姜酮酚納米乳液制備工藝優(yōu)化及其穩(wěn)定性研究

劉夢夢，郭時印，肖 航，覃靜萍，范 偉，唐忠海*

（1 湖南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院 長沙410128 2 麻省大學阿莫斯特分校食品科學系 美國阿莫斯特01003 3 湖南省菜籽油營養(yǎng)健康與深度開發(fā)工程技術(shù)研究中心 長沙 410128）

乳液[1]是熱力學上不穩(wěn)定的膠體分散體，由2種不相容的液體組成，其中一種液體（次要成分）在表面活性劑存在下以液滴的形式分散到其它液體（主要成分）中[2-4]，根據(jù)粒徑、穩(wěn)定性可以將乳液分為常規(guī)乳液、納米乳液和微乳液[5]，納米乳液粒徑范圍<200 nm[1]。極小的液滴尺寸有各種潛在好處：如高光學透明度，對顆粒聚集和重力分離具有很高的穩(wěn)定性以及提高包埋功能組分的生物利用度等[6-7]。超聲乳化是制備納米乳液的一種高能量方法，基于空化現(xiàn)象，超聲波會產(chǎn)生高溫、高壓、強剪切力和機械力。用超聲波產(chǎn)生的乳狀液中納米級液滴的尺寸比用其它機械裝置制備的乳狀液多分散指數(shù)低，而且相對穩(wěn)定，同時該方法具有操作簡單、成本低、安全、無毒等特點[8]。

生姜的塊莖含有多種化學成分[9-10]，主要含3類：揮發(fā)油類、姜辣素（包括姜酚類、姜烯酚類、姜酮類、姜二酮類、姜二醇類等不同類型）、二苯基庚烷[11]。姜酮酚（6-Paradol）[12-14]是由姜中的姜烯酚生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的不飽和酮[15]。有研究表明姜烯酚會在體內(nèi)代謝為姜酮酚[16]，也有研究表明姜酮酚具有很強的抗氧化、抗炎和黃嘌呤氧化酶抑制活性[17-19]，同時具有較為可觀的降血糖、抗癌、凋亡和神經(jīng)保護活性、減肥等作用[20-21]。然而，由于姜酮酚是一種脂溶性化合物，水溶性極差且結(jié)構(gòu)中存在不飽和酮，該部位容易發(fā)生脫水、熱解及發(fā)生氧化反應(yīng)，單獨經(jīng)口服攝入后體內(nèi)生物利用度很低。此外，姜酮酚具有的辛辣刺激特性在很大程度上限制了其在食品與醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。

近幾年，為提高脂溶性天然活性成分（如類胡蘿卜素、姜黃素、黃酮、VE 等）的生物利用度[22]，越來越多的研究者開始設(shè)計食品級納米乳液傳遞系統(tǒng)，尤其是水包油乳液。納米乳液作為遞送體系，可顯著提高脂溶性化合物的溶解性并提高其輸送效率，在改善人類健康方面顯示出很大的應(yīng)用潛力[23-24]。目前關(guān)于姜酮酚的研究較少，也未見姜酮酚納米乳液超聲制備的相關(guān)報道，本文采用超聲技術(shù)，通過單因素實驗和正交試驗優(yōu)化姜酮酚納米乳液制備條件，并對其穩(wěn)定性能進行評價，為姜酮酚產(chǎn)品開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

姜酮酚樣品（HPLC 純度≧95%），濟南名可生物科技有限公司；原香菜籽油（食品級），道道全糧油股份有限公司；吐溫85（食品級），山東優(yōu)索化工科技有限公司；大豆卵磷脂，浙江一諾生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SCIENTZ-IID 超聲波細胞破碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；集熱式恒溫磁力攪拌浴，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；電子天平，福州華志科學儀器有限公司；冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；激光共聚焦顯微鏡，德國蔡司公司；濁度計，上海昕瑞儀器儀表有限公司；Zetasizer Nano ZS 納米粒度儀，馬爾文儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 姜酮酚溶解度 準確稱取一定質(zhì)量的菜籽油，加入過量的姜酮酚，充分混勻后恒溫超聲1 h。超聲完成后，將油溶液加入1.5 mL 離心管中，以14 000 r/min 離心20 min，取上清液，以空白菜籽油為對照，利用酶標儀在波長284 nm 處測定吸光值，根據(jù)標準曲線進行定量。

