沙眼衣原體外膜復(fù)合物蛋白B的研究進(jìn)展

孫悠嫻, 齊蔓莉

1.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院,天津 300052; 2.天津市人民醫(yī)院,天津 300000

沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis,CT)是性傳播感染的主要病原體之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織發(fā)布的報(bào)告[1],CT每年約有1.285億新增病例,男性約6 990萬,女性約5 860萬。CT感染目前已是最常見的性傳播疾病之一。在女性群體中約有70%～80%呈無癥狀感染,若不加以治療控制,會(huì)引起女性上生殖道的瘢痕,并最終導(dǎo)致盆腔炎、異位妊娠、不孕癥等嚴(yán)重的后遺癥[2-3]。此外,有研究表明CT與HPV感染相關(guān)的宮頸癌有所關(guān)聯(lián)[4];CT感染還會(huì)使人類免疫缺陷病毒感染和傳播的風(fēng)險(xiǎn)增加3～4倍[5]。因此,CT感染的防治需引起足夠重視。CT有嚴(yán)格胞內(nèi)寄生的特性且擁有獨(dú)特的雙相發(fā)育周期[6-7],一種是形態(tài)較小的(直徑約200 nm)、具有感染性和非復(fù)制性的原體(elementary bodies, EBs),另一種是形態(tài)較大的(直徑約800 nm)、非感染性和具有繁殖復(fù)制能力的網(wǎng)狀體(reticulate bodies, RBs)。在CT的發(fā)育周期中,EBs通過內(nèi)吞作用附著并進(jìn)入宿主粘膜細(xì)胞后,被內(nèi)化在細(xì)胞內(nèi)包涵體中。內(nèi)化后約2 h,EBs經(jīng)二硫化物還原擴(kuò)大,分化成RBs。RBs在感染后約6 h經(jīng)過幾輪復(fù)制重新分化為EBs。在發(fā)育周期末,包涵體占據(jù)了宿主細(xì)胞大部分細(xì)胞質(zhì)。感染48～72 h后,大量感染性EBs從宿主細(xì)胞中釋放出來,感染鄰近的上皮細(xì)胞并使得CT感染的過程持續(xù)存在。CT的感染依賴于其對(duì)宿主細(xì)胞的黏附和入侵機(jī)制,該機(jī)制與CT的免疫優(yōu)勢(shì)蛋白息息相關(guān)[8],這些蛋白包括主要外膜蛋白(MOMP)、熱休克蛋白70(HSP70)、質(zhì)粒蛋白pgp3以及外膜復(fù)合物蛋白B(OmcB)等。OmcB在衣原體中是含量第二豐富的外膜蛋白[9-10],在衣原體感染過程中表現(xiàn)出強(qiáng)大的免疫原性[11],在幫助CT感染的診斷以及疫苗研發(fā)方面具有很好的應(yīng)用前景。因此,本文對(duì)OmcB的結(jié)構(gòu)、定位及作用機(jī)理等相關(guān)研究進(jìn)行綜述。

1 外膜復(fù)合物蛋白B的結(jié)構(gòu)

外膜復(fù)合物蛋白B(outer membrane complex protein,OmcB),也被稱為CT443,其基因長度為1 659 bp,分子質(zhì)量約為60 kD。OmcB是一類富含24個(gè)半胱氨酸殘基的外膜多肽,在衣原體中是第二豐富的外膜蛋白,含量?jī)H次于MOMP[9-10]。OmcB可以被分為一個(gè)具有高度保守性的C端部分,以及一個(gè)具有物種特異性的N端部分[12]。衣原體的所有OmcB蛋白在其N端結(jié)構(gòu)域中都至少有一個(gè)XBBXBX序列(圖1),該序列已被證實(shí)與介導(dǎo)衣原體黏附相關(guān)。OmcB C端CD8表位的鑒定表明C端可進(jìn)入宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)[13]。OmcB蛋白在不同種衣原體之間具有高度保守性[14],Wang等[11]通過分析血清型D CT OmcB開放閱讀框序列,并與其他衣原體序列進(jìn)行BLAST分析,發(fā)現(xiàn)血清型D與H、G和K之間同源性為100%,與血清型B和C有99%同源性,與L1-L3之間亦有98%的同源性,表明OmcB在衣原體感染過程中起重要作用。這意味著OmcB或許在衣原體疫苗的研究上具有一定潛力。

