微波加熱下表沒食子兒茶素對海鱸魚肌球蛋白氧化的影響

李穎暢，董高緣，崔 蕾，儀淑敏，呂艷芳

（渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心 遼寧錦州 121013）

海鱸魚具有較高的營養(yǎng)價值，不僅蛋白質(zhì)含量高，還含有多種微量元素和不飽和脂肪酸[1]。然而，在水產(chǎn)品熱加工過程中，容易造成過氧化，影響蛋白質(zhì)的功能特性，同時對人體健康產(chǎn)生一定影響。傳統(tǒng)的熱處理方法存在加熱不均勻和蒸煮損失高等問題，影響食品的品質(zhì)和風(fēng)味。為了抑制蛋白質(zhì)的過度氧化，一些研究者通過改變加熱方式和添加食品添加劑等方式抑制蛋白質(zhì)過度氧化[2]。微波加熱是一種非直接加熱且快速的烹飪方法。微波可以通過極性分子的快速振動，均勻地轉(zhuǎn)換熱能，減少氧化程度和營養(yǎng)元素損失[3]。肌球蛋白是肌肉中的主要蛋白，占魚肉總蛋白含量的30%～36%，也是橫紋肌細胞中表達量最豐富的蛋白，在魚肉功能、營養(yǎng)和感官特征方面發(fā)揮著重要作用[4]。茶多酚具有抗氧化活性，被廣泛用于食品加工中。表沒食子兒茶素（EGC）是茶多酚的中有效成分之一。關(guān)于EGC 在熱加工過程中是如何對肌肉中的蛋白質(zhì)起到保護作用的，目前還沒有明確的解釋。本文研究微波加熱下EGC 與海鱸魚肌球蛋白間的相互作用，EGC 對海鱸魚肌球蛋白的影響，并利用分子動力學(xué)模擬輔助解釋EGC 對蛋白質(zhì)的抗氧化機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海鱸魚購于中國遼寧省錦州市林西路水產(chǎn)市場，海鱸魚的質(zhì)量為（1.65±0.11）kg?；铙w運輸至實驗室，宰殺后去皮取背部肌肉，并于4 ℃下貯存。

苯甲基磺酰氟（PMSF）、E-64，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；β-巰基乙醇，上海麥克林生物有限公司；EGC（＞97%），上海源葉生物科技有限公司；2,5-二甲基苯甲醛（DNPH）、5,5'-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（DTNB），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS），Sigma-Aldrich 公司。BCA 蛋白質(zhì)含量測試盒、SDS-PAGE制膠試劑盒，北京索萊寶有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

XE-70 原子力顯微鏡（AFM），韓國帕克股份有限公司；Chirascan V100 圓二色光譜儀，英國應(yīng)用光物理公司上海代表處；F-7000 熒光分光光度計，日立科學(xué)儀器（北京）有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品制備和處理 肌球蛋白的提取參考Dai 等[5]的方法。肌球蛋白-EGC 液制備方式如下：肌球蛋白沉淀溶解于20 mmol/L Tris-HCl（0.5 mol/L NaCl，pH 7.0），并與不同質(zhì)量濃度的EGC溶液按照比例混合均勻，蛋白最終質(zhì)量濃度10 mg/mL，EGC 的最終質(zhì)量濃度為20，40，60 μg/mL，總體積為50 mL。對照組為僅添加超純水的肌球蛋白液。50 mL 的肌球蛋白-EGC 液在微波爐中（400 W）加熱90 s，加熱完成后立即放入冰浴中冷卻，并放入4 ℃冰箱中備用。

1.3.2 蛋白羰基含量的測定 蛋白質(zhì)羰基含量參照于小番[6]的方法測定。

1.3.3 蛋白總巰基含量的測定 稱取2.00 g 碎魚肉與10 mL，50 mmol/L 磷酸鈉緩沖液（pH 6.0）混合、均質(zhì)，并離心10 min（12 000 r/min，4 ℃），取上清液測定蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，控制在5 mg/mL 以內(nèi)。總巰基含量測定參考Jiang 等[7]的方法。

1.3.4 二聚酪氨酸含量的測定 調(diào)整肌球蛋白-EGC 中的蛋白質(zhì)量濃度為1 mg/mL。測定樣品的熒光發(fā)射光譜，發(fā)射波長為420 nm，激發(fā)波長為325 nm，發(fā)射和激發(fā)狹縫寬度均為2.5 nm。

