外源AHLs 培養(yǎng)下熒光假單胞菌qPCR 內(nèi)參基因的篩選

崔方超，王蕓婷，王當(dāng)豐，檀茜倩，李秋瑩，勵建榮*，李婷婷

（1 渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心中國輕工業(yè)海水魚加工重點實驗室 遼寧錦州121013 2 大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 遼寧大連 116600）

實時熒光定量PCR（Quantitative real-time PCR，qPCR）因特異性強、靈敏度高、定量準確、高通量、操作簡便等優(yōu)點，而被廣泛應(yīng)用于基因表達的研究中[1]。qPCR 檢測基因表達水平的定量方法分為絕對定量和相對定量。相較于相對定量法，使用絕對定量法需要構(gòu)建不同梯度稀釋的標(biāo)準品并繪制標(biāo)準曲線來計算目的基因模板的起始量，操作更為繁瑣且增加了試驗難度[2]。因此，在使用qPCR 檢測基因表達水平時大多采用相對定量法，通常需要引入一個在不同樣本內(nèi)表達穩(wěn)定的基因作為內(nèi)參基因，從而校準目的基因的表達量[3]。常用的內(nèi)參基因有GAPDH（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）、ACT（肌動蛋白）、TUB（微管蛋白）、His（組蛋白）、16S rRNA（16S 核糖體RNA）等。大量研究表明，上述內(nèi)參基因有可能因物種、生長階段或發(fā)育條件的不同而表達不穩(wěn)定，因此，需要根據(jù)試驗條件選擇能夠穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因來保證qPCR 結(jié)果準確可靠[4-6]。

熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）屬于革蘭氏陰性需氧桿菌，具有脂解和蛋白水解活性，是奶類[7]、水產(chǎn)品[8]、肉制品[9]等食品在冷藏條件下的優(yōu)勢腐敗菌。熒光假單胞菌能產(chǎn)生生物被膜、胞外蛋白酶、嗜鐵素等多種致腐因子，導(dǎo)致食品腐敗變質(zhì)，分泌酮類、醛類、醇類等多種揮發(fā)性有機化合物，散發(fā)令人不快的氣味[8，10-11]。作為常見的致病性嗜冷菌，熒光假單胞菌對環(huán)境適應(yīng)力強，其產(chǎn)生的蛋白酶和脂肪酶極其耐熱，這不僅縮短了食品的貨架期，還有可能危害到人體健康。研究表明，熒光假單胞菌的腐敗特性如生物被膜的形成、胞外蛋白酶的分泌等受群體感應(yīng)（Quorum sensing，QS）系統(tǒng)的調(diào)控[12]。QS 系統(tǒng)是一種細菌通訊機制，微生物通過信號分子監(jiān)測群體密度并激活相關(guān)基因表達來調(diào)節(jié)其生理行為以適應(yīng)環(huán)境變化[13]。近年來以熒光假單胞菌等腐敗菌的QS 系統(tǒng)為靶標(biāo)來調(diào)控其腐敗特性已成為研究熱點[14-16]。通過致腐因子的表征和腐敗基因的表達來探索食品腐敗機制，其中對腐敗基因表達水平的檢測大多采用qPCR 技術(shù)，大部分都以16S rRNA 作為內(nèi)參基因。目前內(nèi)參基因的篩選分析多圍繞動物與植物，對微生物內(nèi)參基因的研究較少，尚未有有關(guān)熒光假單胞菌在QS 方面內(nèi)參基因篩選方面的研究報道。

本文以熒光假單胞菌PF-08 為試驗菌株，根據(jù)文獻查找和前期基因組測序結(jié)果，選擇8 個候選內(nèi)參基因（dsbA、carA、rpsL、gyrB、atpD、rpoD、gltA、16S rRNA），通過qPCR 研究不同QS 信號分子培養(yǎng)下候選內(nèi)參基因的表達水平。利用geNorm[17]、Normfinder[18]、BestKeeper[19]和RefFinder[20]分析這8個候選內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性，從而篩選出合適的內(nèi)參基因，為利用qPCR 技術(shù)研究熒光假單胞菌QS 相關(guān)的致腐基因表達提供科學(xué)依據(jù)；也為其它腐敗菌在QS 方面的基因定量研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

