高濃度柴油降解菌的篩選、鑒定及降解特性研究

王朝輝，曹 青，李 懌，李 磊，王飛龍，白正偉，賈 苒

(1.中石化煉化工程(集團(tuán))股份有限公司洛陽(yáng)技術(shù)研發(fā)中心，河南 洛陽(yáng) 471003；2.河南科技大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院)

石油被譽(yù)為“工業(yè)血液”,在人類(lèi)生活和社會(huì)發(fā)展中扮演著重要的角色。然而在石油開(kāi)采、煉化、貯存、運(yùn)輸、使用過(guò)程中經(jīng)常會(huì)發(fā)生原油及各類(lèi)油品的泄漏,導(dǎo)致土壤、地表水和地下水的污染[1-4]。石油烴污染物具有疏水性、遷移能力強(qiáng)和難生物降解等特征,進(jìn)入土壤后很難被快速清除,將長(zhǎng)期存在于土壤與地下水中,對(duì)微生物、動(dòng)物、植物構(gòu)成危害,并隨著食物鏈進(jìn)入人體,損害人類(lèi)健康[5-6]。因此,亟需對(duì)石油烴污染的土壤和地下水開(kāi)展修復(fù)。

石油烴污染場(chǎng)地的修復(fù)技術(shù)主要有物理修復(fù)、化學(xué)修復(fù)、生物修復(fù)以及聯(lián)合修復(fù)等[7-9]。其中微生物修復(fù)技術(shù)具有成本低、操作簡(jiǎn)便、無(wú)二次污染、對(duì)污染場(chǎng)地土壤擾動(dòng)小、工程量小等優(yōu)點(diǎn),引起了廣泛的關(guān)注[10-11]。能降解石油類(lèi)物質(zhì)的微生物種類(lèi)繁多、數(shù)量龐大,但其中有關(guān)鮑特氏菌屬(Bordetella)的報(bào)道相對(duì)較少,且大多只針對(duì)鹵代烴、多環(huán)芳烴類(lèi)污染物進(jìn)行了研究。Wang Fang等[12]發(fā)現(xiàn)了兩株鮑特氏菌,其能夠在以1,2,4-三氯苯為唯一碳源的培養(yǎng)基中快速生長(zhǎng)并起到良好的降解作用。Abo-State等[13]發(fā)現(xiàn)禽鮑特氏菌能夠有效地將萘降解為鄰苯二甲酸、1-壬烯-3-醇以及環(huán)氧乙烷等生物毒性較低的中間產(chǎn)物。Patel等[14]發(fā)現(xiàn),通過(guò)將鮑特氏菌和假單胞菌、固氮弧菌等構(gòu)建成降解菌群,對(duì)萘、菲、氟蒽和芘等多環(huán)芳烴表現(xiàn)出了良好的降解能力。

現(xiàn)有研究大多只報(bào)道了鮑特氏菌對(duì)氯代烴和多環(huán)芳烴的降解能力,對(duì)柴油類(lèi)石油烴的降解研究鮮有報(bào)道,因此針對(duì)鮑特氏菌進(jìn)行柴油降解研究可為該菌屬應(yīng)用于石油烴污染土壤和水體的生物修復(fù)提供有力支撐。本研究從某石油化工退役場(chǎng)地石油烴污染土壤中篩選得到一株對(duì)柴油具有降解性能的鮑特氏菌,將其命名為Bordetellasp.T3(簡(jiǎn)稱(chēng)T3)。對(duì)T3菌株進(jìn)行鑒定和形態(tài)結(jié)構(gòu)表征,考察菌株的生長(zhǎng)特性及以對(duì)柴油污染物耐受程度和降解特性,確定最適的降解條件,以期為高濃度柴油污染的生物修復(fù)和工業(yè)化菌劑的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌 種

從某石油化工退役場(chǎng)地的石油烴污染土壤中篩選分離得到。

1.2 原料與試劑

NH4Cl,分析純,天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司產(chǎn)品;FeSO4·7H2O,分析純,南京化學(xué)試劑股份有限公司產(chǎn)品;NaCl,分析純,西隴科學(xué)股份有限公司產(chǎn)品;CaCl2,分析純,天津市天達(dá)凈化材料精細(xì)化工廠產(chǎn)品;K2HPO4和KH2PO4,均為優(yōu)級(jí)純,天津市大茂化學(xué)試劑廠產(chǎn)品;瓊脂,生物試劑,德國(guó)Biofroxx生物試劑公司產(chǎn)品;胰蛋白胨和酵母浸粉,均為生物試劑,OXOID公司產(chǎn)品;正己烷,分析純,美國(guó)Fisher Chemical公司產(chǎn)品。