1.3.2 標準曲線 參考Davidov-Pardo 等[25]的方法，精確稱取0.2 mg 姜酮酚樣品溶解在20 g DMSO 中，配制得0.01 mg/g 的葉黃素標準液，準確稀釋 得含量 為0.04，0.035，0.03，0.025，0.02，0.015，0.01 mg/g 的姜酮酚標準液，利用酶標儀在284 nm 測定吸光值。以質(zhì)量比為橫坐標，吸光值為縱坐標，做標準曲線。

1.3.3 納米乳液的制備 在使用超聲波設(shè)備制備納米乳液之前，進行如下預(yù)乳化處理：將水相緩慢地滴加到油相中，同時在磁力攪拌器上攪拌10 min。在預(yù)乳液形成后，使用超聲細胞破碎儀制備納米乳液。超聲產(chǎn)生的乳液中納米級液滴的尺寸比其它機械裝置制備的乳液的多分散性更小，也相對更穩(wěn)定[26]，乳液制備的簡易流程見圖1。

圖1 乳液制備流程圖Fig. 1 Flow chart of preparation of emulsion

圖2 姜酮酚標準曲線Fig. 2 Standard curve of 6-paradol

1.3.4 納米乳液的制備優(yōu)化

1.3.4.1 乳化劑質(zhì)量分數(shù) 將4%菜籽油與0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%的Tween 85 或卵磷脂混合，加入95.5%，95.0%，94.5%，94.0%，93.5%的去離子水。油相與水相混勻后用磁力攪拌器攪拌10 min 得粗乳液，之后將粗乳液在超聲功率（250 W）下超聲15 min 得納米乳液，所有乳液樣品轉(zhuǎn)移至離心管中，4 ℃儲存，之后測定乳液的粒徑和PDI。

1.3.4.2 超聲功率 將1.0%的Tween 85 或卵磷脂與4%菜籽油混合，與95%水相在磁力攪拌器上攪拌10 min 得粗乳液，之后將粗乳液在100，200，250，300，400、500 W 下超聲9 min 得納米乳液，所有乳液樣品轉(zhuǎn)移至離心管中，4 ℃儲存，之后測定乳液的粒徑和PDI。

1.3.4.3 超聲時間 將1.0%的Tween 85 或卵磷脂與4%菜籽油混合，與95%水相在磁力攪拌器上攪拌10 min 得粗乳液，之后將粗乳液在250 W 下超聲3，9，15，21，27 min 得納米乳液，所有乳液樣品轉(zhuǎn)移至離心管中，4 ℃儲存，之后測定乳液的粒徑和PDI。

1.3.4.4 芯材質(zhì)量分數(shù) 將0.05%，0.1%，0.2%，0.3%，0.4%的姜酮酚加入到菜籽油中，充分混勻后加入吐溫85（或卵磷脂），與水相混勻用磁力攪拌器攪拌10 min 得粗乳液，之后將粗乳液在250 W下超聲9 min 得納米乳液，所有乳液樣品轉(zhuǎn)移至離心管中，4 ℃儲存，之后測定乳液的粒徑和粒徑分布。

1.3.5 正交優(yōu)化 根據(jù)單因素實驗的結(jié)果，選擇超聲時間、超聲功率和姜酮酚質(zhì)量分數(shù)作為變量，設(shè)計三因素三水平的正交試驗對制備條件進行優(yōu)化，按表1 進行正交優(yōu)化試驗。