1.3.5 肌球蛋白內(nèi)源熒光和同步熒光強度的測定熒光測定參照Zhang 等[8]和Wu 等[9]的方法。將樣品蛋白的質(zhì)量濃度調(diào)整為0.5 mg/mL。內(nèi)源熒光測量條件為λex為295 nm，λem為310～510 nm。同步熒光：λem為260～510 nm，Δλ（Δλ=λem-λex）設(shè)置為15 nm 和60 nm，分別代表酪氨酸和色氨酸的微環(huán)境。所有激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度設(shè)置為2.5 nm。

1.3.6 肌球蛋白二級結(jié)構(gòu)的變化 將樣品蛋白的質(zhì)量濃度調(diào)整至0.2 mg/mL，圓二色譜測定參考Xu[10]等的方法。測試條件：1 mm 比色皿，掃描波長為195～260 nm，掃描速度為60 nm/min。

1.3.7 蛋白微觀結(jié)構(gòu)的測定 調(diào)整樣品的蛋白質(zhì)量濃度為20 μg/mL。樣品滴在無菌干凈的云母片上，4 ℃烘干。干燥后的樣品用超純水洗滌3 次，去除多余的鹽分。掃描范圍為10 μm×10 μm。

1.3.8 肌球蛋白與EGC 分子對接及分子動力學(xué)模擬 同源建模及模型評估方法參考Zhang 等[11]的方法。模板選自NCBI 數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/），NCBI 參考序列為XP_028442143.1。將XP_028442143.1 的目標(biāo)模板放入SWISSMODEL（https：//swissmodel.expasy.org/），選取相似度30%以上的模板建立相應(yīng)的3D 結(jié)構(gòu)。通過SAVES6.0（https：//saves.mbi.ucla.edu/）中WITHCHECK、PROCHECK、ERRAT、PROVE 和VERIFY 3D 內(nèi)嵌程序?qū)λx模板構(gòu)建三維結(jié)構(gòu)的適用性和合理性進行評價。選擇質(zhì)量評分最高的肌球蛋白3D 結(jié)構(gòu)（PDB ID：6YSY.1）進行分子模擬。EGC（Pubchem CID：72277）的三維結(jié)構(gòu)由Pub-Chem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取。

肌球蛋白和EGC 之間的相互作用由BIOVIA Discovery studio 2017 R2 客戶端模擬。6YSY.1 在對接之前進行能量優(yōu)化，去除水加氫，EGC 則進行能量最小化，采用CDOCKER 方法對接。肌球蛋白-EGC 復(fù)合物的加熱穩(wěn)定性在Gromacs 2019.4程序中進行模擬。分子動力學(xué)模擬的參數(shù)參考Harish 等[12]和Zhang 等[11]的試驗參數(shù)。

1.3.9 數(shù)據(jù)分析 采用Origin 2022 和SPSS 25.0進行統(tǒng)計學(xué)分析和數(shù)據(jù)處理，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

1.2.4 基因型分析 研究對象均在空腹?fàn)顟B(tài)下抽取靜脈血，放置抗凝管抗凝，分離血液的白細胞層。用試劑盒提取血白細胞的DNA（試劑盒購自美國NEB公司），DNA提取后置低溫冰箱（-80℃）保存?zhèn)溆?。全部?biāo)本收齊后用PCR-LDR方法進行ALDH2 Glu487Lys基因多態(tài)分析，基因型分為野生型純合子（G/G）、變異型純合子（A/A）及雜合子基因型（G/A）。采用專門軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 肌球蛋白羰基含量變化

如圖1 所示，微波前，對照組的羰基含量為0.76 nmol/mg pro，EGC 處理組的羰基含量與對照組無顯著差別（P＞0.05）。微波加熱后，不同處理肌球蛋白的羰基含量顯著升高，微波加熱后對照組的羰基含量達到最高，為5.60 nmol/mg pro，這表明微波加熱誘導(dǎo)蛋白發(fā)生氧化，蛋白質(zhì)的氧化保護作用被打破，活性氧（ROS）、酶、游離鐵等促氧化成分增加[13-14]。相比對照組，EGC 處理組的羰基含量顯著降低（P＜0.05），而且隨EGC 質(zhì)量濃度的增加而減少。EGC 延緩羰基含量升高的原因可能是EGC 的羥基與肽鏈的羰基發(fā)生反應(yīng)，形成氫鍵，減少羰基化反應(yīng)。另一方面，EGC 具有抗氧化能力，可保護氨基酸側(cè)鏈，防止其氧化。EGC 能通過非共價作用和共價作用與肌球蛋白形成更為穩(wěn)定的化合物，抵抗微波加熱帶來的氧化攻擊。

