發(fā)酵海產(chǎn)品中產(chǎn)蛋白酶菌株多樣性及其酶學(xué)特性

檀茜倩，王 丹，王曉晴，崔方超，呂欣然，李學(xué)鵬，李英美，勵(lì)建榮*

（1 渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院/海洋研究院 遼寧錦州121013 2 達(dá)蓮食品（錦州）有限公司 遼寧錦州 121019）

蛋白酶是一種水解肽鍵的酶類(lèi)[1]，其來(lái)源廣泛，微生物是蛋白酶的一類(lèi)重要來(lái)源。微生物源蛋白酶的利用率高[2]且穩(wěn)定性好，在較高溫度、極端pH 值條件、表面活性劑和有機(jī)溶劑存在的情況下仍能夠保持較高活力[3-4]。發(fā)酵是一種傳統(tǒng)的食品加工方式，對(duì)于海產(chǎn)品這類(lèi)營(yíng)養(yǎng)豐富而容易腐敗的食品來(lái)說(shuō)，發(fā)酵處理不僅能在一定程度上延長(zhǎng)食品貨架期，還能獲得特殊風(fēng)味。產(chǎn)蛋白酶菌株在海產(chǎn)品發(fā)酵中起到了非常重要的作用。產(chǎn)蛋白酶菌株的存在一方面可加速發(fā)酵過(guò)程以及改善發(fā)酵食品的風(fēng)味和品質(zhì)。有研究利用從發(fā)酵魚(yú)湯、魚(yú)露廠、鹽晶和鹽鍋中分離的多株產(chǎn)蛋白酶菌株作為發(fā)酵劑發(fā)酵生產(chǎn)魚(yú)露，相對(duì)于未接種發(fā)酵劑的自然發(fā)酵方式，更能促進(jìn)魚(yú)露特定香氣和風(fēng)味的形成[5]。Peinado 等[6]利用蛋白酶酶解水產(chǎn)品加工副產(chǎn)物生產(chǎn)魚(yú)粉，發(fā)現(xiàn)能顯著改善魚(yú)粉風(fēng)味，尤其是使其腥味降低。然而，產(chǎn)蛋白酶菌株在海產(chǎn)品的發(fā)酵中也有不利影響。研究發(fā)現(xiàn)部分菌株（例如維氏氣單胞菌等）蛋白酶的分泌與發(fā)酵食品腐敗變質(zhì)密切相關(guān)[7-8]。基于以上2 個(gè)出發(fā)點(diǎn)考慮，本研究以自制發(fā)酵海產(chǎn)品為研究對(duì)象，對(duì)其中產(chǎn)蛋白酶菌株進(jìn)行了篩選，并對(duì)其中部分產(chǎn)蛋白酶菌株的生長(zhǎng)特性以及其產(chǎn)生蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了分析，以期為海產(chǎn)品發(fā)酵酶解菌種開(kāi)發(fā)和避免發(fā)酵海產(chǎn)品變質(zhì)提供一定借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)原料 自制腌制發(fā)酵蛤蜊、蝦蛄、海參腸等海產(chǎn)品。

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基 細(xì)菌DNA 提取試劑盒、PCR 擴(kuò)增試劑預(yù)混液、細(xì)菌通用引物，生工生物工程（上海）股份有限公司；福林酚試劑、碳酸鈉、三氯乙酸、氫氧化鈉、無(wú)水乙醇、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂、氯化亞鐵、三氯化鐵、氯化銅、EDTA等均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)，上海帝博思生物科技公司；LB 營(yíng)養(yǎng)瓊脂、LB 液體培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；改良脫脂乳培養(yǎng)基（10.0 g/L，瓊脂20.0 g/L，水1.0 L，pH 7.2～7.4），115 ℃滅菌15 min備用。

