L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸混合液對抗二氯喹啉酸孔雀稗生長、生理和乙烯信號途徑相關基因表達的影響

汪 鵬, 周 浪, 趙 義, 林熠斌, 姚 明, 王向磊, 宋圓圓*,,3

(1.福建農林大學 農學院 作物遺傳育種與綜合利用教育部重點實驗室，福州 350002；2.福建農林大學 作物生物技術福建省高校重點實驗室，福州 350002；3.福建農林大學 閩臺作物生物育種農業(yè)農村部重點實驗室，福州 350002；4.山東京衛(wèi)制藥有限公司，山東 泰安 271000)

稻田雜草種類多樣，禾本科稗屬 (Echinochloaspp.) 植物是危害最為嚴重的稻田雜草之一，其中孔雀稗Echinochloa crus-pavonis喜深水田，是一些濕地中的惡性雜草[1]。二氯喹啉酸 (quinclorac)是目前水稻田中應用最為廣泛的除草劑品種之一[2]，屬于典型的生長激素類型除草劑，作用機理主要是通過誘導乙烯的生物合成而抑制稗草生長，雜草中毒后癥狀與生長素過量時相似，高濃度下表現為對植物細胞分裂、節(jié)間延長乃至葉、莖生長的顯著抑制作用，并最終使植株枯黃、壞死[3-5]。二氯喹啉酸能被稗屬雜草吸收進入植株體內并迅速傳導，進一步誘導根部細胞產生乙烯合成的前體物質——1-氨基環(huán)丙基-1-羧酸(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid，ACC)，再經ACC 氧化酶 (ACC oxidase, ACO) 氧化生成乙烯，在此過程中產生的衍生物氫氰酸 (hydrogen cyanide，HCN)累積在稗草組織中能夠抑制稗草的生長[4-7]。因此，二氯喹啉酸誘導乙烯生物合成而引起的氫氰酸積累被認為是該除草劑的主要作用機制[8-9]。

由于頻繁、長期使用二氯喹啉酸，田間已出現對二氯喹啉酸具有高水平抗性的稗草生物型群體[10-12]。有研究認為，稗屬雜草對二氯喹啉酸抗性的產生是因為ACC 合成酶 (ACC synthase，ACS)的活性受到抑制，導致乙烯生物合成的直接前體ACC 含量不足，致使乙烯的生物合成途徑被抑制而造成的[13-14]。β-氰丙氨酸合成酶 (β-cyanoalanine synthase，β-CAS) 活性的提高也可以提升稗屬雜草對二氯喹啉酸的抗性[15]。水稻葉片中的β-CAS可以降解乙烯生物合成途徑中產生的有毒副產物氫氰酸[16-17]，這也是目前植物中所發(fā)現的氫氰酸降解的唯一途徑。此外，植物體中的一些保護酶如超氧化物歧化酶 (SOD)、過氧化氫酶 (CAT) 和過氧化物酶 (POD) 等也參與了植物對逆境脅迫的適應，這些酶活性的強弱在一定程度上反映了植物抵抗逆境的能力[18-20]。谷胱甘肽S-轉移酶 (GSTs) 能夠調節(jié)氧化還原狀態(tài)，解毒代謝產物，維持免疫穩(wěn)態(tài)，在植物抵御非生物脅迫時也起著重要作用[21-22]。

現今，有關稗屬雜草對二氯喹啉酸抗性的研究大多集中在抗性相關基因方面[23]，從代謝角度進行的研究還鮮有報道。氨基酸廣泛參與植物的蛋白質合成及多種代謝過程，進而影響植物的生長發(fā)育與對逆境脅迫的適應性，而外源施加氨基酸也可作為氮素營養(yǎng)與信號分子影響植物的生長與抗逆[24-27]?，F有研究發(fā)現，在擬南芥中，外源施加L-谷氨酰胺 (L-Gln)、L-天冬酰胺 (L-Asn) 及L-天冬氨酸 (L-Asp) 等氨基酸可促進植物生長[23,26]。Saeed 等[24]對大豆的研究也發(fā)現，添加氨基酸處理顯著提高了大豆地上部分生長參數、鮮重和莢果產量。可見，外源施加氨基酸在平衡植物的產量和品質，特別是調節(jié)次級代謝產物的水平方面發(fā)揮著重要作用。

