甲真菌病的真菌學(xué)檢測(cè)方法研究進(jìn)展

曹冰瑩, 廖德君,2, 楊茜, 楊政敏

1.黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校,2.黔南州人體寄生蟲病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州 都勻 558000

甲真菌病(onychomycosis)是最常見的指(趾)甲疾病,由皮膚癬菌、酵母菌和非皮膚癬菌性霉菌侵犯甲板和(或)甲床所致[1],以甲顏色改變、甲下角化過度、甲肥厚和甲分離為主要臨床特征[2]。該病呈全球分布,在世界范圍內(nèi)的患病率為5.5%,占臨床上所有指甲疾病的50%[3],被認(rèn)為是全球分布的主要公共衛(wèi)生問題之一。目前臨床上甲真菌病的真菌學(xué)診斷仍以傳統(tǒng)的真菌培養(yǎng)、直接鏡檢、組織病理檢查為主[1],這些方法靈敏度較低,耗時(shí)長(zhǎng),不能鑒定真菌種類,不利于甲真菌病的早期診斷和分類治療。近年來,精確到屬、種的真菌學(xué)檢查方法層出不窮,已成為真菌分類學(xué)研究的熱點(diǎn)。本文現(xiàn)對(duì)甲真菌病的真菌學(xué)檢測(cè)方法的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 傳統(tǒng)檢測(cè)方法

以直接鏡檢、真菌培養(yǎng)和組織病理檢查為主的傳統(tǒng)診斷技術(shù)被廣泛地應(yīng)用于臨床診斷工作中,仍是甲真菌病真菌學(xué)診斷的主要手段。

1.1 直接鏡檢

1.1.1 KOH溶甲鏡檢法 該方法是利用10%～20%氫氧化鉀(KOH)溶液溶解標(biāo)本病甲后,借助顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)診斷。該方法簡(jiǎn)便,費(fèi)用低,可在1 h內(nèi)出具診斷結(jié)果,因此被廣泛地應(yīng)用在臨床中[4-9]。然而該方法的診斷容易受病甲標(biāo)本采集質(zhì)量和檢驗(yàn)技術(shù)水平的影響,并且僅能確定真菌是否存在而不能明確真菌的種類。

1.1.2 熒光染色鏡檢法 該方法是使用真菌熒光染色劑浸染病甲碎片標(biāo)本后,在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察診斷。該方法可增強(qiáng)顯示病甲中的真菌結(jié)構(gòu),更易被檢查者觀察發(fā)現(xiàn),因此其靈敏度與KOH溶甲鏡檢法相比顯著提升[10-11]。該法具有簡(jiǎn)便、無(wú)創(chuàng)、檢出率高等優(yōu)點(diǎn),但也不能確定病原真菌的種類。

1.2 真菌培養(yǎng)

1.2.1 普通培養(yǎng) 真菌培養(yǎng)是指使用沙氏培養(yǎng)基、馬鈴薯培養(yǎng)基等不同培養(yǎng)基在25～30 ℃下對(duì)病甲進(jìn)行培養(yǎng)2至4周,通過肉眼觀察菌落特征和(或)使用顯微鏡觀察真菌的孢子、菌絲等形態(tài)學(xué)特征來診斷,可以鑒別病原真菌的種類以及判斷其活力[9, 12-14]。該法特異性強(qiáng),靈敏度較高,可以提供有關(guān)真菌活性信息、鑒定真菌種類以及真菌藥敏情況,有助于臨床診療工作。真菌培養(yǎng)是一項(xiàng)操作相對(duì)復(fù)雜、耗時(shí)、成本較高的診斷方法,其可靠性很大程度上取決于檢測(cè)中心的專業(yè)性。此外,真菌培養(yǎng)容易受霉菌的污染,對(duì)霉菌所致的甲真菌病常需要重復(fù)培養(yǎng)3次方可確定。

