卻后將液體全部轉(zhuǎn)移至核磁管中。在25 ℃下對樣品進行核磁共振氫譜分析,取樣時間2.18 s,掃描32 次。
1.3.9 流變特性測定 將3.0 g 樣品與25 mL 蒸餾水混合均勻,加熱糊化20 min 得到待測樣品糊。取約3 mL 的待測樣品糊置于直徑為35 mm 平行板上,設置間隙1 mm,加蓋板以防止水分流失。在25 ℃下進行動態(tài)和靜態(tài)流變特性的測定。
1.3.9.1 靜態(tài)流變特性測定(觸變環(huán))選擇旋轉(zhuǎn)連續(xù)掃描程序分析靜態(tài)流變特性。測定剪切速率分別在180 s 從0~300 s-1遞增,再從300~0 s-1遞減過程中樣品的變化。采用Herschel-Bulkley 模型【式(3)】進行擬合分析得到樣品的流變參數(shù)。方程如下:
式中,τ——剪切應力,Pa;τ0——屈服應力,Pa;K——稠度系數(shù),Pa·sn;γ——剪切速率,s-1;n——流動特征指數(shù),無量綱,表示液體偏離牛頓流體的程度。
1.3.9.2 動態(tài)黏彈性測定 選擇振蕩振幅掃描程序分析動態(tài)流變特性。振蕩頻率范圍為0.1~10 Hz,掃描應變?yōu)?.1%,確定樣品的線性黏彈性區(qū)。測量樣品的儲能模量(G′)和損耗模量(G")隨振蕩頻率增加的變化情況。
1.3.10 數(shù)據(jù)處理與分析 所有試驗至少做3 個平行,數(shù)據(jù)結(jié)果以“平均標±準偏差”表示。用IBM SPSS Statistics 26 對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析和差異顯著性分析(P<0.05),用Origin 2018 軟件進行繪圖。用MestReNova 軟件分析1H NMR 譜。
如圖1 所示,通過掃描電子顯微鏡觀察玉米淀粉、脫支玉米淀粉和脫支前、后玉米淀粉-殼聚糖復合物的微觀形態(tài)。MS 顆粒呈現(xiàn)為表面光滑、棱角分明的多面體(圖1a)。與MS 相比,MS-CS-1顆粒表面變得粗糙,顆粒表面的光滑度有所降低(圖1b)。經(jīng)酶解脫支處理后,得到的DBS 顆粒的表面形貌發(fā)生了明顯的變化,呈不規(guī)則形狀,顆粒粒徑變大并且出現(xiàn)了明顯的團聚現(xiàn)象(圖1c)。與DBS 相比,DBS-CS 顆粒的表面略顯粗糙并且有小部分顆粒相互黏附在一起。隨著殼聚糖添加量的增加,復合物表面附著的殼聚糖數(shù)量逐漸增加,顆粒間的結(jié)合力也越來越緊密(圖1d~1f)。
圖1 脫支處理前、后淀粉-殼聚糖復合物的掃描電鏡圖Fig. 1 SEM of starch-chitosan complexes before and after debranching treatment
從圖2 可以看出,DBS 和DBS-CS 的粒徑分布均大于MS,MS 和MS-CS-1 的粒徑呈現(xiàn)多峰分布,而DBS-CS 復合物的粒徑大多呈現(xiàn)單峰分布。隨著殼聚糖添加量的增加,復合物的粒徑也逐漸增大,粒徑分布均勻,基本呈正態(tài)分布且較為狹窄。D50值(累計粒徑分布數(shù)達到50%時所對應的粒徑)以MS<MS-CS-1<DBS-CS-1<DBS-CS-2<DBS<DBS-CS-3 的順序變化。MS 的粒徑分布范圍大致為10~20 μm,經(jīng)脫支復合后,DBS 和DBS-CS的粒徑都有所增大,這可能是因為普魯蘭酶水解產(chǎn)生更多的線性短鏈分子并且短鏈分子之間相互纏繞聚集,導致顆粒尺寸的增加[17]。粒徑小的分子相互聚集并向粒徑大的方向遷移,這也與掃描電鏡的結(jié)果相符合。
圖2 脫支處理前、后淀粉-殼聚糖復合物的粒徑分布圖Fig. 2 Particle size distribution of starch-chitosan complexes before and after debranching treatment