SS:信號(hào)序列;BD:OmcB結(jié)合結(jié)構(gòu)域;N-terminus:OmcB N末端,為OmcB結(jié)合結(jié)構(gòu)域,具有物種特異性;C-terminus:OmcB C末端,具有高度保守性;標(biāo)紅區(qū)域?yàn)镺mcB結(jié)合結(jié)構(gòu)域(OmcB-BD),內(nèi)含至少一個(gè)XBBXBX基本序列(B代表一種堿性氨基酸),可與肝素結(jié)合。

2 外膜復(fù)合物蛋白B的定位

關(guān)于OmcB的定位曾存在一定爭(zhēng)議。Everett等[15]認(rèn)為OmcB完全位于周質(zhì)而非暴露于表面或定位于外膜上。相較之下,Ting等[16]發(fā)現(xiàn)鸚鵡熱衣原體的 OmcB也對(duì)EBs的胰蛋白酶消化敏感,并提出OmcB可能是暴露在細(xì)胞表面的。Mygind等[17]試圖通過免疫電子顯微鏡觀察OmcB特異性抗體解決沙眼OmcB表面定位問題,發(fā)現(xiàn)OmcB位于外膜內(nèi)表面,只有在用還原試劑和蛋白裂解酶處理后才能到達(dá)細(xì)胞表面。然而在此前的研究中,由于表面暴露的OmcB區(qū)域有限,或是由于針對(duì)整個(gè)OmcB蛋白產(chǎn)生的抗體無法識(shí)別OmcB的構(gòu)象表位,導(dǎo)致這些抗體無法與完整的EBs結(jié)合。Fadel等[8]從血清型LGV1中將OmcB分離并測(cè)序,克隆表達(dá)于大腸桿菌,最終蛋白酶裂解的結(jié)果表明重組OmcB蛋白的部分位于大腸桿菌的外膜內(nèi)表面上,其余部分位于周質(zhì)中;體外感染抑制試驗(yàn)表明使用抗OmcB有效抑制LGV1的感染,提示在沙眼衣原體表面確有OmcB蛋白暴露,并且在免疫功能方面可與抗體發(fā)生結(jié)合。

3 外膜復(fù)合物蛋白B的作用機(jī)理

得益于OmcB在CT感染中的豐富性和免疫原性,在診斷和疫苗研發(fā)方面,OmcB一直被視作一個(gè)重要研究靶點(diǎn)。鑒于CT感染癥狀的隱匿性及其并發(fā)癥的危害性,CT感染者的早期篩查和后續(xù)充分治療對(duì)CT感染的防控工作具有重要意義。然而目前國內(nèi)各種檢測(cè)方法存在一定缺陷,如侵入性檢查在取材時(shí)給患者造成痛苦、耗時(shí)費(fèi)力、檢測(cè)結(jié)果敏感性不高和特異性不高等問題[18]。血清學(xué)檢查中血清中pgp3、MOMP、HSP60抗體在臨床應(yīng)用中同樣存在局限性[3,9,19]。已有研究驗(yàn)證,在感染衣原體患者的血清中可檢測(cè)出高滴度的抗MOMP、衣原體蛋白酶樣活性因子(Chlamydial protease-like activity factor, CPAF)、易位肌動(dòng)蛋白募集磷酸化蛋白 (translocated actin recrui-ting phosphoprotein, Tarp)等特異性抗體,這些免疫優(yōu)勢(shì)蛋白已被運(yùn)用于疫苗的研發(fā)之中[20-22]。同樣提示OmcB作為一類免疫優(yōu)勢(shì)蛋白,在衣原體感染的早期檢測(cè)、診斷和疫苗研發(fā)方面或許存在著可期的研究空間與前景。

3.1 OmcB是一種免疫優(yōu)勢(shì)蛋白

在CT感染過程中,OmcB已被證實(shí)是一種免疫優(yōu)勢(shì)抗原。不管是在動(dòng)物還是在人類CT感染中都可介導(dǎo)產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。

