產(chǎn)細菌素Enterocin Y3 糞腸球菌對小鼠腸道菌群及代謝功能的影響

楊珍珠，陶樂仁，趙陸愷，王 元，遲 海*

（1 中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所 上海200090 2 上海理工大學健康科學與工程學院 上海 200093）

近年來，食源性致病菌的污染和繁殖一直是造成食品安全隱患的首要問題之一[1]。特別是抗生素的濫用使細菌的耐藥性增強，耐藥性致病菌的殘存和增殖成為全球公共衛(wèi)生主要影響問題之一[1]。此外，對于一些特定致病菌的治療，傳統(tǒng)的廣譜抗生素會擾亂宿主腸道微生物群，影響其免疫、代謝等正常功能的發(fā)揮。因此，尋找更加安全、高效的抗菌藥物十分迫切。

糞腸球菌（Enterococcus faecalis）為乳酸菌目腸球菌科腸球菌屬的一種兼性厭氧菌，是一種廣泛存在于人類或動物腸道的共生菌，具有較強的耐酸性和定植能力，營養(yǎng)要求不高，易培養(yǎng)的特點，可作為益生菌，在調節(jié)腸道微環(huán)境、機體免疫中發(fā)揮著重要作用[2-3]。此外，糞腸球菌具有產(chǎn)核糖體合成抗菌肽（稱為細菌素）的能力，糞腸球菌素具有安全性高、熱穩(wěn)定性強、易被蛋白酶水解和對親緣細菌有高效抑制的特點，對食源性致病菌、耐藥性腸球菌和特定腐敗菌的殘存具有特異性消殺/抑制作用[4]。糞腸球菌素這種靶向抑菌的作用，可避免對腸道其它有益微生物菌群造成傷害[5]。有效開發(fā)和利用產(chǎn)細菌素的糞腸球菌對腸道疾病的調控具有重大意義[6]。

實驗室工作人員前期從羊奶中分離出1 株在體外具有潛在益生特性的糞腸球菌DH9003，結果發(fā)現(xiàn)其抑菌產(chǎn)物細菌素對食源性致病菌【如單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）等】及其親緣較近的耐藥性腸球菌有高效益抑制作用[7]。為進一步探討該糞腸球菌的益生菌特性，本研究通過建立健康小鼠（C57 小鼠）模型，對小鼠灌胃糞腸球菌DH9003，在不同時間內收集小鼠糞便，分析糞腸球菌DH9003 在小鼠體內的定植情況。通過16S rDNA 高通量測序及非靶向代謝組分析，研究糞腸球菌DH9003 對小鼠腸道菌群結構及其代謝能力的影響。結合小鼠肝臟、腸道切片的顯微鏡觀察，綜合評估糞腸球菌DH9003 的益生特性，為益生菌的資源開發(fā)提供技術支持，也為由食源性致病菌及耐藥性腸球菌引起的腸道疾病的治療提供新的解決思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與菌株

4 周齡雄性小鼠C57，體質量（15±1）g，購自上海市計劃生育科學研究所實驗動物經(jīng)營部。產(chǎn)Enterocin Y3 糞腸球菌DH9003（E.faecalis DH9003）、指示菌單增李斯特菌LFM2813（Lis.monocytogenes LFM2813），保存于中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所。

1.2 培養(yǎng)基與試劑耗材

鼠用配合飼料，上海新輝動物飼料有限公司；灌胃針（8 號，45 mm），中科恒天科技有限公司；氯化鈉、甲醛、無水乙醇、二甲苯、中性樹膠，國藥集團化學試劑有限公司；磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH 7.2）；腦心浸液培養(yǎng)基（Brain heart infusion，BHI），美國BD 公司；HE 染液套裝，Servicebio 公司。