本研究探索了外源混施L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸對二氯喹啉酸抗性孔雀稗抗藥性的影響，進一步測定了抗性孔雀稗的生物表型及植株體內保護酶系 (SOD、CAT 及POD) 和解毒酶GSTs 的活性變化，并對乙烯合成通路中ACS、ACO 1和與氰化物解毒相關的β-CAS基因進行了熒光定量PCR 檢測，以期探索外源添加L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸混合液對抗二氯喹啉酸孔雀稗生長、生理和乙烯信號途徑相關基因表達的影響。

1 材料與方法

1.1 供試材料

對二氯喹啉酸具有中高水平抗性的孔雀稗Echinochloa crus-pavonis(編號：3008A-20) 種子由江蘇省農業(yè)科學院植物保護研究所李永豐研究員提供[28-29]，整株水平法測得其GR50值為有效成分1519.23 g/hm2，對二氯喹啉酸的抗性指數為 8.87[28]。試驗土壤取自福建農林大學校園農場，過10 mm篩，高壓蒸汽濕熱滅菌2 次 (每次30 min，103 kPa，121 ℃)。

萬分之一電子天平，上海奧豪斯有限公司。RNA 提取試劑盒，上海普洛麥格生物產品有限公司；反轉錄和熒光定量PCR 試劑盒，北京蘭博利德生物技術有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 藥劑配制 50% 二氯喹啉酸可濕性粉劑(quinclorac 50% WP) 購自中國江蘇省激素研究所股份有限公司，用無菌水配制成10 mmol/L 的母液備用；99%L-甲硫氨酸粉末和99%L-半胱氨酸粉末均購自中國上海麥克林生化科技有限公司，用無菌水配制成10 mmol/L 的1:1 等摩爾濃度混合母液備用。

1.2.2 試驗設計 當抗性孔雀稗幼苗生長至12 d(三葉一心左右) 時分別進行以下5 個處理：對照CK，僅添加木村B 營養(yǎng)液 (950 mL) (配方見表1)；藥劑處理1～4：分別添加1.2.1 節(jié)中配制得到的10 mmol/LL-甲硫氨酸與L-半胱氨酸1 : 1 等摩爾濃度氨基酸混合母液20、40、60 和80 mL 至木村B 營養(yǎng)液中 (終體積為950 mL)。將抗性孔雀稗幼苗置于上述5 種不同處理營養(yǎng)液中培養(yǎng)15 d (生長至4 葉一心左右) 后進行各項生理指標的測定；之后再向各處理培養(yǎng)液中分別加入10 mmol/L 的二氯喹啉酸溶液50 mL (終體積為1000 mL，除草劑終濃度為 500 μmol/L)，繼續(xù)培養(yǎng)3 d 后再進行各項生理指標的測定。

表1 木村B 營養(yǎng)液配方Table 1 Kimura B nutrient salts formula

1.2.3 試驗方法 抗性孔雀稗種子用2% 的NaClO 溶液消毒 10 min，無菌水沖洗干凈后催芽2 d。將露白的種子移栽至裝有滅菌土壤的花盆中培養(yǎng)10 d 后，選取長勢一致的幼苗移栽到12.5 cm ×8.5 cm × 11.0 cm 的六孔水培盒中進行水培。每個試驗處理設3 個重復 (3 盒)，每盒3 株，共9 株抗性孔雀稗。將各處理水培盒隨機擺放在玻璃溫室中進行培養(yǎng)，光周期14 h/10 h (L/D)，維持相對濕度在75%左右，溫度20～35 ℃。培養(yǎng)期間每天補充木村B 營養(yǎng)液使各處理塑料盒內培養(yǎng)液總體積維持在1000 mL。

