蛹蟲草有效成分提取及活性分析

蘆 葉 李 麗 劉舒欣 曲葉麗 姜雯琪* 王作新 趙洪新*

（1浙江理工大學(xué)生命科學(xué)與醫(yī)藥學(xué)院，浙江杭州 310018；2上海特萊維護(hù)膚品股份有限公司，上海 201706）

蛹蟲草（Cordyceps militaris）又稱黃金草、北蟲草，是寄生于昆蟲中食用、藥用兼具的真菌，屬于蛹草科和子囊菌科，與著名中藥冬蟲夏草具有相似的藥理活性[1]，是一種藥用價(jià)值很高的珍稀大型食藥用真菌。蛹蟲草富含多糖、生物堿、氨基酸、蟲草素、蟲草酸、甾醇等[2]活性物質(zhì)，具有保濕、抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、降血糖以及免疫調(diào)節(jié)等功效。蛹蟲草多糖可用于化妝品中，且制作的蛹蟲草多糖護(hù)膚化妝品穩(wěn)定、安全、高效[3]。

目前，蛹蟲草提取物（Cordyceps militarisextract，CME）的提取方法較多，常用方法有水提法[4]、醇提法[5]、超臨界CO2提取法[6]、超聲輔助提取法[7]、微波輔助提取法[8]等。通過不同提取方法獲取的提取物成分及含量也不同，對應(yīng)的功效也有所差異?，F(xiàn)有文獻(xiàn)中，CME的提取方法多采用超聲輔助提取法，此法更加簡便高效[9]。

筆者采用超聲輔助提取制備CME，通過單因素試驗(yàn)和L9正交試驗(yàn)法優(yōu)化CME提取條件，檢測CME中多糖、總黃酮含量并探究其抗氧化性能、保濕性能，為開發(fā)蛹蟲草系列等特色化妝品奠定理論基礎(chǔ)及技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

蛹蟲草（C.militaris）子實(shí)體干品，沈陽蟲林密寶北蟲草食品科技有限公司提供。

1.2 試劑和儀器

試劑：羥自由基清除能力檢測試劑盒Fenton比色法（北京雷根生物技術(shù)有限公司）；葡萄糖（優(yōu)級純，上海麥克林生化科技股份有限公司）；蘆?。▋?yōu)級純，上海源葉生物科技有限公司）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

主要儀器：SW 30 H超聲波清洗器（Elma Schmidt Bauer Limited）、RE-52 AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）、SHZ-Ⅲ循環(huán)水真空泵（上海亞榮生化儀器廠）、ROTINA 380R高速離心機(jī)（德國Hettich科學(xué)儀器有限公司）、UV756RT紫外可見分光光度計(jì)（上海佑科儀器儀表有限公司）、10 A真空冷凍干燥機(jī)（賽飛（中國）有限公司）、GDN-300 A恒溫恒濕培養(yǎng)箱（寧波揚(yáng)輝儀器有限公司）、PB-10 pH計(jì)（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）、Synergy HTX多功能酶標(biāo)檢測儀（美國BIOTEX公司）。

1.3 CME提取工藝優(yōu)化

1.3.1 單因素提取工藝優(yōu)化

蛹蟲草干品粉碎后過篩（孔徑0.178 mm），稱1 g蛹蟲草粉，與一定體積去離子水混合于錐形瓶中，室溫下浸泡24 h。選取適當(dāng)?shù)奶崛囟?、水料比、提取時(shí)間和提取次數(shù)進(jìn)行超聲波輔助（35 kHz）提取，提取液真空抽濾，取濾液真空旋蒸，旋蒸后的濃縮液緩慢滴加無水乙醇（濃縮液∶無水乙醇體積（mL）比=1∶4），于4 ℃冰箱靜置約12 h。將靜置液離心，棄上清，用丙酮充分洗滌沉淀，室溫下靜置過夜。再用無水乙醇充分洗滌沉淀，后過濾、干燥。將干燥物溶解于40 mL去離子水中，置于-80 ℃冰箱反復(fù)凍融，使蛋白質(zhì)變性、降解，離心后棄沉淀取上清，重復(fù)以上操作直至離心后無沉淀析出，初步去除蛋白質(zhì)。提取液按照體積（mL）比4∶1與sevag試劑（氯仿∶正丁醇=4∶1）混合，在搖床上充分振蕩后離心取上清液，上述操作重復(fù)5次以上，離心至溶液無中間層出現(xiàn)，徹底去除剩余雜質(zhì)蛋白。上清液經(jīng)冷凍干燥處理即可得到蛹蟲草提取物（CME）。

以CME提取率為評價(jià)指標(biāo)，比較分析超聲輔助提取法提取過程中水（mL）料（g）比（25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1），提取次數(shù)（1次、2次、3次、4次、5次），提取時(shí)間（30 min、45 min、60 min、75 min、90 min），提取溫度（65 ℃、70 ℃、75 ℃、80 ℃、85 ℃）。CME得率計(jì)算公式如下：