表1 正交因素水平表Table 1 Table of orthogonal factor levels

表2 正交優(yōu)化結(jié)果Table 2 The results of orthogonal optimization experiments

表3 納米乳液的基本性質(zhì)Table 3 The characteristics of nanoemulsion

1.3.6 粒徑測定 將得到的乳液取樣后，用去離子水稀釋100 倍，采用納米粒度及Zeta 電位分析儀Zetasizer Nano ZS 測量其粒徑大小以及多分散系數(shù)（Polydispersity Index，PDI）。

1.3.7 濁度測量 用散射光濁度計在室溫（25±0.5）℃條件下測量納米乳的濁度，每份樣品測量重復(fù)3 次。

1.3.8 微觀結(jié)構(gòu)觀察 利用激光共聚焦顯微鏡觀察納米乳液的微觀結(jié)構(gòu)[26]，測樣前將100 μL 尼羅紅染料加入2 mL 樣品中，混合均勻，滴加在載玻片上，蓋上蓋玻片，采用63 倍物鏡倒置觀察。所有圖像均用儀器軟件程序拍攝和處理。

1.3.9 包埋率 參考Davidov-Pardo 等[25]的方法，將乳液在DMSO 中稀釋100 倍（與溶解度測定條件保持一致），利用酶標儀在波長284 nm 處測定吸光值。

1.3.10 儲藏穩(wěn)定性和離心穩(wěn)定性

1.3.10.1 離心穩(wěn)定性[27]取1.5 mL 的納米乳液加入到離心管中，加蓋密封，于室溫5 000 r/min 分別離心0，5，10，15，20 min 觀察相分離情況。

1.3.10.2 儲藏穩(wěn)定性 新鮮制備的姜酮酚納米乳液在25 ℃和4 ℃下儲存1 個月。儲存時間對納米乳液穩(wěn)定性的影響以7 d 為間隔通過物理觀察、粒徑來確定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有的試驗均重復(fù)3 次，試驗結(jié)果以平均值±標準偏差表示。采用Origin 2018、Photoshop CC 2019 軟件進行基礎(chǔ)數(shù)據(jù)處理并制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 姜酮酚溶解度

姜酮酚需要先溶解于油相中，再與水相混合通過超聲制備納米乳液，在油相中的溶解度限制了芯材的載量，故首先測定姜酮酚在菜籽油中溶解度[28]。通過標準曲線計算可知（y=5.1857x-0.0031，R2=0.9994），姜酮酚在菜籽油中的溶解度為138.9 mg/g 左右。

2.2 乳化液制備單因素實驗

2.2.1 乳化劑質(zhì)量分數(shù)的選擇 水包油納米乳液體系由水、油和乳化劑3 部分組成，為了形成水包油乳液，使用的乳化劑是親水誘導(dǎo)的表面活性劑[29-31]。分別選用卵磷脂[32-33]（天然的生物兩親性化合物）和吐溫85（非離子表面活性劑）作為乳化劑制備納米乳液。結(jié)果如圖3 所示，使用吐溫85 制備的乳液隨著乳化劑質(zhì)量分數(shù)增加，乳液粒徑不斷減小，在乳化劑質(zhì)量分數(shù)為1%時，粒徑達到了（149.4±0.7）nm，此 時PDI 最低為0.13。同 時Sondari 等[29]的研究結(jié)果也表明吐溫85 的質(zhì)量分數(shù)越高，納米乳的粒徑越小。Ghosh 等[30]發(fā)現(xiàn)表面活性劑濃度與液滴大小成反比，與穩(wěn)定性直接相關(guān)。使用卵磷脂制備乳液時，在乳化劑質(zhì)量分數(shù)為1%時，乳液粒徑為（249.3±2.03）nm，此時PDI 最低為0.39，在質(zhì)量分數(shù)達到1%之后，粒徑并沒有隨著乳化劑質(zhì)量分數(shù)增加而有明顯變化。有研究者發(fā)現(xiàn)過量卵磷脂會降低乳液穩(wěn)定性并導(dǎo)致存在囊狀卵磷脂聚集體[34]。綜上所述，選擇乳化劑質(zhì)量分數(shù)為1%進行后續(xù)試驗。