1.3 儀器與設備

立式滅菌鍋YXQ-LS-50SII，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療器械廠；恒溫培養(yǎng)箱HH.B11.500-BS-Ⅱ，上海躍進醫(yī)療器械機械廠；高速離心機TG16WS，長沙湘智離心機儀器有限公司；Lecia 倒置光學顯微鏡、包埋機JB-P、凍臺JB-L5，武漢俊杰電子有限公司；病理切片機RM2016，上海徠卡儀器有限公司；脫水機Donatello、染色機Giotto，DIAPATH 公司；組織攤片機KD-P，浙江省金華市科迪儀器設備有限公司；烤箱GFL-230，天津市萊玻璃儀器設備有限公司；載玻片G6004，Servicebio公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 菌株培養(yǎng) 將2%接種量的糞腸球菌DH9003 接種于BHI 液體培養(yǎng)基中，30 ℃有氧條件下培養(yǎng)14 h 后4 ℃離心2 min，收集菌體，用無菌生理鹽水洗滌2～3 次，將菌體重懸到無菌生理鹽水中，采用平板計數(shù)法[8]調整其濃度為109CFU/mL，即灌胃液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 小鼠的飼養(yǎng)及灌胃 取雄性C57 小鼠15只，在動物房【溫度（23±2）℃，相對濕度50%～60%，12 h 明暗交替照明】中適應性喂養(yǎng)7 d，期間進食和飲水自由。

適應性喂養(yǎng)1 周后，將小鼠隨機分成空白對照組（HD 組，n=7）和糞腸球菌處理組（YD 組，n=8），其中糞腸球菌處理組每天按0.2 mL/10 g 體質量灌胃，空白對照組每天灌胃相應劑量的無菌生理鹽水，每天1 次。實驗共干預4 周，定期收集小鼠糞便并移至-80 ℃凍存，避免反復凍融。

1.4.3 小鼠糞便中細菌抑菌活性的測定及菌種鑒定 無菌條件下，分別取0，7，28 d 的小鼠糞便0.1 g 至滅菌的離心管中，加入0.9 mL 無菌生理鹽水溶解，梯度稀釋至10-4，10-5，10-6，10-7，10-8。分別將每個梯度樣品涂布于BHI 固體培養(yǎng)基中，30 ℃過夜培養(yǎng)后，以單增李斯特菌（Lis.monocytogenes LFM2813）為指示菌，將指示菌以2%的接種量接種于5 mL BHI 軟瓊脂中，充分混勻，均勻傾倒于BHI 固體培養(yǎng)基中，待其凝固后，30 ℃條件下過夜培養(yǎng)，觀察結果。

隨機挑取每個梯度中有抑菌活性的單菌落，接種于BHI 液體培養(yǎng)基中，30 ℃過夜培養(yǎng)。參考楊珍珠等[7]的方法對有抑菌活性的細菌進行DNA提取、PCR 擴增及菌種鑒定。

1.4.4 組織切片分析 飼養(yǎng)實驗結束后，對小鼠進行頸椎脫臼處死（所有小鼠處死前一晚禁食12 h）。解剖后獲取小鼠的肝臟和腸道，剪取適宜大小的新鮮肝臟和小腸組織，用無菌生理鹽水清洗后置于甲醛固定液（V甲醛∶VPBS=1∶9）中固定，參考Sadeghipour 等[9]的方法進行修剪、脫水、包埋、切片，采用蘇木精-伊紅（Hematoxylin-eosin staining，HE）染色并封片，于光學顯微鏡下觀察肝臟和腸道組織結構。