CME提取率（%）=M1/M2×100%

注：M1為CME的質(zhì)量，單位為g；M2為蛹蟲草干品的質(zhì)量，單位為g。

1.3.2 正交優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以水料比、提取次數(shù)、提取時(shí)間、提取溫度4個(gè)因素為自變量設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，確定最佳提取條件。

1.4 生物活性成分測定

1.4.1 多糖含量測定

采用苯酚-硫酸法[10]（以葡萄糖為多糖標(biāo)準(zhǔn)品）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算CME的多糖含量。

配制待測液：將0.01 g CME溶于1 mL去離子水中。0.2 mL 5%苯酚溶液加入待測溶液中搖勻，加入1 mL濃硫酸溶液混勻，放入沸水內(nèi)煮15 min，然后立即放入冰盒中冷卻5 min。于紫外分光光度計(jì)490 nm處測定OD值，平行測定3組后取平均值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算CME的多糖含量。

1.4.2 總黃酮含量測定

采用亞硝酸鈉硝酸鋁比色法[11]（以蘆丁為黃酮標(biāo)準(zhǔn)品）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算CME的總黃酮含量。

配制待測液：將0.01 g CME溶于1 mL 70%乙醇中。60 μL 5%NaNO2溶液加到待測溶液中搖勻并靜置5 min，加入60 μL 10%Al（NO3）3溶液混勻，靜置5 min，再加入0.8 mL 4%NaOH溶液混勻，最后加入80 μL 70%乙醇混勻，靜置15 min。96孔板中每孔加入200 μL，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。于酶標(biāo)儀510 nm處測定OD值，從而計(jì)算出CME的總黃酮成分的含量。

1.5 抗氧化能力測定

1.5.1 羥自由基清除能力測定

分別取0.06 g/L、0.12 g/L、0.24 g/L、0.48 g/L、0.96 g/L、1.92 g/L質(zhì)量濃度的CME和0.06 g/L、0.12 g/L、0.24 g/L、0.48 g/L、0.96 g/L、1.92 g/L質(zhì)量濃度的L-抗壞血酸，測定其羥基自由基清除率。根據(jù)羥自由基清除能力檢測試劑盒Fenton比色法說明書操作，于紫外分光光度計(jì)536 nm處測定OD值，三組平行測定后取平均值。根據(jù)公式計(jì)算各質(zhì)量濃度L-抗壞血酸和CME的羥自由基清除率：

羥自由基清除率（%）=（A2-A1）/（A0-A1）×100%

注：A2為測定組OD值；A1為對照組的OD值；A0為空白組的OD值

1.5.2 DPPH自由基清除能力測定[12]

分別取0.06 g/L、0.12 g/L、0.24 g/L、0.48 g/L、0.96 g/L、1.92 g/L質(zhì)量濃度的CME與0.06 g/L、0.12 g/L、0.24 g/L、0.48 g/L、0.96 g/L、1.92 g/L質(zhì)量濃度的L-抗壞血酸，測定其DPPH自由基清除率。A2組：1 mL樣品溶液和1 mL 0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液加到5 mL鋁箔覆蓋的EP管中混合。A1組：1 mL樣品溶液和1 mL乙醇溶液加到5 mL鋁箔覆蓋的EP管中混合。A0組：1 mL去離子水和1 mL DPPH-乙醇溶液加到5 mL鋁箔覆蓋的EP管中混合。充分混勻后避光反應(yīng)0.5 h，于紫外分光光度計(jì)517 nm處測定OD值，平行測定3組后取平均值，以L-抗壞血酸作為陽性對照。計(jì)算公式如下：

DPPH自由基清除率（%）=[1-（A2-A1）/A0]×100%

1.5.3 ABTS自由基清除能力的測定[13]

分別取0.06 g/L、0.12 g/L、0.24 g/L、0.48 g/L、0.96 g/L、1.92 g/L質(zhì)量濃度的CME與0.06 g/L、0.12 g/L、0.24 g/L、0.48 g/L、0.96 g/L、1.92 g/L質(zhì)量濃度的L-抗壞血酸測定其ABTS自由基清除率。按1∶1混合7 mmol/L ABTS水溶液和2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液，室溫避光反應(yīng)（14±2）h。使用前用無水乙醇稀釋約30倍使其在734 nm處OD值為0.68～0.72。A1組：30 μL樣品溶液和2.4 mL稀釋后的ABTS溶液混合。A2組：30 μL樣品溶液和2.4 mL無水乙醇混合。A0組：30 μL無水乙醇和2.4 mL稀釋后的ABTS溶液混合。充分混勻后室溫下避光孵育10 min，于紫外分光光度計(jì)734 nm處測定OD值，平行測定3組后取平均值，以L-抗壞血酸作為陽性對照。計(jì)算公式如下：

ABTS自由基清除率（%）=[1-（A1-A2）/A0]×100

1.5.4 總抗氧化能力測定（FRAP法）[14]