1.2 設(shè)備與儀器

BagMixer 400 均質(zhì)器，法國(guó)Interscience 公司；SW-CJ-2FD 超凈工作臺(tái)，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；Thermo Sorvall Legend Micro21R臺(tái)式微量離心機(jī)，美國(guó)賽默飛世爾科技公司；LRH-250A 型生化培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；MS105DU 電子分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司；GelDoc XR+全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad 公司；PCR 儀，德國(guó)Eppendorf 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌株的初篩和分離純化 在無(wú)菌環(huán)境下取各樣品10.0 g，加入無(wú)菌生理鹽水90 mL，梯度稀釋后，涂布于LB 固體培養(yǎng)基，每個(gè)梯度做3 個(gè)平行，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后挑取不同形態(tài)菌株進(jìn)行純化培養(yǎng)和革蘭氏染色，將分離的菌株凍存于-80 ℃冰箱。

1.3.2 產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選 將保藏在-80 ℃冰箱的菌株活化后接種于LB 液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h 后將菌液以10 000 r/min 離心10 min，留取上清液。參考耿芳等[9]的方法適當(dāng)修改，采用牛津杯法篩選產(chǎn)蛋白酶菌株，具體方法為將滅菌處理后的牛津杯放入平板后將脫脂乳固體培養(yǎng)基倒入平板，待其凝固后，取出牛津杯，在孔內(nèi)加入150 μL分離菌株上清液，無(wú)菌水做陰性對(duì)照，在37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h 后測(cè)量透明圈直徑，探究其產(chǎn)蛋白酶情況。

1.3.3 產(chǎn)蛋白酶菌株鑒定 對(duì)在平板上形成透明圈的產(chǎn)蛋白酶菌株按照細(xì)菌DNA 提取試劑盒說(shuō)明完成菌株DNA 提取。采用細(xì)菌通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-TACGACTTAACCCCAATCGC-3’），以所提取各菌株DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，對(duì)PCR 產(chǎn)物檢測(cè)合格后送上海生工生物科技有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比，用MAGE7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3.4 菌株產(chǎn)蛋白酶酶活測(cè)定 參照曹慧等[10]的方法并作適當(dāng)修改以分離粗蛋白酶。將37 ℃培養(yǎng)24 h 后的菌液轉(zhuǎn)移到無(wú)菌離心管中，于4 ℃、10 000 r/min 下離心10 min，所得上清液為胞外蛋白酶粗酶液，保存于4 ℃冰箱內(nèi)并于12 h 內(nèi)使用。按照國(guó)標(biāo)GB/T 23527-2009《蛋白酶制劑》中的福林酚顯色法測(cè)定蛋白酶活力[11]。吸取0.5%的酪蛋白溶液2 mL，在40 ℃水浴加熱5 min，加入預(yù)熱的粗酶液1 mL，反應(yīng)10 min 后加入10%三氯乙酸溶液3 mL，孵育15 min 終止反應(yīng)，以無(wú)菌水代替粗酶液作為陰性對(duì)照。將反應(yīng)液在12 000 r/min離心10 min，取上清液1 mL 加入5 mL 碳酸鈉溶液（0.55 mol/L）和1 mL 福林酚試劑，處理15 min后在波長(zhǎng)680 nm 處測(cè)定樣品及對(duì)照組樣品的吸光度值（A）。根據(jù)公式（1）計(jì)算粗酶液酶活力。

式中，A樣——樣品吸光度值；A對(duì)——對(duì)照組樣品吸光度值；K——標(biāo)準(zhǔn)曲線為1 時(shí)對(duì)應(yīng)酪氨酸的含量，μg；t——酶促反應(yīng)時(shí)間，10 min；V——酶促反應(yīng)總體積，6 mL。

1.3.5 產(chǎn)蛋白酶菌株生物學(xué)特性分析

1.3.5.1 溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響 參照Shu 等[12]的方法作適當(dāng)修改。按照3%的接種量將菌株接種于LB 液體培養(yǎng)基并置于不同溫度（20，25，28，30，37，40 ℃）培養(yǎng)24 h，在波長(zhǎng)600 nm 處根據(jù)測(cè)得各溫度菌株隨時(shí)間生長(zhǎng)的吸光度值變化判斷溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響。

1.3.5.2 pH 值對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響 參照Sun 等[13]的方法作適當(dāng)修改。按照3%接種量將活化后的菌株接種于pH 值分別為1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5 的LB 液體培養(yǎng)基中，置于37℃搖床培養(yǎng)24 h 后測(cè)定波長(zhǎng)600 nm 處菌株生長(zhǎng)的吸光度值變化判斷pH 值對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響。