1.4.5 小鼠糞便腸道菌群的測定 分別收集實驗開始的第0，7 天和28 天的空白對照和糞腸球菌DH9003 處理組的小鼠糞便，將其貯存于-80 ℃冰箱，在干冰保存條件下送至上海派森諾生物科技有限公司進行16S rDNA 基因組高通量測序。具體方法：采用DNA 提取試劑盒提取樣本基因組DNA，使用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 純度和濃度。待樣本DNA 質量滿足建庫測序要求后，取適量樣品用超純水稀釋至20 ng/μL 進行擴增。以提取的細菌基因組DNA 為模板，使用高保真DNA 聚合酶和帶標簽序列的特殊引物F：5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3' 和R：5'-GGAC TACHVGGGTWTCTAAT-3' 對細菌DNA 的16S V3-V4 區(qū)域進行PCR 擴增。采用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物的準確性，回收并純化PCR擴增產(chǎn)物。采用Quant-iT PicoGreen dsDNA 檢測試劑盒定量分析，構建Miseq 文庫。采用Illumina NovaseqPE250 平臺測序。

1.4.6 生物信息學分析 根據(jù)序列質量對高通量測序的原始下機數(shù)據(jù)進行初篩，對問題樣本進行重測和補測。通過質量初篩的原始序列按照標簽序列信息進行文庫和樣本劃分，并去除標簽序列。按照Caporaso 等[10]的方法用QIIME2 dada2 平臺分析數(shù)據(jù)。

1.4.7 小鼠代謝能力的測定 小鼠代謝能力采用Kinross 等[11]的方法測定。實驗結果中差異性代謝物分析采用具有監(jiān)督的正交偏最小二乘判別分析（Orthogonal partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA）模型從數(shù)據(jù)集中篩選出與分組相關的差異脂類物質，以變量權重值（Variable importance for the projection，VIP）＞1 和P ＜0.05為差異代謝物篩選標準，采用KEGG 數(shù)據(jù)庫對代謝通路進行注釋，獲得差異代謝物參與的代謝通路。

1.4.8 數(shù)據(jù)處理 利用SPSS 25 軟件進行單因素方差分析并通過Duncan 法進行差異顯著性分析（P＜0.05 表示差異顯著）。每個處理組進行6 次生物學重復，結果用平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 小鼠糞便的抑菌活性及菌株鑒定結果

采用平板計數(shù)法統(tǒng)計各組小鼠糞便中對單增李斯特菌有抑菌活性的細菌菌落總數(shù)。由圖1 可見，空白對照（HD）組小鼠在灌胃0，7 d 和28 d 時的糞便中有抑菌活性的菌落總數(shù)保持穩(wěn)定，菌落總數(shù)范圍3.0×106～5.0×106CFU/g，而糞腸球菌DH9003 處理（YD）組的小鼠糞便中有抑菌活性的細菌菌落總數(shù)在0～7 d 大幅增長，在7～28 d 增長緩慢并趨近穩(wěn)定，表明小鼠在灌胃糞腸球菌DH9003 后，該細菌在小鼠腸道中大量定植，然后隨著灌胃時間的延長，腸道中DH9003 的數(shù)量緩慢增加并逐漸趨于穩(wěn)定。

圖1 灌胃不同時間的小鼠糞便中有抑菌活性的細菌菌落總數(shù)Fig. 1 TVC of faces isolates with antimicrobial activity during intragastric administration period

從不同梯度涂布的平板中隨機挑取10 株細菌，發(fā)現(xiàn)它們對單增李斯特菌均有抑菌活性。對照組小鼠糞便中未發(fā)現(xiàn)有抑制單增李斯特菌的菌株。經(jīng)鑒定所有細菌均為糞腸球菌。這間接說明糞腸球菌DH9003 已大量定植在小鼠腸道，且屬于優(yōu)勢菌株。

2.2 小鼠肝臟、腸道切片觀察結果

腸道是生物體吸收營養(yǎng)物質和阻擋有害組織的主要器官，同時也是機體最大的免疫器官，約70%的免疫細胞和免疫球蛋白都集中于此[12]。腸道是否正常是評價機體健康狀況的標準之一[13]。圖2a 和2b 分別為空白對照組和糞腸球菌處理組的小鼠腸道切片的顯微鏡圖，結果顯示兩組小鼠的腸道上皮細胞均排列緊密，結構較為完整，腸腺上皮細胞與基底膜緊密結合，腸絨毛完整，未見明顯異常。值得注意的是，糞腸球菌DH9003 處理組的小鼠腸絨毛相對于空白對照組排列更為密集且腸絨毛的長度增加，這表明糞腸球菌DH9003 對小鼠的腸道未產(chǎn)生負面影響，同時會對小鼠腸黏膜屏障有一定的改善作用。