圖3 乳化劑質(zhì)量分數(shù)對納米乳液平均粒徑和PDI 的影響Fig. 3 The impact of emulsifier mass fractionon the mean droplet diameter and PDI of nanoemulsion

2.2.2 超聲條件對乳液粒徑的影響

2.2.2.1 超聲功率 如圖4 將粗乳液在100，200，250，300，400，500 W 下超聲15 min，試驗結(jié)果表明：使用吐溫85 制備的乳液在功率為250 W 時，粒徑達到（146.9±2.18）nm，PDI 為0.127±0.004；使用卵磷脂制備的乳液在250 W 時，粒徑達到（250.8±2.09）nm，PDI 為0.396±0.011；在400 W時，粒徑是（232.1±0.98）nm，PDI 為0.320±0.002。試驗結(jié)果表明粒徑和PDI 并不簡單的隨超聲功率增大而減小，施加的過量超聲能量或存在的過量表面活性劑質(zhì)量分數(shù)對液滴性質(zhì)產(chǎn)生不利影響[35-36]。綜上，選擇超聲功率250 W 進行后續(xù)試驗。

圖4 超聲功率對納米乳液平均粒徑和PDI 的影響Fig. 4 The impact of ultrasonic power on the mean droplet diameter and PDI of nanoemulsion

2.2.2.2 超聲時間 如圖5 在250 W 下超聲3，9，15，21，27 min 得納米乳液，在超聲15 min時，吐溫85 和卵磷脂制備的乳液粒徑分別達到了（147.5±1.17）nm 和（248.0±4.55）nm，PDI 為0.114±0.005 和0.38±0.008；有研究者通過超聲乳化15 min 制備出液滴直徑為29.3 nm 的穩(wěn)定羅勒油納米乳[30]。結(jié)果表明隨著超聲時間的增加液滴直徑稍有減小，乳液粒徑略有減小，超聲到達15 min時發(fā)現(xiàn)粒徑趨于平穩(wěn)或略有增加。

圖5 超聲時間對納米乳液平均粒徑和PDI 的影響Fig. 5 The impact of ultrasonic time on the mean droplet diameter and PDI of nanoemulsion

2.2.3 姜酮酚質(zhì)量分數(shù) 本試驗將0.05%，0.1%，0.2%，0.3%，0.4%的姜酮酚加入到菜籽油中，試驗結(jié)果如圖6 所示，在姜酮酚添加量為0.1%時，吐溫85 和卵磷脂制備的乳液粒徑分別達到了粒徑為（150.3±0.78）nm 和（253.7±1.1）nm，PDI 為0.158±0.008 和0.396±0.016，結(jié)果表明在相同的超聲條件下，姜酮酚質(zhì)量分數(shù)對納米粒徑的影響不大，可能由于姜酮酚的添加量相對較小，尚未對油相性質(zhì)產(chǎn)生影響，故不會顯著影響乳液粒徑的大小[37]。

圖6 姜酮酚質(zhì)量分數(shù)對納米乳液平均粒徑和PDI 的影響Fig. 6 The impact of 6-paradol mass fraction on the mean droplet diameter and PDI of nanoemulsion

2.3 正交優(yōu)化試驗

根據(jù)單因素實驗的結(jié)果，選擇超聲時間、超聲功率和乳化劑質(zhì)量分數(shù)作為變量，設(shè)計三因素三水平的正交試驗對制備條件進行優(yōu)化。從表中可知，表明各因素對粒徑大小影響的顯著程度為：超聲時間>超聲功率>姜酮酚質(zhì)量分數(shù)，使用吐溫85制備乳液的最佳條件是：1% Tween 85、超聲功率250 W、超聲時間15 min、姜酮酚質(zhì)量分數(shù)為0.1%；使用卵磷脂制備乳液的最佳條件是1%卵磷脂、超聲功率350 W、超聲時間15 min、姜酮酚質(zhì)量分數(shù)為0.2%。