1.2.2 顯色培養(yǎng)及生化反應(yīng) 兩者主要可用于酵母菌的鑒定。顯色培養(yǎng)是通過菌落顏色來鑒定菌種,該法能鑒定出超過90%的致病性酵母菌,如白念珠菌、熱帶念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌等[15]。鑒定酵母菌種屬的生化反應(yīng)試驗(yàn)一般包括尿素酶、海藻糖、酚氧化酶、糖同化、糖發(fā)酵、硝酸鹽試驗(yàn)。目前,臨床上已有基于生化反應(yīng)的酵母菌自動(dòng)化鑒定系統(tǒng),可以將臨床常見的酵母樣真菌鑒定到種水平,對(duì)酵母菌的鑒定能力明顯優(yōu)于顯色培養(yǎng),且與新興的分子鑒定技術(shù)有很好的一致性[16]。

1.3 甲組織病理學(xué)檢查

甲組織病理學(xué)檢查使用組織染色對(duì)甲標(biāo)本進(jìn)行染色后觀察,可以獲得真菌感染的直接證據(jù)。該技術(shù)可使用過碘酸雪夫染色法(periodic acid-schiff stain,PAS)或六胺銀染色(grocott methenamine silver stain,GMS)對(duì)真菌菌體進(jìn)行染色,以增加顯微鏡檢查時(shí)的能見度[17-19]。實(shí)施甲組織病理學(xué)檢查需要大量的實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備,如甲組織固定、脫水、包埋、切片等。雖然組織病理學(xué)是傳統(tǒng)甲真菌病診斷方法中最敏感的,但它并不能鑒定致病真菌種類,且存在操作復(fù)雜、耗時(shí)較長(zhǎng)、標(biāo)本需要量多、實(shí)施條件高等問題,導(dǎo)致其在臨床診斷工作中逐步被其他診斷技術(shù)所替代。

2 新興檢測(cè)技術(shù)

2.1 免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)

由于致病真菌僅在被侵犯的甲板內(nèi)生長(zhǎng)繁殖,人體免疫系統(tǒng)難以產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答,因此認(rèn)為真菌特異性抗體檢測(cè)不是甲真菌病病原檢查的最好方案,而真菌特異性抗原檢測(cè)是診斷甲板真菌感染的可行方案,其能快速提供檢測(cè)結(jié)果,在甲真菌病病原診斷和流行病學(xué)調(diào)查等領(lǐng)域具有重要價(jià)值。

2.1.1 免疫層析法(immunochromatography,ICA) 該法是一種利用特異性抗體檢測(cè)病甲中真菌抗原的免疫學(xué)診斷方法,如膠體金法、側(cè)流免疫層析法(lateral flow immunochromatographic assay,LFIA)等。日本學(xué)者利用膠體金技術(shù)開發(fā)了一種可檢測(cè)絕大部分甲真菌病病原真菌的體外診斷試劑盒,其靈敏度高達(dá)98.0%,而特異度為88.2%[20]。Tsuboi等[21]應(yīng)用側(cè)流免疫層析法對(duì)甲真菌病患者進(jìn)行紅色毛癬菌特異性抗原檢測(cè),結(jié)果顯示,在不能檢測(cè)其他真菌的情況下,該方法靈敏度和特異度分別為84.8%和83.9%。該法用目視即可完成檢測(cè)結(jié)果的判斷,對(duì)檢測(cè)人員和檢測(cè)設(shè)備的要求不高,可用于疾病初篩和流行病學(xué)調(diào)查,但由于缺少大數(shù)據(jù)的方法學(xué)研究,因此尚未取得臨床的認(rèn)可。

2.1.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA) 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定指將可溶性的抗原或抗體結(jié)合到聚苯乙烯等固相載體上,利用抗原抗體特異性結(jié)合進(jìn)行免疫反應(yīng)的定性和定量檢測(cè)方法。Méhul等[22]用重組的紅色毛癬菌和趾間毛癬菌的類枯草桿菌蛋白酶6(subtilisin-like protease 6,Sub6)作為抗原分別制備了Sub6的兔抗血清和小鼠單克隆抗體,并應(yīng)用ELISA(雙抗體夾心法)對(duì)患者進(jìn)行了檢測(cè),顯示出該方法具有較高的靈敏度和特異度。

2.2 基于PCR的分子生物學(xué)鑒定技術(shù)