1.3.5.3 鹽質(zhì)量濃度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響 參考宋夢(mèng)思等[14]的方法，按照3%接種量將活化后的菌株接種于鹽質(zhì)量濃度為10，20，30，40，50，60，70 g/L的LB 液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃搖床培養(yǎng)24 h 后測(cè)定波長(zhǎng)600 nm 處菌株生長(zhǎng)的吸光度值變化判斷鹽質(zhì)量濃度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響。

1.3.6 蛋白酶酶學(xué)性質(zhì)分析 選取產(chǎn)蛋白酶活力較高的不同種菌株進(jìn)行蛋白酶酶學(xué)特性分析。

1.3.6.1 溫度對(duì)酶活力的影響 分別在10，20，30，40，50，60 ℃條件下測(cè)定粗酶液酶活力，判斷溫度對(duì)酶活力的影響。

1.3.6.2 pH 值對(duì)酶活力的影響 參考Sun 等[15]的方法，將粗酶液與pH 值為5.0，6.0，7.0，8.0，9.0 的酪蛋白底物在上述最適溫度下反應(yīng)，測(cè)得相應(yīng)酶活力，判斷pH 值對(duì)酶活力的影響。

1.3.6.3 金屬離子和抑制劑對(duì)蛋白酶活力的影響參照李丹陽(yáng)等[16]的方法并作適當(dāng)修改。分別將粗酶液與添加1 mmol/L 和10 mmol/L 的不同金屬離子（Na+、K+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+）氯化物鹽溶液和抑制劑EDTA 共孵育30 min，將沒(méi)有添加金屬離子和抑制劑的蛋白酶活性定義為100%，測(cè)定在金屬離子和抑制劑的作用下粗酶液相對(duì)酶活的變化。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)蛋白酶菌株的分離培養(yǎng)與鑒定

產(chǎn)蛋白酶微生物種類(lèi)很多，分布于類(lèi)桿菌門(mén)、變形桿菌門(mén)、放線桿菌門(mén)、熱變形球菌門(mén)等多個(gè)門(mén)中[17]。本研究從發(fā)酵海產(chǎn)品中分離得到多株菌株，經(jīng)改良脫脂乳平板篩選后發(fā)現(xiàn)10 株菌株具有產(chǎn)蛋白酶能力。以菌株DNA 為模板利用細(xì)菌通用引物對(duì)菌株16S rRNA 基因序列進(jìn)行擴(kuò)增，在1 000 bp 附近均出現(xiàn)明顯條帶（圖1）。

圖1 菌株的16S rRNA 基因PCR 擴(kuò)增電泳圖Fig. 1 Electrophoretic of PCR amplification products of 16S rRNA gene of the isolated strains

將PCR 產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比并經(jīng)過(guò)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析后得到的菌株鑒定結(jié)果如表1 所示，分離培養(yǎng)得到表型不同的菌株分別為革蘭氏陽(yáng)性菌的貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）S1YBB、S1YB，藤黃色微球菌（Micrococcus luteus）C1Y1，海氏腸球菌（Enterococcus hirae）M1R；革蘭氏陰性菌的黏質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）S2DD、S2DB、C2Y3、M1B、C2J2，海 藻希瓦氏菌（Shewanella alga）C2J1。

表1 菌株鑒定結(jié)果分析Table 1 Analysis of strain identification results

菌株在LB 平板上的生長(zhǎng)形態(tài)如圖2a 所示。貝萊斯芽孢桿菌S1YBB、S1YB 生長(zhǎng)狀態(tài)呈現(xiàn)中間凸起，有孢子形成；黏質(zhì)沙雷氏菌S2DD、S2DB、C2Y3、M1B、C2J2 菌落邊緣清晰，有黏性；藤黃色微球菌C1Y1 呈現(xiàn)油狀金黃色；海藻希瓦氏菌C2J1 菌落表面光滑、邊緣清晰；海氏腸球菌M1R為球狀菌落。菌株粗酶提取液在改良脫脂乳平板上水解圈的形成情況如圖2b 所示，10 株菌在改良脫脂乳平板上形成大小不一的水解圈。