CD8+T細(xì)胞通過裂解受感染細(xì)胞以及分泌細(xì)胞因子的機(jī)制在解決多種胞內(nèi)細(xì)菌感染方面發(fā)揮效應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)人類CD8+T細(xì)胞可以識(shí)別OmcB,第一次運(yùn)用CT感染的樹突狀細(xì)胞獲得克隆的人類CD8+T細(xì)胞,驗(yàn)證出OmcB為CT的一種抗原,通過MHC Ⅰ類加工途徑并以此刺激人類CD8+T細(xì)胞,這是人類對(duì)此病原體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的第一步,激活CD8+T細(xì)胞免疫反應(yīng)也是抵抗CT感染所必需的步驟[13]。Telyatnikova等[23]通過從CT誘導(dǎo)的反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎患者的滑液淋巴細(xì)胞中克隆并表達(dá)了CT特異性CD4+T細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)人類CD4+T細(xì)胞可以識(shí)別OmcB。這些結(jié)果說明OmcB在T細(xì)胞介導(dǎo)的CT感染的免疫過程中發(fā)揮了作用。

克隆表達(dá)OmcB全長基因存在一定困難。Wang等[11]以O(shè)mcB的C端為研究對(duì)象,采用PCR技術(shù)從基因組中擴(kuò)增C端序列,構(gòu)建OmcBc重組質(zhì)粒,成功誘導(dǎo)表達(dá)重組OmcBc融合蛋白;同時(shí)該研究收集120例CT感染患者血清,并對(duì)家兔和小鼠進(jìn)行免疫接種或感染,獲得7份兔免疫血清、9份腹腔免疫小鼠血清、5份滴鼻感染小鼠血清,對(duì)倍稀釋后用IFA檢測(cè)各份免疫血清效價(jià),結(jié)果顯示,在1 ∶5 000稀釋下的人免疫血清中,CT的包涵體依然可以清晰著色,而兔和小鼠的血清效價(jià)均大于1 ∶10 000;ELISA檢測(cè)結(jié)果表明在120例患者免疫血清中,重組OmcBc融合蛋白反應(yīng)陽性率為87.5%;家兔和小鼠免疫血清與重組OmcBc融合蛋白均可發(fā)生強(qiáng)烈的抗原抗體反應(yīng),反應(yīng)頻率為100%。由此可見重組OmcBc蛋白具有很強(qiáng)的抗原性。此項(xiàng)研究證明無論CT的增殖過程是否發(fā)生在宿主細(xì)胞內(nèi),免疫細(xì)胞對(duì)OmcB的呈遞過程依然可以照常進(jìn)行并進(jìn)一步誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答。

OmcB屬于晚期基因[24]。Qi等[25]為監(jiān)測(cè)全長OmcB蛋白的表達(dá),用1%SDS透化CT感染的細(xì)胞,在感染后2 h可檢測(cè)到EBs中預(yù)先存在的OmcB,但在感染后12 h和18 h消失,在24 h可檢測(cè)出新合成的OmcB,感染后36 h檢測(cè)到OmcB與生物體廣泛重疊;用2%皂苷透化后可明顯觀察到在感染后24 h,有OmcBc分泌到宿主細(xì)胞胞質(zhì)中,這表明分泌的OmcBc可能是由新合成的OmcB主動(dòng)加工而成的。