圖2 小鼠組織切片觀察結果Fig. 2 Observation results of mice tissue sections

肝臟健康是機體其它臟器健康的基礎，具有分解潛在有害物質，調節(jié)穩(wěn)定的內部環(huán)境的重要作用[14]。評估小鼠肝臟的組織病理學變化能有效判定糞腸球菌DH9003 是否會對機體產(chǎn)生不利影響。圖2c 和2d 分別為空白對照組和處理組小鼠的肝臟切片顯微鏡觀察圖，結果發(fā)現(xiàn)空白對照組和糞腸球菌處理組的小鼠肝組織均結構均勻，未產(chǎn)生病變，說明DH9003 未對小鼠肝臟產(chǎn)生有害影響。

2.3 糞腸球菌DH9003 對小鼠腸道菌群物種多樣性的影響

2.3.1 Alpha 多樣性分析 稀疏曲線是Alpha 多樣性中一個重要指數(shù)，不僅用于評估微生物組測序量或樣本量的飽和情況，而且可用來比較不同數(shù)量樣本的物種豐富度[15]。圖3 為空白對照組（HD）和糞腸球菌處理組（YD）測序的稀疏曲線。當樣本測序深度增加到一定量時，曲線斜率平滑，變化較小，說明該樣本量設置合理。隨著測序深度的增加，YD 的物種豐富度整體低于HD 的物種豐富度，這可能是因為短時間內高劑量糞腸球菌DH9003 持續(xù)進入腸道中，在腸道中定植并成為相對優(yōu)勢菌群，對其它菌種產(chǎn)生抑制，從而導致其物種豐富度降低。這與劉石等[16]報道的添加復合益生菌導致物種豐富度低于對照組的結果一致。

2.3.2 Beta 多樣性分析 由NMDS 分析可觀察到生物學組內相似性及組間的差異性是否明顯[17]。如圖4 所示，每個點代表1 個樣本，不同顏色代表不同分組。兩個樣品間距離越近，說明樣品中微生物群落差異越小，反之說明樣品間微生物群落組成結構差異越大。本研究中空白對照組和DH9003處理組的樣本距離近，而灌胃后的樣本距離遠，說明實驗有效。同時，隨著灌胃時間的延長，樣本的距離變遠，說明灌胃糞腸球菌DH9003 對小鼠腸道菌群分布有一定影響，需進一步分析。

表1 部分差異代謝物統(tǒng)計表Table 1 Partial different metabolite statistics

圖4 Beta 多樣性分析Fig. 4 Analysis on Beta diversity

2.3.3 物種組成分析 圖5 是不同處理組不同時間的小鼠糞便中微生物群落門水平的相對豐度。擬桿菌門（Bacteroidetes）和厚壁菌門（Firmicutes）為小鼠糞便中的優(yōu)勢菌門，2 個細菌門的相對豐度總量達在93%以上，說明外源益生菌的補充對小鼠腸道的菌群結構有一定的調節(jié)作用，然而不能改變主要的優(yōu)勢菌群，這與陸文偉等[18]的研究結果一致。同時，DH9003 處理組在門水平上的差異主要表現(xiàn)在擬桿菌門和厚壁菌門的變化，這與Vemuri 等[19]研究結果相似?？瞻讓φ战M中，0，7 d和28 d 厚壁菌門的相對豐度分別為37.13%，51.67%和41.86%。DH9003 處理組中，0，7 d 和28 d 厚壁菌門的相對豐度分別為40.17%，47.43%和63.58%。由此可見，空白對照組中，厚壁菌門的相對豐度隨飼養(yǎng)時間的延長先增加后減少，說明新的環(huán)境可能會影響小鼠腸道菌群中厚壁菌門相對豐度的變化，當適應一段時間后，腸道菌群中厚壁菌門的相對豐度又減少并恢復到穩(wěn)定水平。糞腸球菌DH9003 處理組中，厚壁菌門的相對豐度隨著糞腸球菌灌胃時間的延長而不斷增加，說明攝入DH9003 后其在小鼠腸道中定植，并隨灌胃時間的延長逐步成為腸道的優(yōu)勢菌群。