生物學(xué)鑒定技術(shù)主要有常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR),熒光實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR),巢式PCR(nest-PCR),多重 PCR(mutiplex -PCR),限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-RFLP)等,具有敏感性高、檢測(cè)快、不受檢測(cè)人員形態(tài)學(xué)鑒定水平的限制等優(yōu)點(diǎn),有廣闊的應(yīng)用前景。

2.2.1 PCR 是一種利用特異性引物擴(kuò)增DNA片段來鑒定真菌的分子生物學(xué)技術(shù),即用真菌特異的分子引物來擴(kuò)增測(cè)試樣品中的真菌DNA,以鑒定真菌生物亞型,具有較高的敏感度和特異度[23-24]。該法在鏡檢陽(yáng)性但真菌培養(yǎng)陰性的疑似患者標(biāo)本的檢測(cè)中顯示出巨大的優(yōu)勢(shì),但在應(yīng)用該法時(shí)需要考慮成本、假陽(yáng)性、假陰性以及污染的可能。

2.2.2 RT-PCR 是一種使用不同的特異性引物,結(jié)合探針作為染料,直接從臨床樣本中檢測(cè)出一種或多種皮膚癬菌的分子方法。應(yīng)用RT-PCR法可顯著提高甲真菌病致病菌的檢出率,可將真菌鑒定精確至屬種水平[24-27]。該方法在其他病原生物的診斷上已經(jīng)取得臨床工作者的認(rèn)可,是一種很有應(yīng)用前景的診斷技術(shù)。

2.2.3 nest-PCR 巢式PCR技術(shù)由初級(jí)和次級(jí)擴(kuò)增組成,初級(jí)擴(kuò)增的產(chǎn)物用作次級(jí)擴(kuò)增的模板,以提高特異度和靈敏度[28-29]。楊靜等[30]基于28 S rRNA基因序列的巢式PCR方法快速檢測(cè)甲真菌病真菌種類,巢式PCR敏感性為93.33% (168/180),特異性為100% (168/168)。巢式PCR因涉及兩次擴(kuò)增步驟,污染風(fēng)險(xiǎn)更高。

2.2.4 PCR-RFLP 是一種擴(kuò)增含有小規(guī)模遺傳變異核酸的特定片段,然后用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶處理,根據(jù)片段的電泳結(jié)果進(jìn)行鑒定的技術(shù)。目前,PCR-RFLP已經(jīng)能夠直接從指甲、皮膚或頭發(fā)樣本中成功檢測(cè)到紅色毛癬菌和須癬毛癬菌[31-32]。PCR-RFLP簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、不依賴先進(jìn)的儀器設(shè)備,但是需要限制性內(nèi)切酶、操作復(fù)雜以及耗時(shí)費(fèi)力的缺點(diǎn)限制了其在臨床上的應(yīng)用。

2.2.5 PCR-酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(polymerase chain reaction-enzyme-linked immunosorbent assay,PCR-ELISA) 是一種應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)PCR產(chǎn)物的定量試驗(yàn)。這一技術(shù)相對(duì)于傳統(tǒng)的凝膠光密度定量,在靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度上有很大的提升,可滿足臨床診斷甲真菌感染的要求,并且只要有擴(kuò)增儀和酶標(biāo)儀就可以進(jìn)行。但有研究發(fā)現(xiàn),PCR-ELISA應(yīng)用于甲真菌病的致病菌診斷及鑒定時(shí),其檢出率并未體現(xiàn)出巨大的優(yōu)勢(shì)[33]。Savin等[34]對(duì)法國(guó)生產(chǎn)的一種甲真菌病PCR-ELISA診斷試劑進(jìn)行評(píng)估,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在經(jīng)真菌學(xué)證實(shí)的患者標(biāo)本中僅有86.3%的檢出率,且未能鑒定至屬、種水平。因此,該法仍需在檢出效能和種屬鑒定上繼續(xù)探索。

2.3 基因芯片技術(shù)(gene chip)