紅外光譜是研究淀粉官能團和短程有序結(jié)構(gòu)常用的方法。如圖3 所示,所有樣品在3 400 cm-1處的寬吸收帶和2 930 cm-1處分別代表葡萄糖單元中-OH 和-CH 引起的伸縮振動[18]。與MS 相比,DBS 的吸收峰與MS 相似,說明在脫支過程中沒有形成新的化學鍵。然而,兩種樣品的不同之處在于脫支處理會暴露出更多的羥基,因此在3 400 cm-1處的峰強度增強。1 639 cm-1處的尖峰為樣品中水分子的O-H 彎曲振動[19]。MS-CS 和DBS-CS樣品都在1 560 cm-1處出現(xiàn)了新的譜帶,這是NH 彎曲(酰胺II 帶)特征吸收,說明淀粉和殼聚糖形成了新的共價鍵,改變了分子之間的相互作用,形成淀粉-殼聚糖復合物[20]。DBS-CS 在1 560 cm-1處的峰強度高于MS-CS,這可能是因為脫支處理降低了支鏈淀粉的空間位阻,暴露出更多的羥基及反應位點與殼聚糖進行復合,從而提高了淀粉與殼聚糖的復合率。在1 047/1 022 cm-1的FTIR 吸光度比值可以表征淀粉樣品的短程有序結(jié)構(gòu)。在1 047/1 022 cm-1處的FTIR 吸光度比越高,表明淀粉的短程順序越好[15]。1 047/1 022 cm-1的比值在淀粉間存在顯著差異(表1),脫支處理和殼聚糖的加入使得淀粉樣品的短程有序性均有所降低,說明淀粉的短程有序性的變化與脫支處理及殼聚糖的含量有關。
表1 樣品的復合率、相對結(jié)晶度和FTIR 光譜分析參數(shù)Table 1 The combination rate,relative crystallinity and FTIR spectra analysis parameters of samples
圖3 脫支處理前、后淀粉-殼聚糖復合物的FTIR 衍射圖譜Fig. 3 FTIR diffraction patterns of starch-chitosan complexes before and after debranching treatment
樣品的X-射線衍射圖譜和相對結(jié)晶度分別如圖4 和表1 所示。MS 在2θ=15.1°,17.2°,18°和23°處有明顯的衍射特征峰,表明玉米淀粉屬于典型的A 型晶體結(jié)構(gòu)[21]。MS-CS-1 的X 射線衍射峰圖與MS 相似,說明殼聚糖的加入沒有改變MSCS-1 的晶體結(jié)構(gòu)類型,而其相對結(jié)晶度從38.44%下降到32.49%。脫支處理后,DBS 在17.2°附近有一個主峰,在22.5°和24°處形成了新的衍射峰,是典型B 型結(jié)晶結(jié)構(gòu),這表明脫支處理在促進B 型晶體結(jié)構(gòu)的形成中發(fā)揮重要作用[22]。DBS的相對結(jié)晶度(35.08%)低于MS(38.44%),反應過程是從結(jié)晶區(qū)逐漸擴展到無序的非結(jié)晶區(qū),表明DBS 具有更多的非晶態(tài)結(jié)構(gòu)。低溫下脫支會促使分子鏈有更高的排列和聚集機會重新結(jié)合成雙螺旋結(jié)構(gòu),從而形成不同的結(jié)晶結(jié)構(gòu)[23]。
圖4 脫支處理前、后淀粉-殼聚糖復合物的X 射線衍射圖譜Fig. 4 X-ray diffraction patterns of starch-chitosan complexes before and after debranching treatment