圖5 門水平上不同處理組不同時間的小鼠糞便中微生物菌群相對豐度Fig. 5 Relative abundance of microbial communities in feces of mice at different time points in different treatment groups at the phylum level

2.3.4 物種差異分析與標志物種 LefSe（LDA Effect Size）分析是一種差異分析方法，可以直接對所有分類水平同時進行差異分析，尋找分組之間穩(wěn)健的差異物種，在微生物宏基因組分析領域獲得廣泛的應用[20]。圖6 為糞腸球菌DH9003 處理組小鼠的物種分類學分支圖。在糞腸球菌DH9003處理組中，腸球菌屬（Enterococcus spp.）是主要的差異物種。綜合小鼠糞便中活性菌株的鑒定結果，推斷攝入糞腸球菌DH9003 對小鼠腸道菌群的豐度和多樣性有潛在的影響。

圖6 糞腸球菌DH9003（YD）處理組的物種分類學分支Fig. 6 The branch of taxonomy of species of E.faecalis DH9003（YD）treatment group

2.4 糞腸球菌DH9003 對小鼠代謝的影響

2.4.1 代謝組學數(shù)據(jù)質控 圖7 為質控樣本（QC）的總離子流圖重疊譜圖（TIC）。QC 樣本總離子流圖的基線穩(wěn)定，各色譜峰的相應強度和保留時間基本重疊，說明試驗過程中由儀器引起的變異較小，重復性好，所采集的樣品數(shù)據(jù)可進行差異分析。

圖7 QC 樣本總離子流圖重疊譜圖Fig. 7 Total ion current overlapped chromatograms of quality control samples

2.4.2 正交偏最小二乘判別分析 為判別處理組0 d 和28 d 之間是否有差異，采用OPLA-DA 分析方法對兩組進行分析。圖8 為處理組0 d 和28 d的OPLS-DA 得分圖和置換檢驗圖。結果表明：每組的樣品能較好地聚成一類，兩組間有明顯的區(qū)分，說明試驗重復性較好。同時，在正離子模式下，R2X=0.601，R2Y=1，Q2=0.99，負離子模式下，R2X=0.761，R2Y=0.999，Q2=0.996，這表明模型穩(wěn)定可靠。為避免監(jiān)督模型在建模過程中發(fā)生過擬合，本試驗采用置換檢驗對模型進行逆行檢驗以保證模型的有效性。隨著置換保留度逐漸降低，隨機模型的R2和Q2逐漸下降，說明原模型不存在過擬合現(xiàn)象，模型穩(wěn)健性良好。

圖8 YD_0 VS YD_28 OPLS-DA 得分圖和置換檢驗圖Fig. 8 OPLS-DA score and permutation test chart of YD_0 VS YD_28

2.4.3 差異代謝物的篩選 采用OPLS-DA VIP>1 和P<0.05 為顯著性差異代謝物篩選標準，初步篩選處理組0 d 和28 d 的差異代謝物，共檢出差異代謝物254 種，其中124 種顯著上調，130 種顯著下調。表1 為糞腸球菌DH9003 處理后小鼠糞便種的部分的差異代謝物。