0號(hào)國(guó)Ⅵ車(chē)用柴油(簡(jiǎn)稱(chēng)0號(hào)柴油),購(gòu)自中國(guó)石化銷(xiāo)售股份有限公司貴州貴陽(yáng)石油分公司。

1.3 培養(yǎng)基

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基:NH4Cl 1 g,FeSO4·7H2O 0.01 g,NaCl 2 g,CaCl20.1 g,K2HPO41 g,KH2PO41 g,去離子水1 L,pH 7.0。

柴油平板培養(yǎng)基:在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加20 g/L瓊脂和2 mL 0號(hào)柴油。

柴油培養(yǎng)基:若無(wú)特別說(shuō)明,均為無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中添加體積分?jǐn)?shù)1%的0號(hào)柴油。

LB培養(yǎng)基:胰蛋白胨10 g,NaCl 10 g,酵母浸粉5 g,去離子水1 L,pH 7.0。

1.4 柴油降解菌的分離純化

從某石油化工退役場(chǎng)地采集石油烴污染土壤作為菌株篩選材料,稱(chēng)取污染土壤10 g,放入錐形瓶中,加入90 mL無(wú)菌水制備成水土混合液,置于30 ℃搖床中以160 r/min的轉(zhuǎn)速振蕩1 h使土樣中的細(xì)菌分散于水中,靜置30 min,上層清液即稀釋倍數(shù)為10的菌懸液。取稀釋倍數(shù)10的菌懸液,先分別稀釋至倍數(shù)為102,103,104倍,然后分別吸取50 μL稀釋倍數(shù)為102,103,104的菌液均勻涂布于柴油平板培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)3～5 d,挑取不同菌落形態(tài)的單菌落分別接種于LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)[15]。連續(xù)培養(yǎng)3次后吸取50 μL菌液接種到柴油培養(yǎng)基中,接種量(φ)為0.1%,7 d后測(cè)定柴油的降解率,降解率最高(初始柴油降解率為36.91%)的菌株為T(mén)3。以T3進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.5 降解菌的形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定

采用16S rRNA序列分析方法鑒定T3菌株,由華大基因生物科技有限公司完成。

菌落的生長(zhǎng)狀況以及形態(tài)特征測(cè)試按照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》進(jìn)行初步判定,并采用掃描電子顯微鏡(型號(hào)Hitachi S3400N)在10 000倍下觀察,測(cè)序結(jié)果用NCBI Blast程序?qū)⑵唇雍蟮男蛄形募﨨CBI中的已知序列進(jìn)行同源性比對(duì),利用MEGA11.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。菌株保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC),保藏號(hào)為CCTCC M 20211642。

1.6 柴油降解率的測(cè)定

以正己烷為萃取劑,采用液液萃取的方法,萃取柴油培養(yǎng)基中的柴油,萃取后柴油含量通過(guò)氣相色譜儀(型號(hào)Agilent 6890N)進(jìn)行測(cè)定。采用Agilent HP-5色譜柱,規(guī)格為30 m×0.25 mm×0.25 μm。儀器設(shè)置條件為:進(jìn)樣口溫度320 ℃,不分流進(jìn)樣;柱箱初始溫度50 ℃,保持2 min,以40 ℃/min的速率升至230 ℃,以20 ℃/min的速率升至320 ℃,保持20 min。載氣為氦氣,氣體流速為2.0 L/min:氫火焰離子化(FID)檢測(cè)器;進(jìn)樣量1 μL。

式中:ρ0是未接種菌的柴油培養(yǎng)基中柴油的質(zhì)量濃度,mg/L;ρ1是接種菌后柴油培養(yǎng)基中柴油的質(zhì)量濃度,mg/L。

1.7 降解菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定

以L(fǎng)B培養(yǎng)基為參比,利用紫外分光光度計(jì)在光波波長(zhǎng)為600 nm條件下測(cè)定菌懸液的吸光度(OD600),通過(guò)測(cè)定的OD600間接反映T3的生長(zhǎng)量。

將T3以接種量(φ)為0.1%接種在LB培養(yǎng)基中,30 ℃、160 r/min震蕩培養(yǎng)。0～20 h,每隔2 h取樣;20 h后,每隔4 h取樣,連續(xù)取到40 h。以L(fǎng)B培養(yǎng)基為參比測(cè)定OD600值,即可得到降解菌在該條件下的生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.8 影響柴油降解因素試驗(yàn)