熒光假單胞菌PF-08（從腐敗大菱鲆中分離純化）保藏于渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院。

C4-HSL、C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL、C12-HSL、C14-HSL，美國Sigma 公司；LB 肉湯，青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；固相表面RNase 清除劑、EZ-10 總RNA 小量提取試劑盒、RNase-Free DNA 清除試劑盒、Taq PCR 預(yù)混液（2X，含紅染料）、DNA Marker、4S Green 核酸染色劑、瓊脂糖，生工生物工程（上海）股份有限公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit（Perfect Real Time）試劑盒、TBPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒，寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Imark 酶標(biāo)儀、GelDoc XR+全自動凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad 公司；Legend Micro21R 臺式微量離心機、NanoDrop One 超微量紫外-可見分光光度計、Applied Biosyetems StepOne Plus 熒光定量PCR 儀，美國Thermo 公司；Eppendorf 5331梯度PCR 儀，德國Eppendorf 公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種培養(yǎng)及外源AHLs 處理 將過夜活化后的熒光假單胞菌PF-08 按照體積比1∶100 的比例接種于10 mL 含有2 μg/mL 不同類型（C4-HSL、C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL、C12-HSL、C14-HSL）外源信號分子的LB 肉湯中，以未添加外源AHLs 的LB 肉湯作為對照，28 ℃、160 r/min 搖床培養(yǎng)至OD595nm為1左右。

1.3.2 總RNA 提取與cDNA 合成取1.3.1 節(jié)的7 個菌液樣本，使用EZ-10 總RNA 小量提取試劑盒及RNase-Free DNA 清除試劑盒提取總RNA；為了防止RNA 降解，需在低溫環(huán)境下快速操作，還需要用固相表面RNase 清除劑來清潔工作環(huán)境。提取的總RNA 經(jīng)過超微量分光光度計和1.0%瓊脂糖凝膠電泳聯(lián)合檢測，分析其純度和濃度是否達標(biāo)。以檢測合格的總RNA 為模板，使用PrimeScriptTM RT reagent Kit（Perfect Real Time）試劑盒合成cDNA。

1.3.3 候選內(nèi)參基因選擇和引物設(shè)計及特異性檢測根據(jù)文獻選取8 個常見的管家基因作為候選內(nèi)參基因（表1）：dsbA、carA、rpsL、gyrB、atpD、rpoD、gltA、16S rRNA。它們要么在碳水化合物代謝中起關(guān)鍵作用，要么曾被用作系統(tǒng)發(fā)育標(biāo)記。

根據(jù)前期基因組測序結(jié)果（GenBank 登錄號：CP032618）[27]獲得候選內(nèi)參基因的序列，基于qPCR 反應(yīng)對引物特異性的要求設(shè)計這8 個內(nèi)參基因的上下游引物（表2），由上海生工生物合成。

以1.3.2 節(jié)獲得的cDNA 為模板，引物見表2，對這8 個候選內(nèi)參基因進行PCR 擴增，檢測其特異性，反應(yīng)體系和程序參照Taq PCR 預(yù)混液（2X，含紅染料）的使用說明。通過2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增后的產(chǎn)物，觀察各基因在這7 個樣本的條帶大小是否與預(yù)期一致，以及是否有雜帶產(chǎn)生。