圖1 EGC 對肌球蛋白羰基含量的影響Fig. 1 Effects of EGC on carbonyls content of myosin

圖2 EGC 對肌球蛋白的總巰基含量的影響Fig. 2 Effects of EGC on total sulfhydryl content of myosin

2.2 肌球蛋白總巰基變化

總巰基的含量反映了蛋白質(zhì)的氧化程度，游離巰基在蛋白質(zhì)的穩(wěn)定構(gòu)象中起著重要作用。巰基的氧化可分為2 種類型：可逆氧化主要形成二硫鍵，不可逆氧化主要形成磺酸和次磺酸等物質(zhì)[15]。對照組微波處理前總巰基含量顯著（P<0.05）高于微波處理后總巰基含量。微波處理前，對照組總巰基含量最高，為279.49 nmol/mg pro。隨EGC 質(zhì)量濃度的增加，總巰基含量減少。微波處理前巰基基團的下降可以解釋為EGC 的羥基通過非共價鍵和共價鍵與蛋白質(zhì)巰基基團發(fā)生相互作用，降低了總巰基含量。微波處理后，對照組總巰基含量顯著下降，可能是因為微波誘導(dǎo)肌球蛋白巰基發(fā)生氧化，而EGC 組總巰基含量無顯著性變化，是因為EGC 的羥基通過非共價鍵和共價鍵與蛋白質(zhì)巰基基團發(fā)生相互作用。

2.3 二聚酪氨酸含量的變化

酪氨酸易受到ROS 的攻擊而形成酪氨酸自由基，而酪氨酸自由基會與另一種酪氨酸自由基反應(yīng)生成二聚酪氨酸，并繼續(xù)從巰基基團中奪取氫原子，還會促進蛋白質(zhì)中二硫鍵的生成。二聚酪氨酸通常代表酪氨酸的損失和蛋白質(zhì)的氧化聚集程度[16]。由圖3 可知，微波后的二聚酪氨酸相對含量整體上顯著高于微波前的二聚酪氨酸含量，提示微波加熱會促進酪氨酸形成二聚體[17]。微波加熱后，與對照組相比，添加EGC 的肌球蛋白的二聚酪氨酸含量顯著（P<0.05）低于對照組，且與EGC 的質(zhì)量濃度呈負相關(guān)關(guān)系，說明EGC 降低了體系中氧化水平，阻止自由基攻擊酪氨酸殘基，減少了二聚酪氨酸的生成。同時，EGC 可以有效保護巰基，阻止酪氨酸自由基從巰基基團中奪取氫原子，阻止二聚酪氨酸的生成。

圖3 EGC 對肌球蛋白二聚酪氨酸的影響Fig. 3 Effects of EGC on dityrosine content of myosin

2.4 肌球蛋白內(nèi)源熒光和同步熒光的變化

內(nèi)源熒光可以反映肌球蛋白的三級結(jié)構(gòu)狀態(tài)，同步熒光常用于了解酪氨酸和色氨酸周圍微環(huán)境的變化。由圖4a 可知，微波之前，EGC 質(zhì)量濃度的增加導(dǎo)致內(nèi)源熒光強度降低，這與Zhao 等[18]報道的結(jié)果一致，即膠原蛋白和酪蛋白與單寧酸和沒食子酸結(jié)合后，蛋白出現(xiàn)熒光猝滅現(xiàn)象。EGC因含有大量的羥基易與蛋白質(zhì)相互作用，致使熒光基團周圍的微環(huán)境極性增強，導(dǎo)致熒光衰減和猝滅[10]。由圖4b 可知，微波處理后，內(nèi)源熒光強度顯著增強。內(nèi)源熒光強強度的升高可能是因為微波加熱可以使肌球蛋白展開，暴露更多含有熒光基團的氨基酸殘基導(dǎo)致其熒光強度升高[19]。隨著EGC 質(zhì)量濃度的升高，熒光強度降低，說明EGC有效保護了肌球蛋白的三級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，阻止肽鏈過度伸展和蛋白質(zhì)的熱解。