1.8.1接種量

將在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h的T3菌液以接種量(φ)分別為0.5%,1.0%,2.0%,5.0%,10.0%接種于柴油培養(yǎng)基中,在30 ℃、160 r/min條件下振蕩培養(yǎng)7 d,以不接種菌的柴油培養(yǎng)基為對(duì)照,測(cè)定降解菌的OD600及柴油降解率。

1.8.2環(huán)境條件

將T3以接種量(φ)為2%接種至柴油培養(yǎng)基中,考察溫度(20,25,30,35,40 ℃)、體系初始pH(4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0)、外加氮源(氯化銨、尿素、蛋白胨、硝酸鈉,投加質(zhì)量濃度均為1.0 g/L)、柴油體積分?jǐn)?shù)(0.5%,1%,2%,5%,10%)等因素對(duì)降解菌生長(zhǎng)和降解效果的影響。所有試驗(yàn)組的降解條件均為30 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)7 d,以不接種菌的柴油培養(yǎng)基作為空白對(duì)照,測(cè)定菌株的OD600及柴油降解率。

2 結(jié)果與討論

2.1 降解菌的分離與鑒定

通過(guò)柴油平板培養(yǎng)基篩選和分離得到一株柴油高效降解菌T3,其菌落形態(tài)和掃描電子顯微鏡照片如圖1所示。由圖1可知:菌落形態(tài)為圓形,白色,表面濕滑不透明,邊緣整齊;降解菌為短棒狀結(jié)構(gòu)。

圖1 降解菌T3的形態(tài)

以菌株T3的DNA為模板,利用通用引物擴(kuò)增得到1 039 bp的16S rRNA基因片段。通過(guò)在基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)分析,發(fā)現(xiàn)其與Bordetellapetriistrain DSM 12804的同源性達(dá)99.03%。將菌株T3與鮑特氏菌進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析(如圖2所示),菌株T3的16S rRNA基因序列GenBank登錄號(hào)為OM149383。

圖2 降解菌T3基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析形態(tài)

2.2 降解菌的生長(zhǎng)特性

T3在LB培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況如圖3所示。由圖3可以看出:在0～6 h內(nèi),T3處于延滯期,生長(zhǎng)緩慢,需要經(jīng)過(guò)一段時(shí)間才能在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)繁殖;6～24 h為對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期,細(xì)胞代謝活力最強(qiáng),合成新細(xì)胞物質(zhì)的速率最高,T3數(shù)量快速增加,24 h達(dá)到最大值的時(shí)期;24～32 h為穩(wěn)定期,此時(shí)培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分濃度降低,同時(shí)代謝產(chǎn)物的大量積累對(duì)菌體本身產(chǎn)生毒害,這些因素對(duì)其生長(zhǎng)不利,因此T3的生長(zhǎng)趨于穩(wěn)定;32～40 h為衰亡期,培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)大量耗盡,T3開(kāi)始出現(xiàn)死亡、自溶,細(xì)菌生長(zhǎng)受到抑制,死亡速率大于生長(zhǎng)速率,總細(xì)胞數(shù)呈負(fù)增長(zhǎng)。因此后續(xù)降解試驗(yàn)均采用在LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)24 h左右的菌液。

圖3 降解菌T3生長(zhǎng)曲線(xiàn)

2.3 接種量對(duì)柴油降解率的影響

接種量是影響微生物代謝過(guò)程的一個(gè)重要因素,影響到微生物的生長(zhǎng)速度和延滯期。在柴油體積分?jǐn)?shù)為1%、溫度為30 ℃、體系初始pH為7.0的條件下,考察了接種量對(duì)T3降解柴油的影響,結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知,隨著接種量逐漸提高,T3降解柴油降解率和OD600呈現(xiàn)出先增加而后降低的趨勢(shì),在接種量(φ)為2%時(shí),對(duì)柴油的降解率最高,達(dá)到79.04%,OD600也達(dá)到0.848。此結(jié)果表明,單純提高接種量并不能顯著提升菌株的柴油降解率,接種的微生物過(guò)多,使菌體過(guò)度繁殖,菌體對(duì)培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的相互競(jìng)爭(zhēng)將造成營(yíng)養(yǎng)短缺,其代謝活動(dòng)受到限制,影響微生物對(duì)柴油的降解[16]。因此后續(xù)試驗(yàn)均選擇接種量(φ)為2%進(jìn)行。

表1 接種量對(duì)T3降解柴油效果的影響

2.4 環(huán)境條件對(duì)柴油降解率的影響

在柴油體積分?jǐn)?shù)為1%、T3接種量(φ)為2%、體系初始pH為7.0的條件下,考察溫度對(duì)T3降解柴油性能的影響,結(jié)果如圖4所示。在柴油體積分?jǐn)?shù)為1%、T3接種量(φ)為2%、溫度30 ℃的條件下,考察了體系初始pH對(duì)T3降解柴油性能的影響,結(jié)果如圖5所示。