經(jīng)過脫支和殼聚糖復合雙重修飾后,DBS-CS復合物雖然保留原有晶體結(jié)構(gòu)對應的尖峰衍射特征峰,但衍射強度有所降低,DBS-CS-1、DBS-CS-2、DBS-CS-3 的相對結(jié)晶度分別為31.52%,29.90%,29.43%。殼聚糖的加入降低了DBS-CS 復合物的相對結(jié)晶度表明CS 抑制了DBS 的再結(jié)晶,其中CS 分子通過空間位阻干擾直鏈分子的閉合[24]。
在圖5 的1H NMR 譜中觀察到的共振峰是由物質(zhì)的化學位移確定的,淀粉結(jié)構(gòu)單元中無水葡萄糖部分的4 個質(zhì)子分別在5.50×10-6(OH-3)、5.40×10-6(OH-2)、4.58×10-6(OH-6)、4.90×10-6(OH-4)處有信號[25]。溶劑DMSO-d6在2.5×10-6處有信號。質(zhì)子的1H 化學位移分別為3.15×10-6(H-4),3.31×10-6(H-2),3.57×10-6(H-5),3.65×10-6(H-3)和5.11×10-6(H-1)[26]。MS-CS 和DBSCS 復合物的1H NMR 光譜在1.8×10-6處顯示出一個新的信號峰,這歸因于殼聚糖中乙酰氨基的共振,新峰的出現(xiàn)進一步表明了復合物的形成[27]。然而,DBS-CS 在1.8×10-6處的信號峰強度明顯強于MS-CS,證實脫支處理導致質(zhì)子化環(huán)境的變化,脫支淀粉中有更多的羥基及反應位點與殼聚糖進行復合,這也與復合率的測定結(jié)果(表1)和FTIR光譜(圖3)結(jié)果一致。
圖5 脫支處理前、后淀粉-殼聚糖復合物的核磁共振氫譜圖Fig. 5 1H NMR spectra of starch-chitosan complexes before and after debranching treatment
圖6 顯示了每個樣品降解過程的熱重(TGA)曲線和導數(shù)熱重(DTG)曲線。DTG 曲線是由TG曲線的導數(shù)求導所得,代表降解過程的質(zhì)量損失率。所有樣品的熱降解過程主要包括兩個階段。第1 失重階段(T<125 ℃)與物理吸附和淀粉中的水分損失有關,第2 失重階段(T>200 ℃)主要與顆粒大小和分子間作用力影響有關[28]。在200~400 ℃溫度范圍內(nèi)DBS-CS 的失重速率總體比MS-CS低,可能是因為脫支改性能夠增加線性短鏈淀粉鏈的數(shù)量,從而影響了淀粉的穩(wěn)定性。DBS-CS 樣品中部分淀粉鏈之間的排列呈無序狀態(tài),隨著殼聚糖含量的增加,使得DBS-CS 的熱裂解速率下降,熱分解溫度改變,熱損失減少,說明DBS 和CS分子之間結(jié)合的緊密程度增加,需要更多的熱量來完成相變,所以熱穩(wěn)定性得到提高。
2.7.1 靜態(tài)流變特性測定分析(觸變性)圖7和表2 給出了所有樣品的回歸曲線和觸變特性參數(shù)。表2 中流變曲線經(jīng)過Herschel-Bulkley 模型擬合之后,具有較高的相關系數(shù)(R2>0.98)表明擬合方程與流變曲線有較好的相關性。剪切應力在較低速率下急劇增加,在較高速率下逐漸趨于穩(wěn)定,且所有淀粉糊的流動特征指數(shù)n 小于1,表現(xiàn)為假塑性剪切變稀行為[29]。
表2 脫支處理前、后淀粉-殼聚糖復合物的觸變特性參數(shù)Table 2 Thixotropic characteristic parameters of starch-chitosan complexes before and after debranching treatment