2.4 納米乳液的基本性質(zhì)

使用吐溫85 和卵磷脂制備的乳液，利用納米粒度儀對稀釋后的納米乳液經(jīng)過反復(fù)測量可知兩種乳液粒徑分別為（144.1±3.76）nm 和（241.4±2.12）nm，姜酮酚的包封率分別為（96.5±2.51）%和（87.47±1.84）%，可以較好地將姜酮酚地包封在其中，僅有少量滲漏至水相之中。

2.5 微觀結(jié)構(gòu)觀察

利用尼羅紅對乳液中的油脂進行染色，在圖中顯示為紅色的液滴，并通過激光共聚焦顯微鏡對乳液的結(jié)構(gòu)進行觀察，結(jié)果如圖7 所示。結(jié)果顯示，原液中的液滴顆粒直徑小，分布均勻，且與粒度分布結(jié)果基本一致[36]。

圖7 吐溫85（a）和卵磷脂（b）制備乳液的激光共聚焦（CLSM）圖像Fig. 7 Laser confocal microscopy（CLSM）images of emulsions prepared from Tween 85（a）and lecithin（b）

2.6 納米乳液離心穩(wěn)定性和儲藏穩(wěn)定性

將姜酮酚納米乳液采用5 000 r/min 分別離心5，10，15，20 min 觀察相分離情況。結(jié)果如圖8所示，在20 min 內(nèi)，使用吐溫85 制備的乳液離心后未產(chǎn)生分層、破乳現(xiàn)象，而卵磷脂制備的乳液在第5 分鐘時就已經(jīng)產(chǎn)生分層、破乳現(xiàn)象。因此，使用吐溫85 制備的乳液比卵磷脂具有較好的離心穩(wěn)定性。

圖8 吐溫85（a）和卵磷脂（b）的離心穩(wěn)定性Fig. 8 Centrifugal stability of Tween 85（a）and lecithin（b）

納米乳液通常在室溫下儲存，在4～8°C 下稍微冷藏有助于防止化學降解過程[34]。將新鮮制備的姜酮酚納米乳液在25 ℃和4 ℃下儲存1 個月，從表4 和圖9 可以看出卵磷脂制備的乳液在4℃儲存14 d 后由于乳液分層，粒徑無法進行測定，而吐溫85 制備的乳液粒徑隨儲藏時間的增加粒徑略有增加，表現(xiàn)了良好的穩(wěn)定性。然而，兩種乳液在25 ℃儲藏都沒有表現(xiàn)出很好的穩(wěn)定性，液滴出現(xiàn)聚集，粒徑變大，所以納米乳液適合在低溫（4 ℃）儲存。

表4 不同乳化劑制備的乳液儲藏1 個月的粒徑變化（nm）Table 4 Particle size variation of emulsions prepared by different emulsifiers stored for one month（nm）

圖9 儲存穩(wěn)定性Fig. 9 Storage stability

3 結(jié)論

本文使用超聲處理，在粒徑、PDI、包埋率、濁度、離心穩(wěn)定性和儲藏穩(wěn)定性等方面對2 種乳化劑制備的乳液進行對比。研究表明，使用1%吐溫85 制備的乳液各方面略優(yōu)于卵磷脂，然而2 種乳液在25 ℃儲藏都沒有表現(xiàn)出很好的穩(wěn)定性，液滴出現(xiàn)聚集，粒徑變大，針對上述問題，后續(xù)研究可在如下方面進一步開展探索：完善乳液體系，選擇天然乳化劑或者復(fù)配乳化劑；或使用高壓均質(zhì)進一步優(yōu)化乳液制備條件，使其乳化效果更好，以此提高乳液穩(wěn)定性。同時本研究為姜酮酚納米乳液產(chǎn)品開發(fā)及其穩(wěn)定性研究奠定基礎(chǔ)，以及姜酮酚在食品加工領(lǐng)域中的應(yīng)用提供了新思路。