圖4 溫度對(duì)T3降解柴油性能的影響

圖5 初始pH 對(duì)T3降解柴油性能的影響

由圖4可以看出,在柴油培養(yǎng)基中,T3在30 ℃時(shí)的柴油降解率最高,達(dá)到79.04%,OD600也達(dá)到0.848。微生物對(duì)柴油的降解屬于酶促反應(yīng),在最適溫度下微生物生長(zhǎng)最好,酶活性較高,可促進(jìn)對(duì)柴油的降解,而后溫度的升高或降低均會(huì)抑制微生物的代謝活動(dòng),從而導(dǎo)致T3的生長(zhǎng)和柴油降解能力下降。由5可知,在pH為7.0～9.0范圍內(nèi)柴油降解率可達(dá)到70%以上,其中pH為8.0時(shí)降解率最高,為89.79%,說(shuō)明T3適宜在pH 為7.0～9.0的弱堿性環(huán)境中生長(zhǎng)代謝。pH為4.0～6.0的酸性條件不利于T3的生長(zhǎng),從而導(dǎo)致柴油降解率降低。

圖6 氮源對(duì)柴油降解率的影響

在T3接種量(φ)為2%、溫度為30 ℃、體系初始pH為8.0、以氯化銨作為外加氮源的條件下,考察T3對(duì)不同濃度柴油的降解能力,結(jié)果如圖7所示。由圖7可以看出,當(dāng)柴油體積分?jǐn)?shù)為0.5%時(shí),T3生長(zhǎng)增殖能力強(qiáng),柴油降解率達(dá)到92.50%。隨著柴油濃度的增加,T3的生長(zhǎng)速率和柴油降解能力不斷下降,主要原因是柴油濃度增大后,會(huì)在培養(yǎng)接表面形成一層油膜,使得溶解氧濃度降低,此外高濃度柴油具有一定的生物毒性,抑制了微生物的生長(zhǎng)代謝,從而降低了對(duì)柴油的降解能力[17]。在柴油體積分?jǐn)?shù)為10%(質(zhì)量濃度為84 000 mg/L)的條件下,其降解率約40%,說(shuō)明T3對(duì)高濃度柴油污染物具有一定的降解能力,展示出了在高濃度柴油類(lèi)石油烴污染土壤和地下水的應(yīng)用潛力。主要原因可能是該降解菌長(zhǎng)期在高濃度石油烴和多環(huán)芳烴污染的土壤中生長(zhǎng),對(duì)該環(huán)境條件具有較好的耐受能力。

圖7 柴油含量對(duì)柴油降解率的影響

2.5 柴油降解機(jī)制分析

長(zhǎng)期在石油烴、多環(huán)芳烴污染土壤中生長(zhǎng)使菌株可耐受石油烴污染環(huán)境,從此環(huán)境中篩選得到的菌株T3也由此具備了良好的石油烴污染環(huán)境耐受性與降解能力。在最適宜條件下,采用T3對(duì)柴油培養(yǎng)基中體積分?jǐn)?shù)為1%的柴油進(jìn)行7 d降解,對(duì)降解前后的柴油進(jìn)行氣相色譜分析,二者的氣相色譜圖譜對(duì)比見(jiàn)圖8,二者的組分含量對(duì)比見(jiàn)表2。由圖8和表2可以看出,降解7 d后,T3對(duì)柴油中的主要組分(C10～C22)均具有較好的降解效果,降解前后柴油各單一組分含量均發(fā)生了明顯的變化。

表2 柴油降解前后的主要組分含量對(duì)比

圖8 柴油降解前后的氣相色譜

3 結(jié) 論

(1)從某石油化工退役場(chǎng)地石油烴污染土壤中篩選得到鮑特氏菌Bordetellasp.T3菌株,其具有良好的高濃度柴油污染物的耐受能力和降解效果。

(2)在柴油體積分?jǐn)?shù)為1%、接種量(φ)為2%、溫度為30 ℃、pH為8.0的條件下,采用T3降解柴油7 d降解率可達(dá)89.79%。且T3能夠耐受體積分?jǐn)?shù)為10%(質(zhì)量濃度為84 000 mg/L)的柴油,具有約40%的降解率,對(duì)高濃度柴油污染情況的生物修復(fù)具有重要的意義。

(3)T3可降解柴油中主要的碳?xì)浠衔锝M分(C10～C22),在柴油等石油烴污染修復(fù)領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用價(jià)值。