1.4 數(shù)據(jù)分析

StepOneTMSoftware v2.3 軟件自動得出各樣本的Ct 值，利用geNorm、Normfinder、BestKeeper 3 個程序和 RefFinder 網(wǎng)站（http：//blooge.cn/RefFinder/）對數(shù)據(jù)進行分析，評估8 個候選內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性。geNorm 是Vandesompele 等[17]基于Microsoft Excel 編寫的一個Visual Basic 應(yīng)用程序（VBA），可以識別給定組織中表達最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，并確定計算可靠歸一化因子所需的最少基因數(shù)即內(nèi)參基因最佳數(shù)量。NormFinder 程序植根于基因表達的數(shù)學(xué)模型，該模型不僅能估計候選基因的總體變化，而且能估計樣本組之間的變化[18]。與上述兩個程序不同，除了比較內(nèi)參基因間的穩(wěn)定性，BestKeeper 程序還可以同時比較目的基因的表達水平，一次最多能分析100 個樣本中10 個內(nèi)參基因和10 個目的基因的表達水平[19]。RefFinder 網(wǎng)站集成了以上3 個軟件的算法和比較delta-Ct 方法[28]來對候選內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性進行排序[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA 質(zhì)量檢測

7 個樣本總RNA 的濃度和純度（A260nm/A280nm與A260nm/A230nm）通過超微量分光光度計檢測，結(jié)果見表3。根據(jù)cDNA 的反應(yīng)體系，RNA 的質(zhì)量濃度不能低于77.0 ng/μL。表3 中所有樣本總RNA的質(zhì)量濃度都較高，最低值為462.3 ng/μL，最高值為1 240.2 ng/μL。RNA 純度指示值中的A260nm、A280nm、A230nm分別代表了核酸、蛋白質(zhì)、碳水化合物的吸收峰。所有樣本總RNA 的A260nm/A280nm比值均在2.1～2.2 之間，沒有低于2.0，表示RNA 沒有受蛋白質(zhì)或酚類物質(zhì)污染；雖然略高于純RNA 的比值2.0，但沒有超過2.2，表示RNA 雖存在降解但程度不深。所有總RNA 的A260nm/A230nm均大于2.0，說明樣本沒受碳水化合物、胍鹽等污染，RNA的純度良好。從圖1 可以看到，1～7 泳道均有兩條明亮清晰的條帶分別代表28S rRNA 和18S rRNA，且沒有明顯的彌散現(xiàn)象，說明提取的總RNA 完整性較好，濃度較高且降解程度較低?？傊?，提取的總RNA 均質(zhì)量良好，可用于合成cDNA。

圖1 外源AHLs 培養(yǎng)下熒光假單胞菌的總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of total RNA of Pseudomonas fluorescens under the culture of exogenous AHLs

表3 外源AHLs 培養(yǎng)下熒光假單胞菌的總RNA 質(zhì)量檢測Table 3 Quality detection of total RNA of Pseudomonas fluorescens under the culture of exogenous AHLs

2.2 引物特異性檢測

以cDNA 為模板，通過PCR 反應(yīng)和2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測這8 個內(nèi)參基因的qPCR 引物是否具有特異性。從圖2 中可以看到這8 個候選內(nèi)參基因的PCR 產(chǎn)物大小與預(yù)期一致，且條帶清晰單一，并無引物二聚體產(chǎn)生。這8 個內(nèi)參基因的引物均具有良好的特異性，滿足qPCR 試驗對引物的要求。

圖2 候選內(nèi)參基因PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 2 Agarose gel electrophoresis of PCR products of candidate reference genes

2.3 qPCR 結(jié)果分析

由圖3 可知，8 個候選內(nèi)參基因的溶解曲線均呈現(xiàn)特異的單一信號峰，沒有產(chǎn)生非特異性雜峰，不存在引物二聚體，進一步驗證這8 個候選內(nèi)參基因的引物均特異性良好。qPCR 試驗結(jié)果準確可靠，Ct 值可以用于后續(xù)分析。

圖3 候選內(nèi)參基因qPCR 溶解曲線Fig. 3 The qPCR melting curves of candidate reference genes