圖4 不同質(zhì)量濃度的肌球蛋白-EGC 熒光特性的變化Fig. 4 Changes of different mass concentrations EGC-myosin in fluorescence characteristics

2.5 肌球蛋白二級結(jié)構(gòu)變化

海鱸魚肌球蛋白中α-螺旋含量為72.50%，β-折疊含量為3.80%，β-轉(zhuǎn)角含量為11.00%，無規(guī)則卷曲含量為11.70%（表1）。α-螺旋結(jié)構(gòu)是肌球蛋白中占主導(dǎo)地位的二級結(jié)構(gòu)，維持著肌球蛋白的穩(wěn)定性。微波加熱前，隨著EGC 質(zhì)量濃度增加，α-螺旋結(jié)構(gòu)含量呈先上升后下降趨勢，添加60 μg/mL EGC 組肌球蛋白的α-螺旋顯著下降。β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲隨著EGC 質(zhì)量濃度增加呈先降低后上升趨勢。酚類物質(zhì)可以通過氫鍵、疏水相互作用和靜電相互作用增強蛋白質(zhì)α-螺旋含量和穩(wěn)定性[20-21]。60 μg/mL EGC 降低二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋含量，說明高質(zhì)量濃度的多酚可能會促使蛋白質(zhì)肽鏈發(fā)生過度伸展并發(fā)生了空間的重排，降低了肌球蛋白二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。微波加熱后，對照組和EGC 處理組的α-螺旋降低，而β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲含量增加。隨著EGC質(zhì)量濃度是升高，α-螺旋含量先上升后下降趨勢，20 μg/mL EGC 組的α-螺旋含量高于對照組。Al-Shabib 等[22]的研究中也發(fā)現(xiàn)10 μmol/L 蘆丁相較于5 μmol/L 反而降低了β-乳球蛋白的α-螺旋含量。酚類物質(zhì)質(zhì)量濃度對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的有序性和穩(wěn)定性同樣有很大的影響。

表1 不同樣品肌球蛋白的二級結(jié)構(gòu)含量的變化Table 1 Changes of secondary structure content of myosin in different samples

2.6 蛋白微觀結(jié)構(gòu)變化

通過原子力顯微鏡觀察蛋白質(zhì)的微觀形態(tài)，可以在不破壞樣品的情況下反映蛋白質(zhì)的表面形態(tài)和空間上顆粒大小分布。圖5 是肌球蛋白與不同質(zhì)量濃度的EGC 結(jié)合后其微觀結(jié)構(gòu)的變化。天然的肌球蛋白一般以無序單體和微聚集體的形式分布在載體表面，其最大峰高不超過40 nm。隨著EGC 質(zhì)量濃度的升高，蛋白層的厚度明顯降低，EGC 處理組的肌球蛋白小聚集體變得細密、更分散，且最大峰高降低至12～40 nm，并均勻分布在載體表面。此外，60 μg/mL EGC 處理組的肌球蛋白形成大聚集體，且峰高升至50 nm，說明高質(zhì)量濃度的EGC 容易引起肌球蛋白的過度聚集和交聯(lián)，對蛋白質(zhì)的微觀結(jié)構(gòu)有影響。

圖5 肌球蛋白-EGC 微觀結(jié)構(gòu)變化Fig. 5 Microstructural changes of EGC-myosin

微波處理后，大量的肌球蛋白聚集成更大的肌球蛋白簇，說明微波加熱誘導(dǎo)可促進肌球蛋白向高度聚集和無序狀態(tài)轉(zhuǎn)變。對照組的肌球蛋白形成直徑最大，形成峰值最高的蛋白聚集體（300 nm），且蛋白分布在載體表面粗糙且不均勻。與對照組相比，隨著EGC 質(zhì)量濃度的升高，肌球蛋白聚集體直徑變小，峰值變低（120～160 nm），表面逐漸變得平滑。然而，60 μg/mL EGC 處理過的肌球蛋白，重新出現(xiàn)不均勻的團塊，并且彼此之間距離較近，分布較密集，載體表面的粗糙度上升。先前的研究已經(jīng)證明茶多酚可以通過釋放亞基降低肌原纖維的高度和直徑；然而，隨著茶多酚含量的增加，它可以附著在肌原纖維上，增強分子間的相互作用，使其再次聚集[23]。EGC 的加入雖然不能完全阻止肌球蛋白的熱聚集，但也顯著降低了肌球蛋白的氧化聚集程度。