1.3 測定方法

1.3.1 幼苗生長指標測定 分別測量并記錄各處理生長18 d 后抗性孔雀稗的根長 (cm) 和株高 (cm)，其中根長測量范圍為每株植物的最長主根；擦干根系和葉片表面水分，稱量整株鮮重 (g) 和根鮮重 (g)。每個處理測定9 株植物。

1.3.2 保護酶和解毒酶活性測定 采集不同處理的抗性孔雀稗葉片各100 mg，加入液氮研磨至粉末狀。分別采用紫外吸收法測定CAT 活性[29]，氮藍四唑 (NBT) 還原法測定SOD 活性[29]，愈創(chuàng)木酚法測定POD 活性[29]，咖啡酸法測定PPO 活性[30]，二硝基氯苯法測定GSTs 活性[23]。

1.3.3 總RNA 提取和cDNA 合成 分別稱取不同處理的抗性孔雀稗葉片各50 mg，加入液氮研磨至粉末狀，參照Eastep? Super 總 RNA 提取試劑盒說明方法提取葉片總RNA，經DNaseI 處理后，吸取 200 ng/μL RNA，采用蘭博利德反轉錄試劑盒逆轉錄得到cDNA，于 - 80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 實時熒光定量PCR 分析 依據實驗室前期獲得的抗性型孔雀稗基因轉錄組數據[27]，根據其基因功能注釋結果，基于浙江大學樊龍江教授團隊公布的E.crus-galli的CDS sequence[31-33]，從抗性孔雀稗基因中挑選與ACS 相關的EC_v6.g023859，與ACO 相關的EC_v6.g050359、EC_v6.g065826和EC_v6.g024163基因，與β-CAS 相關的EC_CAS基因，分別進行實時熒光定量PCR 分析。采用

NCBI Primer-BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 設計用于RT-qPCR 擴增的引物，引物序列見表2 (EC_Actin為內參基因)。根據蘭博利德PCR 試劑盒的 Ultra SYBR 三步法熒光定量程序進行熒光定量 PCR 反應，反應條件為：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40 個循環(huán)。采用 2-ΔΔCT法進行相對定量分析。引物合成由福州尚亞生物工程技術服務有限公司完成。

表2 熒光定量 PCR 分析所用特異性引物Table 2 Specific primers for real-time quantification PCR

1.4 數據處理

使用Microsoft Excel 2016 軟件處理數據，通過GraphPad Prism 9 繪制結果圖，采用SPSS 20軟件分析結果的差異顯著性。所有試驗均按照完全隨機試驗設計進行。在統計分析之前，采用Shapiro-Wilk 正態(tài)性檢驗和Levene 方差同質性檢驗檢查數據的正態(tài)性 (p＞ 0.05)。當數據滿足方差正態(tài)性和同質性假設時，采用方差分析 (ANOVA)(Tukey's post hoc test，p＜ 0.05) 比較處理組之間的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 外源氨基酸混合液對抗性孔雀稗生長的影響

結果如圖1 所示，在不添加二氯喹啉酸處理的情況下，不同濃度的L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸混合液處理對抗性孔雀稗幼苗生長無明顯影響，其根長、株高和鮮重在不同處理組之間及各處理與空白對照之間均無顯著性差異。

圖1 不同濃度L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸等比例混合液對抗性孔雀稗根長、株高和鮮重的影響Fig.1 Root length, plant height and fresh weight of quinclorac-resistant Echinochloa crus-pavonis plants treated with the equimolar mixture of L-methionine and L-cysteine at different concentrations