Ct 值是指反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號在qPCR 擴增過程中達到閾值（軟件自動設(shè)定在從基線到指數(shù)增長的拐點）時的擴增循環(huán)數(shù)。qPCR 國際化標(biāo)準（MIQE 指南）[29]指出，Ct 值與該基因的起始模板濃度負相關(guān)，Ct 值越小則該基因在樣本中的表達豐度越高。內(nèi)參基因的Ct 值應(yīng)在10～25 之間，表達豐度過高或過低都不利于定量目的基因的表達水平。因此，由圖4 可知，16S rRNA 的Ct 值偏低，其它基因的Ct 值均在16.02～21.58 之間。比較同一內(nèi)參基因在7 個樣本間的Ct 值變化程度，由小到大依次為：gltA、rpoD、atpD、rpsL、carA、16S rRNA、dsbA、gyrB。結(jié)果表明，gltA 的Ct 值變化程度最小，表達穩(wěn)定性最高，其次是rpoD。根據(jù)Ct 值直接判斷出最適內(nèi)參基因還不夠準確，仍需要通過geNorm、Normfinder、BestKeeper 和RefFinder 進一步分析并綜合評估。

圖4 候選內(nèi)參基因qPCR 的Ct 值分布圖Fig. 4 The qPCR Ct value distribution of candidate reference genes

2.4 候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析

評估內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性的幾個程序各有不同的使用要點和分析側(cè)重點，最常用的程序是geNorm、NormFinder 和BestKeeper[30]。

內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性在geNorm 程序中表示為M 值，M 值是某一內(nèi)參基因與其它內(nèi)參基因表達水平的兩兩比值經(jīng)對數(shù)變換后的平均標(biāo)準差。以1.5 為閾值，M 值超過1.5 就表示該基因表達不穩(wěn)定，不適合作內(nèi)參基因。從圖5a 中可知較穩(wěn)定的內(nèi)參基因為atpD 和rpoD，且8 個基因的M 值均低于1.5，可被列為候選內(nèi)參基因。geNorm還可以確定內(nèi)參基因的最適數(shù)目，通過對標(biāo)準化因子進行差異分析計算配對變異V 值，選擇出2個及以上的內(nèi)參基因。以0.15 為閾值，當(dāng)Vn/n+1低于0.15，就表示用n 個基因同時作為內(nèi)參基因，取均值后定量目的基因，可以得到更可靠的試驗結(jié)果。圖5b 中的Vn/n+1值均低于0.15，則最少可選用2 個內(nèi)參基因。結(jié)合圖5a，atpD 和rpoD 作為內(nèi)參基因聯(lián)合使用，可以減少試驗誤差，更準確地分析基因表達量。

圖5 geNorm 分析候選內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性（a）和最適內(nèi)參基因數(shù)目（b）Fig. 5 geNorm analyzes the expression stability of candidate reference genes（a）and the optimal number of reference genes（b）

NormFinder 直接比較內(nèi)參基因在樣本組內(nèi)和組間的表達差異，結(jié)果用穩(wěn)定性值（SV）表示，根據(jù)SV 值大小對內(nèi)參基因進行排序，SV 值最小的基因即為最適內(nèi)參基因。從圖6 可知，基因表達最穩(wěn)定的為gltA，其次是rpsL，最不穩(wěn)定的為16S rRNA。

圖6 NormFinder 分析候選內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性Fig. 6 NormFinder analyzes the expression stability of candidate reference genes

與以上兩個程序不同，BestKeeper 直接分析各內(nèi)參基因的Ct 值，通過Ct 值計算表達水平的標(biāo)準差（SD）來評估內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，SD 值越小則基因表達越穩(wěn)定。因此，表4 中基因表達穩(wěn)定性由高到低依次為gltA>rpoD>rpsL>atpD>carA>16S rRNA>dsbA>gyrB。另外，為了評估所有候選內(nèi)參基因間的關(guān)系，BestKeeper 還進行了成對的相關(guān)分析，皮爾遜相關(guān)系數(shù)r 和P 值見表4。rpsL 與其它基因的相關(guān)性最高，其次是carA 和16S rRNA，這3 個基因也達到顯著水平（P<0.05），gltA 的相關(guān)性最低。

表4 BestKeeper 分析候選內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性Table 4 BestKeeper analyzes the expression stability of candidate reference genes