2.7 分子動力學(xué)模擬EGC-肌球蛋白穩(wěn)定性分析

均方根偏差（Root mean square deviation,RMSD）表示某一時刻的構(gòu)象與目標(biāo)構(gòu)象所有原子偏差的加和，是衡量體系是否穩(wěn)定的重要依據(jù)。從圖6a 可以看出，在電場和溫度的作用下，相對于未微波加熱條件下的純肌球蛋白體系的RMSD值，微波加熱條件的純肌球蛋白、肌球蛋白-EGC復(fù)合物體系的RMSD 值在5 ns 之后就出現(xiàn)明顯地升高，蛋白結(jié)構(gòu)處于一個不穩(wěn)定的狀態(tài)。在0～100 ns 時間未施加微波電場和升溫條件的肌球蛋白的RMSD 值為0.319±0.067，而加微波電場和升溫條件的肌球蛋白、肌球蛋白-EGC 復(fù)合物在0～100 ns 時間段的RMSD 值分別為（0.458±0.114）和（0.389±0.80），從整個模擬時間體系來看，肌球蛋白-EGC 結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性大于肌球蛋白穩(wěn)定性，這說明肌球蛋白與EGC 的復(fù)合物在微波加熱下結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。

圖6 肌球蛋白-EGC 分子動力學(xué)模擬Fig. 6 Molecular dynamicssimulation of EGC-myosin

圖6b 為蛋白模擬前、后蛋白氨基酸殘基均方根（Root mean square fluctuation,RMSF）的漲落變化，該值表示蛋白質(zhì)氨基酸殘基的柔性大小和蛋白質(zhì)原子的平均遷移率，可以了解到具體的氨基酸殘基的靈活性的變化。從圖中可以看出，施加升溫電場的肌球蛋白、肌球蛋白-EGC 體系的RMSF 值在大部分序列上是增加的，且都高于天然的肌球蛋白。RMSF 值的順序為：升溫電場下的肌球蛋白＞肌球蛋白-EGC＞天然肌球蛋白，說明肌球蛋白-EGC 在升溫電場下穩(wěn)定性更高，氨基酸殘基的遷移率更小。施加升溫電場的肌球蛋白在0～50，120～180，260～280，380～420 位和500～580 位殘基處出現(xiàn)波動較大；肌球蛋白-EGC 則是在0～50，380～400 位和500～580 位殘基出現(xiàn)波動較大。EGC 處理后的肌球蛋白的殘基相較于施加升溫電場的對照組變化較小，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。

圖6c 為蛋白與模擬體系中溶劑水分子之間形成的氫鍵數(shù)量隨時間的變化，氫鍵是穩(wěn)定蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的主要的作用力，對α-螺旋和β-折疊有決定性作用；同樣的，氫鍵還會影響蛋白質(zhì)之間的非共價相互作用。在整個100 ns 的模擬時間內(nèi)，未施加電場和溫度的肌球蛋白與周圍的水分子形成大量的氫鍵，且在整個過程中氫鍵數(shù)量維持同一個水平上，無減少的趨勢。升溫電場下，肌球蛋白、肌球蛋白-EGC 復(fù)合物體系的氫鍵數(shù)量下降，穩(wěn)定性也隨之下降，說明升溫電場會破壞肌球蛋白質(zhì)分子間的氫鍵相互作用，從而會迫使蛋白質(zhì)肽鏈伸展，暴露出疏水基團，減少與水分子之間的相互作用。在80 ns 后，升溫電場下的氫鍵含量下降變緩，可能是因為此時升溫對蛋白質(zhì)氫鍵的破壞作用與電場促使蛋白質(zhì)多肽鏈之間碰撞產(chǎn)生新的氫鍵的形成動態(tài)平衡，所以氫鍵含量較為穩(wěn)定。80 ns 后，與升溫電場下的對照組相比，肌球蛋白-EGC 的氫鍵含量曲線的收斂性要小，表明肌球蛋白與EGC 之間的復(fù)合物在升溫電場中氫鍵的斷裂和生成的波動較小，結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定。