2.2 外源氨基酸混合液對抗性孔雀稗相關酶活性的影響

結果見圖2。與CK 相比，不同濃度L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸等比例混合液處理對抗性孔雀稗葉片中SOD 和CAT 酶活性均無顯著影響；低濃度 (200 和400 μmol/L) 氨基酸混合液處理組抗性孔雀稗葉片中PPO 酶活性與CK 相比也無顯著性差異，而高濃度 (600 和800 μmol/L) 氨基酸混合液處理組PPO 酶活性顯著下降，分別比CK 降低了35%和47%；200、600 和800 μmol/L 氨基酸混合液處理組POD 酶活性均被誘導升高，其中800 μmol/L 處理組比CK 提高了64%；200、600和800 μmol/L 氨基酸混合液處理組GSTs 酶活性與CK 相比無顯著性差異，但400 μmol/L 氨基酸混合液處理組GSTs 酶活性比CK 提高了14%，差異顯著 (p＜ 0.05)。說明不同濃度L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸混合液處理對抗性孔雀稗PPO、POD、GSTs 酶活性存在不同程度影響，但對SOD 和CAT酶活性則幾乎無影響。

圖2 不同濃度L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸等比例混合液對抗性孔雀稗相關酶活性的影響Fig.2 Enzyme activities of quinclorac-resistant Echinochloa crus-pavonis plants treated with the mixture of L-methionine and L-cysteine at different concentrations

2.3 外源氨基酸混合液對二氯喹啉酸脅迫下抗性孔雀稗耐藥性的影響

結果如圖3 所示。500 μmol/L 的二氯喹啉酸脅迫對CK 及不同濃度L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸混合液預處理組抗性孔雀稗地上部分和地下部分生長均有一定影響。在二氯喹啉酸脅迫下，與CK 相比，800 μmol/L 氨基酸混合液預處理對抗性孔雀稗生長的抑制作用最強 (圖3A)。二氯喹啉酸脅迫下，CK 組抗性孔雀稗根系生長受到明顯抑制，而200 μmol/L 氨基酸混合液預處理組根系生長受抑制情況相對較輕，但隨著氨基酸混合液預處理濃度升高，抗性孔雀稗根系生長受抑制作用變強，即氨基酸混合液對抗性孔雀稗根系生長存在低濃度促進高濃度抑制現象 (圖3B)。二氯喹啉酸脅迫下，600 和800 μmol/LL-甲硫氨酸和L-半胱氨酸混合液處理組抗性孔雀稗根系生長狀態(tài)明顯差于 200 和400 μmol/L 氨基酸混合液處理組，表明高濃度氨基酸混合液處理后可能出現了一定程度的根系中毒狀況 (圖3B)。如圖3C 所示，二氯喹啉酸脅迫下，L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸混合液處理濃度為 200 μmol/L 時，抗性孔雀稗整株鮮重、株高和根鮮重分別比CK 提高30%、24%和99%，差異顯著；600 μmol/L 氨基酸混合液處理組根長與 800 μmol/L 氨基酸混合液處理組之間具有顯著差異，但與CK 相比均無顯著差異?？傮w來看，在500 μmol/L 二氯喹啉酸脅迫下，添加L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸混合液預處理，對抗性孔雀稗生長存在一定的低濃度促進高濃度抑制現象，說明適當提高L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸混合液的施用濃度，可增強二氯喹啉酸對抗性孔雀稗的作用。

圖3 不同濃度L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸等比例混合液對二氯喹啉酸脅迫下抗性型孔雀稗幼苗生長的影響Fig.3 Effect of pre-treatment with a mixture of L-methionine and L-cysteine at different concentrations on seedling growth of quinclorac-resistant Echinochloa crus-pavonis

2.4 外源氨基酸混合液對二氯喹啉酸脅迫下抗性孔雀稗相關酶活性的影響

結果見圖4。在 500 μmol/L 二氯喹啉酸脅迫下，200 μmol/LL-甲硫氨酸和L-半胱氨酸混合液處理組抗性型孔雀稗葉片中SOD 和GSTs 酶活性達到最高，分別比CK 高出22%和22%；800 μmol/L氨基酸混合液處理下則SOD 和GSTs 酶活性最低，分別比CK 低38%和35%，存在顯著性差異。二氯喹啉酸脅迫下，不同濃度氨基酸混合液處理組抗性型孔雀稗葉片中CAT 酶活性均顯著高于CK；同時，400 μmol/L 氨基酸混合液處理組PPO 酶活性比CK 顯著提高了143%；POD 酶活性隨著氨基酸混合液處理濃度的升高而升高，到最高濃度800 μmol/L 時則與CK 相比差異不顯著?？傊?，在500 μmol/L 二氯喹啉酸脅迫下，添加不同濃度L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸混合液處理，對抗性型孔雀稗葉片中的保護酶和解毒酶如SOD、CAT、PPO、POD 以及GSTs 活性都有不同程度影響，說明施加L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸混合液可增強二氯喹啉酸對抗性孔雀稗的作用。