2.4.4 差異代謝KEGG 通路分析 KEGG 富集分析是以KEGG 通路為單位，以該物種或親緣關系較近的物種所參與的代謝通路為背景，通過Fisher精確檢驗（Fisher's exact test）分析計算各通路代謝物富集的顯著性水平，從而確定受到顯著影響的代謝和信號轉導途徑[21]。圖9 為顯著性最高的前20 條的差異表達代謝物KEGG 富集通路圖。顯著性水平較高的代謝通路有ABC 轉運蛋白和蛋白消化吸收通路，包含的差異代謝物數(shù)量分別是31 個和12 個。

圖9 差異表達代謝物KEGG 富集通路圖Fig. 9 KEGG enriched pathway of differentially expressed metabolites

圖10 為ABC 運輸通路的代謝物熱圖和蛋白消化吸收通路的代謝物熱圖。通過顏色變化反映每種代謝物的變化程度，紅色表示顯著上調，藍色表示顯著下調，顏色深淺反應上、下調程度。綜合圖10 結果發(fā)現(xiàn)，D-谷氨酰胺、L-亮氨酸、天冬氨酸、苯酚、谷氨酸、L-天冬氨酸在兩組代謝變化中都呈現(xiàn)顯著上調的結果。相應的，兩組結果中丙酸、丙氨酸、丁酸、脯氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸呈顯著下調現(xiàn)象。

圖10 ABC 運輸通路（a）和蛋白消化吸收通路（b）的代謝物熱圖Fig. 10 Metabolite thermograms of ABC transport pathway（a）and protein digestive absorption pathway（b）

3 結論

用產(chǎn)細菌素Enterocin Y3 糞腸球菌灌胃健康C57 小鼠28 d，研究該菌株在小鼠體內的定植、病理學以及對小鼠腸道菌群和代謝能力的影響。小鼠糞便中細菌抑菌活性測定結果表明灌胃后0～7 d，DH9003 在小鼠體內大量定植，在7～28 d，糞腸球菌DH9003 數(shù)量緩慢增加并趨于穩(wěn)定。腸道、肝臟組織切片觀察表明：攝入糞腸球菌DH9003 使小鼠的腸黏膜更為密集且長度增加，對小鼠腸黏膜有一定的改善作用，且未對肝臟產(chǎn)生有害影響和損傷。微生物多樣性分析結果說明補充糞腸球菌DH9003 能在一定程度上調節(jié)小鼠的腸道菌群結構，在門水平上的差異變化主要是擬桿菌門和厚壁菌門的改變。物種組成分析結果表明，空白對照組中，0，7 d 和28 d 厚壁菌門的相對豐度分別為37.13%，51.67%和41.86%，厚壁菌門的相對豐度隨飼養(yǎng)時間的延長先增加后減少，說明新環(huán)境可能刺激小鼠腸道菌群中厚壁菌門相對豐度的變化，而當適應一段時間后，腸道菌群中厚壁菌門的相對豐度減少并恢復到穩(wěn)定水平。糞腸球菌DH9003 處理組中，0，7 d 和28 d 厚壁菌門的相對豐度分別為40.17%，47.43%和63.58%，厚壁菌門的相對豐度隨糞腸球菌灌胃時間的延長而不斷增加，說明攝入糞腸球菌DH9003 后其在小鼠腸道中定植，并隨灌胃時間的延長逐步成為腸道的優(yōu)勢菌群。LEfSe 分析結果表明腸球菌屬（Enterococcus sp.）是主要的差異物種，說明糞腸球菌DH9003 的攝入對小鼠腸道菌群的豐度和多樣性有潛在影響。代謝組學結果表明，灌胃糞腸球菌DH9003 前和灌胃28 d 后，共檢出254 種差異代謝物，其中124 種顯著上調，130 種顯著下調。基于KEGG 通路富集分析發(fā)現(xiàn)顯著性水平較高的代謝通路有ABC 轉運蛋白和蛋白消化吸收通路。上述結果說明該菌株安全無害且對宿主的腸道菌群結構和代謝能力有一定的調節(jié)作用，研究結果為益生菌資源的利用提供了技術支持。