淀粉樣品糊的剪切應力隨剪切速率從0 s-1增加到300 s-1所形成的流變曲線稱為上行線,隨剪切速率從300 s-1減少到0 s-1所形成的流變曲線稱為下行線,此過程會形成一個閉合的“觸變環(huán)”。觸變環(huán)的面積大小代表淀粉凝膠結(jié)構(gòu)被破壞的程度,表明樣品在剪切力作用下發(fā)生了不可逆的改變[29]?!坝|變面積”越大,說明損傷程度越大,恢復到原來的狀態(tài)難度越大[30]。如圖7 和表2所示,與MS 相比,DBS 和DBS-CS 的剪切應力顯著降低,“觸變面積”顯著減小,表明其抗剪切能力更強。這可能是因為淀粉經(jīng)過脫支處理后,其內(nèi)部結(jié)構(gòu)被完全破壞,分子鏈斷裂,使分子鏈更有利于流動,從而具有較強的抗剪切性能??辜羟行阅艿奶岣呖梢蕴岣叩矸墼诩庸み^程中的穩(wěn)定性和產(chǎn)品質(zhì)量。
2.7.2 動態(tài)黏彈性分析 動態(tài)流變學特性(儲能模量G′和損耗模量G")決定了淀粉糊化后的黏彈性特性。由圖8 可以看出,所有樣品的G"的值均低于G′且不交叉,表明具有典型的弱凝膠動態(tài)流變行為[31]。MS 樣品的G′值和G"值最高,DBS 樣品的G′值和G"值最低,表明脫支處理有效降低玉米淀粉體系的黏彈性,淀粉分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)重組,分子鏈被切割,破壞其凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)的形成,從而DBS表現(xiàn)為穩(wěn)定、光滑、無黏性的液體特性[22]。由于DBS 樣品的G′值和G"值降低,其凝膠性變?nèi)?,影響了脫支淀粉在食品工業(yè)中的應用。隨著殼聚糖含量的增加,G′值和G"值均增加,表明DBS 的黏彈性增強。此外,殼聚糖是一種增稠劑,其形成的交聯(lián)網(wǎng)絡進一步增強了淀粉的黏彈性,促進糊化淀粉的分子間結(jié)合[32]。脫支后產(chǎn)生的短鏈直鏈淀粉具有更好的流動性,且殼聚糖的存在阻礙了較大淀粉鏈的過度聚集,使得系統(tǒng)更加穩(wěn)定。
圖8 脫支處理前、后淀粉-殼聚糖復合物的動態(tài)黏彈性特性Fig. 8 The dynamic viscoelastic properties of starch-chitosan complexes before and after debranching treatment
本試驗研究結(jié)果表明,經(jīng)脫支處理后,DBS 顆粒呈不規(guī)則形狀,顆粒粒徑變大并且其形成的復合致密性增強,可以得到一種新型的復合改性淀粉。XRD 結(jié)果表明脫支處理使得淀粉的結(jié)晶結(jié)構(gòu)由A 型向B 型轉(zhuǎn)變,且DBS 的相對結(jié)晶度降低。殼聚糖的加入雖不會改變淀粉的結(jié)晶類型,但其相對結(jié)晶度由32.49%降低至29.43%,可能的原因是殼聚糖的加入抑制了脫支淀粉的再結(jié)晶。FTIR和1H NMR 分別在1 560 cm-1和1.8×10-6處出現(xiàn)殼聚糖的特征化學信號峰,表明DBS 與CS 分子的復合效果較好。此外,1 560 cm-1處DBS-CS 的峰值強度強于MS-CS,說明普魯蘭酶降低了支鏈淀粉的空間位阻,增強了殼聚糖與淀粉分子的相互作用。淀粉在1 047/1 022 cm-1的比值上存在顯著差異,說明淀粉的短程分子序的變化與脫支處理和殼聚糖的含量有關。TGA 結(jié)果表明,DBS-CS樣品中部分淀粉鏈之間的排列呈無序狀態(tài),隨著殼聚糖含量的增加,DBS-CS 的熱裂解速率下降,熱損失減少,熱穩(wěn)定性得到提高。流變學研究表明,所有樣品具有典型的弱凝膠動態(tài)流變行為和假塑性剪切變稀行為。DBS 和DBS-CS 的“觸變面積”顯著減小,抗剪切能力增強。淀粉經(jīng)過脫支處理后,其內(nèi)部結(jié)構(gòu)被完全破壞,分子鏈斷裂,使分子鏈更有利于流動,從而具有較強的抗剪切性能??辜羟行阅艿奶岣呖梢蕴岣叩矸墼诩庸み^程中的穩(wěn)定性和產(chǎn)品質(zhì)量。