圖2 菌落形態(tài)（a）以及菌株粗酶提取物的蛋白水解能力（b）Fig. 2 Colony morphology of the strains（a）and the hydrolytic abilities of their crude enzyme extract（b）

2.2 菌株產(chǎn)蛋白酶酶活分析

參照國(guó)標(biāo)GB/T 23527-2009《蛋白酶制劑》制作酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程式為：y=0.0097x+0.0994，其中R2=0.9992，表明線性回歸方程線性關(guān)系良好。根據(jù)福林酚試劑法對(duì)10 株菌株產(chǎn)蛋白酶活性進(jìn)行測(cè)定（表2），其中黏質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)蛋白酶酶活相對(duì)較高，均在20 U/mL以上，最高的是黏質(zhì)沙雷氏菌S2DB 為（32.44±0.67）U/mL，藤黃色微球菌C1Y1、海藻希瓦氏菌C2J1、海氏腸球菌M1R 產(chǎn)蛋白酶酶活也可以達(dá)到20 U/mL 以上，而貝萊斯芽孢桿菌S1YBB 所產(chǎn)蛋白酶活性最低為（8.65±0.14）U/mL，相對(duì)于已報(bào)道[18]芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的酶活較低，在后續(xù)研究中可考慮對(duì)其培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化以提高產(chǎn)酶活性。本研究選取5 株產(chǎn)蛋白酶活力相對(duì)較高的不同種菌株（貝萊斯芽孢桿菌S1YB、黏質(zhì)沙雷氏菌S2DB、藤黃色微球菌C1Y1、海藻希瓦氏菌C2J1、海氏腸球菌M1R）進(jìn)行后續(xù)菌株生物學(xué)和產(chǎn)蛋白酶的酶學(xué)特性分析。

表2 菌株產(chǎn)蛋白酶活力Table 2 Activities of protease produced by the strains

2.3 菌株的生物學(xué)特性分析

2.3.1 菌株的最適生長(zhǎng)溫度 菌株的生長(zhǎng)受溫度影響，5 株菌株在不同溫度條件下培養(yǎng)24 h 的生長(zhǎng)情況如圖3 所示，37 ℃左右時(shí)5 株菌在LB 液體培養(yǎng)基中OD600nm普遍達(dá)到0.6～0.7，吸光度值較高，說(shuō)明各菌株在此溫度下生長(zhǎng)情況良好。在25 ℃時(shí)，菌株藤黃色微球菌C1Y1、貝萊斯芽孢桿菌S1YB 的OD600nm出現(xiàn)一定程度升高，具體原因有待于進(jìn)一步分析，可能與其對(duì)溫度適應(yīng)性有關(guān)。相關(guān)研究表明藤黃色微球菌[19]、芽孢桿菌[20]以及黏質(zhì)沙雷氏菌[21]生長(zhǎng)比較適合的溫度為37 ℃，不同株之間可能由于受到分離環(huán)境影響而有所差異。

圖3 溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響Fig. 3 Effects of temperature on bacterial growth

2.3.2 pH 值對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響 pH 值是影響菌株生長(zhǎng)的另一個(gè)重要因素，也會(huì)在一定程度上影響其所分泌的蛋白酶活性[22]。不同pH 值條件對(duì)菌株生長(zhǎng)影響如圖4 所示，5 株菌在pH 1.5～4.5 范圍內(nèi)OD600nm值較低，說(shuō)明在此pH 值下菌株生長(zhǎng)受到抑制；隨著pH 值升至4.5 左右時(shí)，菌株OD600nm值有明顯上升，pH 5.5 左右時(shí)達(dá)到最高為0.7，pH 5.5～6.5 之間菌株生長(zhǎng)趨于平緩。其中貝萊斯芽孢桿菌S1YB 相對(duì)于其它菌株生長(zhǎng)能力較弱，其原因可能與菌株本身特性或菌株對(duì)營(yíng)養(yǎng)的不同需求有關(guān)；黏質(zhì)沙雷氏菌S2DB 在趨近于中性偏堿性條件下生長(zhǎng)能力較好，與其它研究發(fā)現(xiàn)的黏質(zhì)沙雷氏菌在pH 為8.0 偏堿性條件下菌株生長(zhǎng)能力更好的相關(guān)結(jié)果具有一致性[23]。