圖4 不同濃度L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸等比例混合液對二氯喹啉酸脅迫下抗性型孔雀稗幼苗抗性相關酶活性的影響Fig.4 Effect of pre-treatment with a mixture of L-methionine and L-cysteine at different concentrations on activities of resistance associated enzymes in seedlings of quinclorac-resistant Echinochloa crus-pavonis

2.5 外源氨基酸混合液對二氯喹啉酸脅迫下抗性孔雀稗基因表達的影響

實時熒光定量PCR 研究發(fā)現，在 500 μmol/L二氯喹啉酸脅迫下，與ACC 合成酶 (ACS) 相關的EC_v6.g023859基因表達量隨著L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸混合液處理濃度的升高而上調，其中800 μmol/L 氨基酸混合液處理組比CK 顯著上調了5.44 倍，同時與其他濃度氨基酸混合液處理組之間也均存在顯著性差異 (圖5A)；與ACC 氧化酶 (ACO) 相關的EC_v6.g050359、EC_v6.g065826和EC_v6.g024163基因的表達量隨著氨基酸混合液處理濃度的升高而上調，其中800 μmol/L 氨基酸混合液處理組EC_v6.g050359、EC_v6.g065826和EC_v6.g024163基因表達量分別比CK 上調了6.82、77.00 和18.91 倍，其余濃度氨基酸混合液處理組EC_v6.g050359、EC_v6.g065826和EC_v6.g024163的相對表達量與CK 相比也均出現了顯著性上調 (圖5B、5C、5D)；與CK 相比，600 和800 μmol/L 氨基酸混合液處理組EC_CAS基因的表達量也出現了顯著上調，上調倍數分別為4.68 和4.35 倍 (圖5E)。

圖5 不同濃度L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸等比例混合液對二氯喹啉酸脅迫下抗性型孔雀稗ACC 合成酶和ACC 氧化酶及氰化物解毒酶相關基因表達的影響Fig.5 Effect of pre-treatment with a mixture of L-methionine and L-cysteine at different concentrations on expression of ACC synthesis gene, ACC oxidation genes and cyanide detoxification enzyme gene in seedlings of quinclorac-resistant Echinochloa crus- pavonis

3 結論與討論

氨基酸是蛋白質的結構單元，同時也是很多代謝產物的合成前體，在植物代謝途徑中發(fā)揮著多種功能。已有研究表明，氨基酸類物質在植物抗逆和生長中、特別是影響次級代謝產物的水平方面具有重要作用[23-24]。氨基酸廣泛參與植物的生長發(fā)育、抗逆等生理活動，外源氨基酸也可通過參與其他代謝過程和作為信號分子促進植物生長[25-28]。本研究明確了外源添加L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸等比例混合液對抗性型孔雀稗抗除草劑二氯喹啉酸的效果：低濃度下，L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸混合液處理降低了稗草對除草劑的敏感性，高濃度下則增強了稗草對除草劑的敏感性，即外源添加L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸混合液對稗草對二氯喹啉酸耐藥性的影響存在低濃度促進高濃度抑制現象。