RefFinder 網(wǎng)站通過以上3 個軟件的算法和比較delta-Ct 方法對候選內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性進行比較和排名，同時根據(jù)各程序的結(jié)果采用幾何平均值法進行綜合排名。網(wǎng)站的操作很簡便，用戶只需要在窗口輸入各候選內(nèi)參基因的Ct 值，即可得出候選內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性排名。結(jié)果見表5，geNorm、Normfinder、BestKeeper 在網(wǎng)站中的排名和上面單獨使用程序得出的穩(wěn)定性排名，其結(jié)果相一致。從綜合排名來看，這8 個候選內(nèi)參基因中表達穩(wěn)定性較高的是rpoD 和gltA，穩(wěn)定性最低的是16S rRNA。因此，rpoD 和gltA 適宜選為熒光假單胞菌在外源AHLs 培養(yǎng)下基因表達的內(nèi)參基因。

表5 候選內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性排名Table 5 Expression stability ranking of candidate reference genes

3 討論與結(jié)論

熒光假單胞菌是冷藏食品的優(yōu)勢腐敗菌，其致腐因子如生物被膜、蛋白酶和脂肪酶的合成都受到QS 信號分子的調(diào)控[12，31]。在探索QS 對食品腐敗調(diào)控機制的過程中，需要用到能夠穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因來準確定量致腐基因的表達。因此，本文通過qPCR 技術(shù)研究了8 個常見的候選內(nèi)參基因（dsbA、carA、rpsL、gyrB、atpD、rpoD、gltA、16SrRNA）在熒光假單胞菌經(jīng)不同類型QS 信號分子培養(yǎng)后的表達情況，為確保表達穩(wěn)定性評價準確使用了geNorm、Normfinder、BestKeeper 和RefFinder 4 個程序，綜合評估后從8 個候選內(nèi)參基因中篩選出最適內(nèi)參基因。結(jié)果表明，在外源AHLs 刺激下，熒光假單胞菌中rpoD 和gltA 的基因表達最穩(wěn)定，可用于后續(xù)熒光假單胞菌QS 調(diào)控機制的研究中。

目前，通過qPCR 技術(shù)研究細菌功能基因在不同生長階段或者不同生長條件下的表達水平，多以16S rRNA 作為內(nèi)參基因。在大部分細菌中16S rRNA 都高度保守且具有特異性[32]，常被用作內(nèi)參基因，然而在本文中，16S rRNA 的Ct 值在8.27～9.37，表達豐度過高且穩(wěn)定性最差，不是熒光假單胞菌內(nèi)參基因的最佳選擇，最適內(nèi)參基因為rpoD 和gltA。rpoD 編碼RNA 聚合酶sigma70 因子，序列保守性超過50%，常用于菌株的分類鑒定和進化分析[33]。gltA 編碼檸檬酸合酶（三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶），最近也被用于多位點序列分析和系統(tǒng)發(fā)育分析[34]。Gomes 等[35]從11 個基因中篩選出recA、rho、rpoD 和proC 作為肺炎克雷伯菌在不同生長階段或環(huán)境脅迫下基因表達的最適內(nèi)參基因。鄭永欽等[36]發(fā)現(xiàn)rpoD 在柑橘黃龍病菌中表達穩(wěn)定性較差，進一步證明不同物種的最適內(nèi)參基因不一定相同。此外，geNorm、Normfinder、Best-Keeper 這3 款程序的統(tǒng)計方法皆不相同，評估候選內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性時可能會出現(xiàn)結(jié)果不一致的情況，這就需要進一步使用RefFinder 對這3款程序的結(jié)果進行綜合評估，確保篩選結(jié)果更為可靠。

綜上所述，本研究通過對候選內(nèi)參基因?qū)訉雍Y選與全面評估后，獲得了熒光假單胞菌在外源QS 信號分子培養(yǎng)下表達穩(wěn)定的2 個內(nèi)參基因rpoD 和gltA，為后續(xù)探究熒光假單胞菌致腐基因表達提供理論支持；也為其它腐敗菌提供內(nèi)參基因的參考，從而在研究QS 基因表達時獲得更可靠的相對定量結(jié)果。