圖4 不同pH 值對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響Fig. 4 Effects of different pH values on bacterial growth

2.3.3 菌株的耐鹽能力分析 鹽質(zhì)量濃度的變化會(huì)通過(guò)改變細(xì)胞滲透壓影響菌株生長(zhǎng)。不同菌株耐鹽能力分析結(jié)果如圖5 所示。在10～20 g/L 范圍，隨鹽質(zhì)量濃度升高，菌株能夠生長(zhǎng)，OD600nm值升高，在20 g/L 時(shí)達(dá)到最大值，隨后各菌株OD600nm值隨鹽質(zhì)量濃度增加呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，說(shuō)明菌株生長(zhǎng)受到抑制（P＜0.05）。

圖5 不同鹽質(zhì)量濃度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響Fig. 5 Effects of different salt mass concentrations on bacterial growth

2.4 菌株蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.4.1 溫度對(duì)酶活力的影響 溫度會(huì)影響蛋白酶活力發(fā)揮，溫度對(duì)粗酶活性影響如圖6 所示。研究發(fā)現(xiàn)，不同菌株提取的粗酶液在不同溫度下酶活力大小不同，在10～60 ℃內(nèi)，酶活力隨溫度升高整體呈現(xiàn)上上的趨勢(shì)，在40～50 ℃左右酶活性相對(duì)較高。相對(duì)于其它菌株來(lái)說(shuō)，芽孢桿菌所產(chǎn)蛋白酶活力在一定溫度范圍內(nèi)都可以保持穩(wěn)定[24]。這與本研究所分離所分離貝萊斯芽孢桿菌S1YB 酶活力變化抑制，S1YB 在試驗(yàn)溫度范圍內(nèi)整體酶活相對(duì)其它菌株所產(chǎn)酶活較高，且呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，未出現(xiàn)酶活下降的情況。

圖6 溫度對(duì)蛋白酶活性的影響Fig. 6 Effects of temperature on protease activity

2.4.2 pH 值對(duì)酶活力的影響 pH 值對(duì)酶活力影響如圖7 所示。貝萊斯芽孢桿菌SIYB 所分泌的蛋白酶在一定pH 值范圍內(nèi)呈現(xiàn)出較高酶活力，且在pH 值為7.0 時(shí)最為穩(wěn)定；黏質(zhì)沙雷氏菌S2DB和海藻希瓦氏菌C2J1 分泌的蛋白酶也在pH 7時(shí)最為穩(wěn)定；藤黃色微球菌C1Y1 和海氏腸球菌M1R 分別在pH 值為6.0（偏酸性）和8.0（偏堿性）下較為穩(wěn)定。其中，芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶對(duì)熱和pH值的穩(wěn)定性相對(duì)較高[25-26]，與本研究所分離貝萊斯芽孢桿菌S1YB 產(chǎn)蛋白酶酶活力在pH 值變化下酶活力的變化情況一致，S1YB 所產(chǎn)蛋白酶活力在相同pH 值下均高于其它菌株所產(chǎn)蛋白酶酶活力。

圖7 pH 值對(duì)蛋白酶活力的影響Fig. 7 Effects of pH value on protease activity

2.4.3 金屬離子和抑制劑對(duì)酶活力的影響 在食品的加工過(guò)程中添加的Na+、K+、Ca2+、Fe2+、Fe3+、Zn2+、Cu2+等金屬離子也會(huì)在一定程度上影響蛋白酶活力[27-28]。本研究以不添加金屬離子的粗酶液作為對(duì)照，研究了1 mmol/L 和10 mmol/L 上述金屬離子添加對(duì)5 株菌株所分泌蛋白酶相對(duì)酶活力影響，結(jié)果如表3 和表4 所示。研究發(fā)現(xiàn)添加金屬離子后5 株菌株所分泌的蛋白酶相對(duì)活力產(chǎn)生了不同程度的下降，下降程度與金屬離子的類(lèi)型和金屬離子的添加量有關(guān)。