Qi等[25]針對(duì)OmcB C端和N端片段分別構(gòu)建抗OmcBc抗體和抗OmcBn抗體,在宿主細(xì)胞被CT感染后,在其細(xì)胞質(zhì)中檢測(cè)到很強(qiáng)的抗OmcBc抗體信號(hào),而抗OmcBn抗體只在衣原體包涵體內(nèi)部檢測(cè)出信號(hào);經(jīng)各項(xiàng)試驗(yàn)證明,OmcBc片段被釋放到宿主細(xì)胞胞質(zhì)中,而OmcBn片段和剩余的全長OmcB被保留在衣原體包涵體中;同時(shí)該研究為驗(yàn)證CT感染期間OmcBc具有高度免疫原性,使用了20例感染沙眼衣原體女性的抗血清,通過ELISA和免疫印跡法繪制OmcB的免疫顯性區(qū)域。在ELISA中,這20例中抗血清均陽性識(shí)別全長OmcB,匯集20種人抗血清時(shí)也得到相似的結(jié)果;使用蛋白質(zhì)印跡分析也證實(shí)了人抗體對(duì) OmcBc片段的顯性識(shí)別。實(shí)驗(yàn)中,即使人抗血清的稀釋度很低,合并的陽性抗血清也能識(shí)別 OmcB 的所有C末端片段而非N末端片段,這證實(shí)了OmcBc的免疫優(yōu)勢(shì)。OmcBc片段表現(xiàn)出與全長OmcB相似的抗原性,這表明OmcBc在OmcB的免疫原性表達(dá)方面占絕大部分作用。而OmcBc在CT感染期間被釋放到宿主細(xì)胞胞質(zhì)中,同時(shí)分泌的OmcBc可以方便提取到溶液中以進(jìn)行抗體的識(shí)別,也表明其可以用于研發(fā)一種基于免疫組化的OmcBc快速檢測(cè)方法。

Hou等[26]研究發(fā)現(xiàn)CPAF在處理OmcB使其裂解成OmcBc的過程中發(fā)揮重要作用。CPAF是一種絲氨酸蛋白酶,由包涵體內(nèi)CT分泌后可通過Sec依賴性途徑[25]進(jìn)入宿主細(xì)胞周質(zhì)空間,這表明CPAF可能是切割 OmcB 的候選蛋白酶。OmcB在CT感染晚期的加工處理發(fā)生在CPAF合成并活化之后,監(jiān)測(cè)CPAF的表達(dá)可發(fā)現(xiàn)在檢測(cè)到加工后的OmcBc之前檢測(cè)到了活性CPAF,表明CPAF處理OmcB的可能性。并且CPAF在經(jīng)CPAF特異性抗體消耗之后以及被一種CPAF特異性抗體抑制肽處理之后,OmcB的處理也得到抑制。在該研究中Hou等還監(jiān)測(cè)了宿主細(xì)胞的完整性以及感染時(shí)間過程,未發(fā)現(xiàn)明顯的細(xì)胞膜通透性變化,這表明OmcB加工確實(shí)發(fā)生在活細(xì)胞中,而非細(xì)胞死亡。Chen等[27]發(fā)現(xiàn)CPAF可能通過外膜囊泡(OMV)出芽機(jī)制分泌出CT并進(jìn)入宿主細(xì)胞。而OmcBc也被證明可以釋放到宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。因此,OmcBc有可能通過與CPAF共同包裝到OMV中并進(jìn)入宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)發(fā)揮作用。

3.2 OmcB介導(dǎo)CT對(duì)宿主細(xì)胞的黏附

OmcB可以作為CT侵入宿主細(xì)胞的黏附素。在OmcB蛋白的N-端結(jié)構(gòu)域中至少存在著一個(gè)XBBXBX序列(B代表一種堿性氨基酸),此序列以及N-端碎片所對(duì)應(yīng)的的合成肽,被證實(shí)可與肝素相結(jié)合來阻斷某些沙眼衣原體血清型的感染性[28-29]。在宿主細(xì)胞膜上存在著硫酸乙酰肝素蛋白多糖(heparan sulfate proteoglycan, HSPG),屬于粘多糖(glycosaminoglycan,GAG)家族中的一員,現(xiàn)已被證實(shí)可與CT細(xì)胞外基質(zhì)蛋白結(jié)合介導(dǎo)細(xì)胞黏附和遷移,是衣原體感染的必要條件[30]。Fadel等[8]研究發(fā)現(xiàn)血清型LGV1的重組OmcB蛋白與GAGs缺陷型宿主細(xì)胞的結(jié)合大大減少,表明OmcB可以與宿主細(xì)胞膜上的GAGs受體特異性結(jié)合從而增強(qiáng)衣原體對(duì)宿主細(xì)胞的黏附。