植物體內相關酶活性升高是增強植物防御能力和解毒能力的前提。已有研究表明，植物體內的保護酶系 (SOD、CAT、PPO、POD) 能夠消除逆境脅迫下活性氧的積累，以保證植物的正常生長[20-21]，而GSTs 酶能直接軛合除草劑并參與解毒反應，從而使雜草的耐藥性增強[18,22]。本研究發(fā)現，在500 μmol/L 二氯喹啉酸脅迫下，隨著L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸混合液處理濃度升高，抗性孔雀稗葉片中SOD、CAT、PPO 和GSTs 酶活性整體均表現為逐漸下降趨勢，而POD 酶活性則隨著氨基酸混合液處理濃度的升高而逐漸升高。在低濃度 (200 μmol/L) 氨基酸混合液處理下，二氯喹啉酸對抗性孔雀稗的毒害作用被減弱，植物中防御酶SOD、CAT、PPO 以及解毒酶GSTs 活性與CK 相比均有所升高，抗性孔雀稗對除草劑的防御能力和解毒能力得以加強，從而增強了對二氯喹啉酸的抗性；而800 μmol/L 高濃度的氨基酸混合液處理則增強了二氯喹啉酸對抗性孔雀稗的作用，導致葉片出現萎蔫及死亡，根部短小停止生長?？傊?00 μmol/L 二氯喹啉酸脅迫下，抗性型孔雀稗可顯著提高保護酶活性以抵御活性氧的積累，保護自身免受除草劑影響，而經過不同濃度的L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸混合液處理后，抗性孔雀稗的保護酶和解毒酶活性會發(fā)生相應變化，最終導致抗性孔雀稗對除草劑二氯喹啉酸的敏感性發(fā)生變化。

有研究表明，二氯喹啉酸對敏感型雜草的主要作用機制是誘導其乙烯生物合成途徑中有毒氰化物的積累[8-9]。同時亦有研究發(fā)現，乙烯合成的前體物質ACC 含量如果不足，將會導致乙烯的生物合成途徑啟動失敗，致使稗草對二氯喹啉酸抗性增強[14]，而β-CAS 酶可以降解在乙烯生物合成途徑中產生的有毒氰化物，同樣也可提高稗草對二氯喹啉酸的抗性[15-17]。本研究發(fā)現，隨著L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸混合液處理濃度升高，與乙烯生物合成相關基因的表達水平呈上調趨勢，導致稗草ACC 的合成及氧化加快，從而產生更多的乙烯，并隨之產生更多的HCN，最終導致稗草死亡。另一方面，稗草為了避免自身死亡，調動與氰化物解毒相關β-CAS 基因大量上調表達，加速降解在乙烯生物合成途徑中產生的有毒氰化物，從而提高稗草對二氯喹啉酸的抗性。推測在高濃度的L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸混合液處理下，植物降解HCN 的速度可能遠遠低于生成HCN 的速度，導致植物出現萎蔫，甚至最終死亡。

本研究通過不同濃度L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸混合液處理抗性孔雀稗后再采用二氯喹啉酸處理，測定了供試稗草的生物表型、酶活性變化以及與乙烯生物合成及氰化物解毒相關基因表達水平的變化，從上述3 個方面研究了氨基酸類代謝物L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸混合液對抗性稗草對二氯喹啉酸敏感性的影響。總體而言，外源添加L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸混合液對稗草的抗藥性具有低濃度下促進高濃度下抑制的作用；外源氨基酸可影響植物保護酶和解毒酶的活性，隨著L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸混合液濃度升高，稗草抗氧化酶SOD、CAT、PPO 以及解毒酶GSTs 活性整體均表現為逐漸下降趨勢，而POD 酶活性則隨氨基酸混合液濃度升高而逐漸升高；同時稗草乙烯信號途徑ACC 合成酶基因和ACC 氧化酶基因，以及與氰化物解毒相關的β-氰丙氨酸合成酶基因也均隨著氨基酸混合液濃度升高而上調表達，可能進一步促進了乙烯代謝產物氫氰酸的形成，進而導致稗草對除草劑的敏感性升高，抗性降低。本研究結果可為降低稻田中除草劑的施用量，以及減輕田間稗屬雜草對二氯喹啉酸的抗性提供參考。后續(xù)還將通過轉錄組學和代謝組學進一步對稗草抗藥性變化的分子機制進行探究。