圖6d 為蛋白的可溶及表面積隨時間的變化?？扇芗氨砻娣e可以反映體系中溶劑所能觸及到的面積大小。值越大，疏水性基團暴露出來的越多，結(jié)構(gòu)致密性越差，與水的接觸面積越高。加熱前對照組與加熱后肌球蛋白-EGC 的可溶及表面積變化趨勢和值沒有太大的差異，都明顯低于加熱后對照組的值。未加電場和溫度時，肌球蛋白的可溶及表面積維持較低水平，是因為此時肌球蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，多肽鏈未伸展，與水分子接觸面積小。隨著溫度的升高和電場的作用，肌球蛋白的可溶及表面積增加，是由于微波電場致使穩(wěn)定蛋白質(zhì)分子三級結(jié)構(gòu)的相互作用被破壞，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開暴露出內(nèi)部疏水腔體，增加與水的接觸面積。升溫電場下的肌球蛋白-EGC，可溶及表面積更接近于天然結(jié)構(gòu)，可能是由于氨基酸殘基側(cè)鏈與EGC 結(jié)合后，維持了結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，氨基酸殘基靈活性變化較小，蛋白質(zhì)肽鏈未舒展完全。此外，因為EGC進入了肌球蛋白的疏水性腔體之間，形成了氫鍵和疏水相互作用，所以在一定程度上穩(wěn)定了肌球蛋白的結(jié)構(gòu)，從而使其在升溫電場下的變化不如對照組的變化大，即EGC 與肌球蛋白結(jié)合之后，提升了其在微波升溫的條件下結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性?？偟膩碚f，肌球蛋白會因為振蕩電場升溫環(huán)境失去必要的二級結(jié)構(gòu)從而穩(wěn)定性降低，而與EGC 結(jié)合之后，可以有效地維持蛋白質(zhì)在振蕩電場升溫環(huán)境下肌球蛋白的穩(wěn)定性。

2.7.2 分子動力學(xué)模擬微波電場下肌球蛋白與EGC 結(jié)合能分析從圖7 可知，小分子配體與Lys599、Asn600 形成氫鍵，氫鍵的距離為1.9 ? 和1.7 ?。此外，小分子配體與Leu270、Ile481、Val650、Leu476 的碳原子形成疏水作用，距離分別為4.2，5.6，3.6，4.1 ?。

圖7 肌球蛋白-EGC 分子對接圖Fig. 7 Molecular docking of EGC-myosin

圖8 為肌球蛋白與EGC 之間結(jié)合自由能的分解圖，包括范德華力（van der Waal energy）、靜電能（Electrostatic energy）、極性溶劑化能（Polar solvation energy）以及疏水作用（SASA energy）。由圖8 可知，肌球蛋白與EGC 之間的范德華力為-174.299 kJ/mol，靜電能為-65.998 kJ/mol，極性溶劑化能為157.656 kJ/mol，疏水作用為-16.380 kJ/mol，總的結(jié)合能為-99.021 kJ/mol。范德華作用力和靜電作用力為兩者之間的主要作用力，在結(jié)合能的貢獻上占據(jù)主要地位。從表2 可知，對配體結(jié)合由重要影響的氨基酸殘基包括Leu-270、Leu-476、Val-650 等。

圖8 EGC 與蛋白之間的相互作用能量分解Fig. 8 Energy decomposition of interaction between EGC and myosin

3 結(jié)論

1）在微波加熱場中，肌球蛋白與EGC 結(jié)合顯著延緩肌球蛋白的羰基和二聚酪氨酸含量升高；延緩了總巰基含量的降低，減少微波熱誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)聚集和交聯(lián)。

2）與EGC 結(jié)合后的肌球蛋白熒光強度隨EGC 質(zhì)量濃度升高而降低，產(chǎn)生熒光猝滅。微波加熱后，肌球蛋白熒光強度升高，肌球蛋白-EGC 延緩了熒光強度升高，EGC 穩(wěn)定了肌球蛋白的空間結(jié)構(gòu)。

3）微波加熱之前，一定質(zhì)量濃度的EGC 可以促進肌球蛋白的二級結(jié)構(gòu)有序性和穩(wěn)定性。微波加熱后，僅20 μg/mL EGC 保留較多的α-螺旋，保護了蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。與EGC 結(jié)合后肌球蛋白的聚集體明顯變小，分散均勻、表面逐漸變光滑。

4）分子對接和分子動力學(xué)模擬技術(shù)，模擬肌球蛋白-EGC 體系在微波升溫電場下的穩(wěn)定性（RMSD、RMSF、氫鍵和SASA）以及結(jié)合能的分析，發(fā)現(xiàn)EGCG 和EGC 都能改善肌球蛋白的在微波升溫電場中的穩(wěn)定性。