基因芯片技術(shù)是同時(shí)將大量的探針分子固定到固相支持物上,借助核酸分子雜交配對(duì)的特性對(duì)DNA樣品的序列信息進(jìn)行高效的解讀和分析,包括寡核苷酸微陣列(Oligo-microarray)及DNA微陣列(DNA microarray)。目前該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用到各種病原生物的檢測(cè)中,具有高通量、速度快、靈敏度和特異度高等優(yōu)點(diǎn)。Han 等[35]基于真菌rRNA ITS序列設(shè)計(jì)了一組DNA微陣列,以真菌培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn),其陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值顯著高于真菌培養(yǎng)法,且檢測(cè)時(shí)間不超過24 h?；蛐酒夹g(shù)僅需要18 h就可以1次檢測(cè)50多種不同的微生物,靈敏度明顯高于直接鏡檢法和培養(yǎng)法[36]?；蛐酒夹g(shù)可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)基因表達(dá)譜,在分子診斷和研究上有巨大潛力,但技術(shù)復(fù)雜,操作難度高,單次檢測(cè)成本較高,還存在誤差和可重復(fù)性差的局限,故該技術(shù)需在成本與質(zhì)量控制上進(jìn)一步探索。

2.4 恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)與常規(guī)PCR相比,不需要模板的熱變性、溫度循環(huán)、電泳及紫外觀察等過程。該技術(shù)在靈敏度、特異性和檢測(cè)范圍等指標(biāo)上能媲美甚至優(yōu)于PCR技術(shù),不依賴任何專門的儀器設(shè)備實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)高通量快速檢測(cè),檢測(cè)成本遠(yuǎn)低于熒光定量PCR,具有簡(jiǎn)單、快速、特異性強(qiáng)的特點(diǎn),目前已成功地應(yīng)用于分子生物學(xué)領(lǐng)域。已有學(xué)者成功應(yīng)用LAMP技術(shù)鑒定出甲真菌病患者的病原真菌,并顯示出極高的靈敏度和特異度[37],但該技術(shù)仍處于初級(jí)階段,還存在非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物不易鑒別等問題,故目前應(yīng)用LAMP技術(shù)鑒別病原真菌的研究較少,其未來發(fā)展?jié)摿薮蟆?/p>

2.5 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)

MALDI-TOF MS 是一種基于蛋白質(zhì)組學(xué)的研究技術(shù),能夠直接測(cè)定蛋白質(zhì)、多肽、核酸、寡糖等生物大分子。臨床標(biāo)本經(jīng)分離和純培養(yǎng)后,可通過質(zhì)譜技術(shù)獲得可疑菌落病原體的蛋白質(zhì)譜峰圖,將其與數(shù)據(jù)庫(kù)中參考光譜的特征峰進(jìn)行對(duì)比,即可得到鑒定結(jié)果,匹配度越高,結(jié)果越可信。目前,已有學(xué)者成功應(yīng)用這項(xiàng)技術(shù)對(duì)甲真菌病病原真菌進(jìn)行了種屬鑒定,顯示出較高的靈敏度和特異度[38-39]。但此方法受限于真菌的分離與培養(yǎng),因此并不能用于培養(yǎng)陰性的標(biāo)本檢測(cè)。此外,質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)還受圖譜庫(kù)的豐度、提取方法等因素的影響。

2.6 光譜學(xué)鑒定

2.6.1 紅外光譜分析 紅外吸收光譜是利用物質(zhì)對(duì)不同頻率紅外光的吸收特性,獲得分子內(nèi)化學(xué)鍵、官能團(tuán)的振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)信息進(jìn)行物質(zhì)分析鑒定的方法。隨著傅里葉變換紅外光譜學(xué)技術(shù)(frourier transform infrared spectroscopy,FTIR)的出現(xiàn)和衰減全反射技術(shù)(attenuated total refraction,ATR)的應(yīng)用,紅外光譜分析技術(shù)逐步開始在微生物檢測(cè)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。De Bruyne 等[40]利用ATR-FTIR譜技術(shù)成功用于探測(cè)、鑒定甲真菌病體外模型和活體甲標(biāo)本中的致病菌至屬或種的水平。與目前其他致病真菌檢測(cè)方法相比,紅外光譜技術(shù)具有適用范圍廣、判斷準(zhǔn)確、快捷、費(fèi)用低的特點(diǎn),具有廣闊的臨床應(yīng)用前景,但仍需解決真菌培養(yǎng)方法及預(yù)處理過程的標(biāo)準(zhǔn)化、設(shè)備成本的優(yōu)化、致病真菌紅外光譜參考數(shù)據(jù)庫(kù)的建立和分析方法的程序化等問題。