表4 10 mmol/L 金屬離子和抑制劑對(duì)5 株菌產(chǎn)蛋白酶相對(duì)酶活力的影響Table 4 Effects of 10 mmol/L metal ions and inhibitors on the relative protease activity produced by five stains

金屬離子能提高或者降低蛋白酶的穩(wěn)定性[29]。Na+的添加可能改變蛋白酶的結(jié)構(gòu)，在10 mmol/L 的Na+作用下，雖然菌株整體蛋白酶活力有所降低，但貝萊斯芽孢桿菌S1YB、藤黃色微球菌C1Y1、海藻希瓦氏菌C2J1 相對(duì)于1 mmol/L 的Na+作用相對(duì)增強(qiáng)；在上述兩個(gè)濃度的Ca2+作用下也發(fā)現(xiàn)類(lèi)似趨勢(shì)，Ca2+在一定溫度條件內(nèi)可穩(wěn)定蛋白酶結(jié)構(gòu)，提高蛋白酶活力，有研究發(fā)現(xiàn)一株從海洋環(huán)境中分離出的葡萄球菌BUU1，在添加Ca2+共孵育培養(yǎng)48 h 后其產(chǎn)蛋白酶活力提升了44%，很多研究表明Ca2+在提高蛋白酶活力和熱穩(wěn)定性中起到了非常重要的作用[30]。Fe2+和Fe3+的加入對(duì)菌株蛋白酶活性抑制作用明顯，可能與鐵離子與酶活性中心基團(tuán)結(jié)合從而造成蛋白酶活性降低或失活有關(guān)[31]。Cu2+的添加也使得包括貝萊斯芽孢桿菌S1YB、藤黃色微球菌C1Y1、海藻希瓦氏菌C2J1菌株在內(nèi)的菌株蛋白酶活力大幅降低，可能與Cu2+造成蛋白酶活力失效有關(guān)。抑制劑EDTA 在上述濃度下對(duì)蛋白酶活性的降低也十分顯著，推測(cè)本研究分離菌株所產(chǎn)蛋白酶為半胱氨酸類(lèi)酶或金屬蛋白酶，因?yàn)檫@類(lèi)酶活性容易受到EDTA 的影響。

3 結(jié)論

本研究從發(fā)酵海產(chǎn)品中分離出10 株產(chǎn)蛋白酶菌株，并對(duì)其中5 株產(chǎn)蛋白酶活力相對(duì)較高的菌株貝萊斯芽孢桿菌S1YB、黏質(zhì)沙雷氏菌S2DD、藤黃色微球菌C1Y1、海藻希瓦氏菌C2J1、海氏腸球菌M1R 進(jìn)行后續(xù)生物學(xué)和酶學(xué)特性分析。研究發(fā)現(xiàn)菌株最適生長(zhǎng)溫度在37 ℃左右，在低pH 值（＜4.5）時(shí)幾乎不生長(zhǎng)，最適pH 值為6.0～8.0，在鹽質(zhì)量濃度范圍10～70 g/L 菌株均呈現(xiàn)一定耐受性，最適鹽質(zhì)量濃度為20 g/L，相比于其它菌株，貝萊斯芽孢桿菌S1YB 耐鹽性較弱。酶學(xué)特性研究結(jié)果表明菌株蛋白酶活性穩(wěn)定性為50 ℃，pH 7.0，不同濃度（1 mmol/L 和10 mmol/L）金屬離子和抑制劑會(huì)造成菌株產(chǎn)生的蛋白酶活性降低。

后續(xù)可考慮對(duì)菌株蛋白酶類(lèi)型和底物作用的特異性等方面進(jìn)行深入研究，并在海產(chǎn)品的發(fā)酵過(guò)程中考慮提高有益微生物例如貝萊斯芽孢桿菌和海氏腸球菌等的比例，控制腐敗微生物黏質(zhì)沙雷氏菌的數(shù)量及控制其蛋白酶的產(chǎn)生，并討論以有益微生物作為發(fā)酵劑發(fā)酵海產(chǎn)品對(duì)其風(fēng)味的影響。