Fadel等[31]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),不同于血清型LGV1,在血清型E中,OmcB蛋白雖然也存在黏附性,但其與宿主細(xì)胞的結(jié)合并不依賴于GAGs。感染性抑制實(shí)驗(yàn)顯示在保持同樣存在肝素這一相同條件下,只有表達(dá)了血清型LGV1的OmcB的大腸桿菌的黏附性被顯著抑制(68%),血清型LGV1的重組OmcB與GAGs缺陷型細(xì)胞的結(jié)合顯著減少,而對(duì)于同一缺陷細(xì)胞,來自血清型E的重組OmcB的結(jié)合數(shù)量與野生型細(xì)胞相當(dāng)。

衣原體OmcB與宿主細(xì)胞的黏附是否依賴于GAGs取決于OmcB C端的3個(gè)可變氨基酸(第66、68、71位氨基酸)到保守的XBBXBX肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域[12],其中,第66位氨基酸是決定其依賴性的最主要因素,當(dāng)血清型E的OmcB蛋白的第66位亮氨酸被血清型LGV的OmcB中相應(yīng)位置的脯氨酸所取代后,由肝素非依賴轉(zhuǎn)變成了肝素依賴。相對(duì)應(yīng)地,當(dāng)血清型LGV的OmcB蛋白的第66位脯氨酸被亮氨酸取代后,其肝素依賴性也同樣發(fā)生了改變。

3.3 OmcB維持EBs細(xì)胞壁剛性和滲透穩(wěn)定性

EBs的細(xì)胞壁成分又被稱為衣原體外膜復(fù)合物(Chlamydia outer membrane complex, COMC)[32],它不溶于肌氨酸,除了含有主要外膜蛋白(MOMP)、富含半胱氨酸蛋白(Cysteine rich proteins, Crp)、多形態(tài)膜蛋白(polymorphic membrane proteins, Pmps)外,還具有一種剛性外膜,這種膜結(jié)構(gòu)由二硫化物交聯(lián)的富含半胱氨酸的蛋白質(zhì)網(wǎng)構(gòu)成,即OmcB,有助于提高EBs對(duì)于外界環(huán)境壓力的抵抗力。Newhall等[33]表明OmcB可能參與RBs到EBs的轉(zhuǎn)化過程并且在維持EBs的細(xì)胞壁剛性和滲透穩(wěn)定性方面發(fā)揮作用,其研究數(shù)據(jù)表明,在衣原體感染Hela細(xì)胞30 h后,細(xì)胞內(nèi)RBs轉(zhuǎn)化為EBs時(shí),才檢測(cè)到了OmcB蛋白的合成,這表明衣原體外膜蛋白的合成時(shí)間和程度受到調(diào)控,且這種調(diào)控在時(shí)間上與RBs到EBs的分化過程相吻合。此外,該項(xiàng)研究還顯示在外膜蛋白的生長周期內(nèi),OmcB蛋白的二硫鍵在大部分時(shí)間中廣泛交聯(lián)。

4 結(jié)語與展望

OmcB蛋白是衣原體中含量?jī)H次于MOMP的外膜蛋白,其獨(dú)特結(jié)構(gòu)可以幫助維持衣原體EBs的細(xì)胞壁剛性及滲透穩(wěn)定性。在介導(dǎo)CT對(duì)宿主細(xì)胞的黏附與入侵過程中,OmcB蛋白發(fā)揮了重要作用,其與宿主細(xì)胞膜上的GAGs受體特異性結(jié)合從而增強(qiáng)衣原體對(duì)宿主細(xì)胞的黏附。同時(shí)對(duì)OmcB的研究也幫助我們對(duì)于衣原體致病機(jī)制的理解方面有所加深。多項(xiàng)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果已證實(shí)OmcB是一種免疫優(yōu)勢(shì)抗原,不管是在動(dòng)物還是在人類CT感染中都可介導(dǎo)產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。但OmcB作為一類免疫優(yōu)勢(shì)蛋白,其與宿主細(xì)胞的相互作用機(jī)制尚未完全明了,其在衣原體感染的早期檢測(cè)以及有效疫苗研制方面存在著可期的研究空間與前景,值得進(jìn)一步研究。