2.6.2 拉曼光譜分析 拉曼光譜分析法是基于拉曼散射光譜,對(duì)與入射光頻率不同的散射光譜進(jìn)行分析以得到分子振動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)方面信息,并應(yīng)用于分子結(jié)構(gòu)研究的一種分析方法。利用已構(gòu)建的生物大分子拉曼光譜數(shù)據(jù)庫(kù)[41],學(xué)者們運(yùn)用拉曼光譜分析可以準(zhǔn)確地鑒定出皮膚癬菌、酵母菌和霉菌,并且可以達(dá)到屬、種甚至菌株水平[42-44]。Smijs 等[45]應(yīng)用拉曼光譜分析技術(shù)對(duì)厚為50 μm的人離體甲感染模型進(jìn)行分析,準(zhǔn)確鑒定出紅色毛癬菌、白念珠菌、短帚霉等常見的甲真菌病病原體。該方法用于致病真菌的檢測(cè)時(shí)具有很多優(yōu)勢(shì):標(biāo)本需要量少,靈敏度高,可達(dá)單個(gè)孢子水平;能直接使用固體培養(yǎng)基上的菌落,無(wú)需樣本標(biāo)記或染色等預(yù)處理,耗材少;操作簡(jiǎn)便,測(cè)定時(shí)間短等。但此方法也存在試驗(yàn)條件與設(shè)備要求高,數(shù)據(jù)庫(kù)缺乏和數(shù)據(jù)分析繁瑣,部分相似的菌種難以區(qū)分等問題。

3 傳統(tǒng)檢測(cè)方法與新興檢測(cè)技術(shù)的比較

以直接鏡檢、真菌培養(yǎng)和病理組織檢查為主的傳統(tǒng)診斷技術(shù)被廣泛地應(yīng)用于臨床診斷工作中,仍是甲真菌病真菌學(xué)診斷的主要手段。然而傳統(tǒng)技術(shù)在真菌種屬的鑒定上存在明顯的局限,主要體現(xiàn)為嚴(yán)重依賴檢測(cè)人員的技術(shù)水平和檢測(cè)周期過長(zhǎng)。免疫學(xué)診斷、分子生物學(xué)診斷、MALDI-TOF MS 和光譜學(xué)診斷等新興技術(shù)在很大程度上擺脫了對(duì)檢測(cè)人員技術(shù)水平的依賴,通常都具有快速簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn),但也明顯存在檢測(cè)成本高、操作流程和技術(shù)尚未標(biāo)準(zhǔn)化、檢測(cè)結(jié)果存在一定的假陰性與假陽(yáng)性等局限,因此尚未獲得臨床工作者的認(rèn)可。傳統(tǒng)檢測(cè)方法與新興檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)劣詳見表1。

表1 甲真菌病真菌學(xué)傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)與新興檢測(cè)技術(shù)的比較Table 1 Comparison of traditional and emerging mycological detection technologies for onychomycosis

4 結(jié)語(yǔ)與展望

快速準(zhǔn)確的真菌學(xué)診斷是治愈甲真菌病和防治復(fù)發(fā)的關(guān)鍵因素,而目前針對(duì)甲真菌病的傳統(tǒng)檢測(cè)方法與新興檢測(cè)技術(shù)各有優(yōu)缺點(diǎn)。開發(fā)真菌學(xué)檢測(cè)方法成為甲真菌病診治領(lǐng)域的研究熱門。隨著科技的進(jìn)步,基于深度學(xué)習(xí)技術(shù)與人工智能技術(shù)在醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域取得了重大進(jìn)展,相信不管是基于形態(tài)學(xué)的真菌學(xué)傳統(tǒng)診斷技術(shù),還是與醫(yī)學(xué)免疫學(xué)、分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)物理學(xué)緊密相關(guān)的新興診斷技術(shù),亦或是甲真菌病臨床診斷技術(shù),也將迎來廣闊的發(fā)展前景。