采用FRAP法測定CME的總抗氧化能力。配制300 mmol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液、10 mmol/LTPTZ溶液和20 mmol/L FeCl3，按照10∶1∶1混合成FRAP工作液（現(xiàn)配現(xiàn)用），F(xiàn)RAP工作液使用前放入37 ℃水浴鍋中孵育5 min。將80 μL濃度為50～800 μmol/L的FeSO4和0.72 mL FRAP工作液混合，37 ℃孵育4 min，于593 nm處測定OD值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。測得的FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.0012x-0.0045，相關(guān)系數(shù)R2=0.9995，其中x為FeSO4濃度，y為吸光值。

圖1 FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別以0.08 mL的體積質(zhì)量濃度分別為0.06 g/L、0.12 g/L、0.24 g/L、0.48 g/L、0.96 g/L、1.92 g/L的CME樣品溶液替代FeSO4標(biāo)準(zhǔn)液，與FRAP工作液混合均勻；同時(shí)用0.72 mL無水乙醇替代FRAP工作液，與0.08 mL不同質(zhì)量濃度的CME樣品溶液反應(yīng)，振蕩，37 ℃孵育4 min，于593 nm處測OD值，根據(jù)FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出的相應(yīng)濃度即為FRAP值[15]。設(shè)置3組平行，以L-抗壞血酸作陽性對照。

1.6 保濕能力測定

根據(jù)QB/T 4256—2011[16]方法，化妝品及其原料保濕能力通常采取體外法的物理化分析法進(jìn)行研究，采用稱重法評判CME的保濕性。精確稱量5.0 000 g去離子水、10% CME、10%甘油于稱量瓶中，將稱重后的樣品分別放入20 ℃相對濕度43%、20 ℃相對濕度85%恒溫恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)，分別在1 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h時(shí)稱取三者質(zhì)量，設(shè)置3組平行進(jìn)行測定。保濕率計(jì)算公式如下：

保濕率（%）=（M2-M1）/M0×100

注：M2為稱量瓶與樣品總質(zhì)量；M1為稱量瓶質(zhì)量；M0為樣品質(zhì)量

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

均采用Graphpad Prism、Origin 2021處理數(shù)據(jù)并分析作圖，Adobe Illustrator 2020進(jìn)行圖片處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 水料比對CME提取率的影響

隨著水料比的增加，CME提取率先升高后降低，由圖2a可知，當(dāng)水（mL）料（g）比從25∶1上升至40∶1時(shí)，CME提取率呈逐漸上升趨勢，CME提取率從3.88%增加到最大提取率5.33%。但若水料比繼續(xù)增加，提取率呈下降趨勢，其原因可能是水料比的增加使提取體系的傳熱功能降低，從而不利于提取物的成分溶解[17]。因此選取水料比（mL∶g）35∶1、40∶1和45∶1進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)。

圖2 CME提取單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.2 提取次數(shù)對CME得率的影響

隨著提取次數(shù)的增加，CME提取率先升高后降低，由圖2b可知，提取次數(shù)≤3次時(shí)，CME提取率隨提取次數(shù)的增加而增加，提取3次時(shí)，CME提取率達(dá)5.10%，顯著高于提取2次時(shí)的CME提取率；提取次數(shù)超過3次，CME提取率會隨著提取次數(shù)的增加而略有下降，其原因可能是超過一定提取次數(shù)后，CME無法進(jìn)一步溶解[18]。因此選取提取次數(shù)為2次、3次、4次進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)。

2.1.3 提取時(shí)間對CME提取率的影響

隨著提取時(shí)間的增加，CME得率先升高后降低，由圖2c可知，提取時(shí)間從35 min增加到75 min，CME提取率呈逐步上升趨勢，由3.88%上升到最大提取率5.01%，呈明顯上升趨勢。提取時(shí)間大于75 min，隨提取時(shí)間的延長，提取率反而下降?？赡茉谔崛r(shí)間小于75 min時(shí)，超聲波的破碎作用可以提高CME的提取率，同時(shí)超聲波對CME的降解作用影響較小，因此在此時(shí)間內(nèi)CME提取率隨時(shí)間增加而提高[19]。但在75 min后，較長的時(shí)間使CME的降解作用影響變大，反而導(dǎo)致CME得率下降。因此選取提取時(shí)間60 min、75 min、90 min進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)。

2.1.4 提取溫度對CME提取率的影響

隨著提取溫度的升高，CME提取率先升高后降低，由圖2 d可知，隨著提取溫度升高，CME提取率先上升后下降，提取溫度為80 ℃時(shí)，CME提取率達(dá)到最高，為5.79%?？赡茉蚴?0～80 ℃時(shí)，隨著溫度不斷升高，溶質(zhì)分子溶出的速度加快，從而提取率升高[20]。但隨著溫度繼續(xù)升高，可能CME結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，發(fā)生副反應(yīng)等。因此，選取提取溫度為75 ℃、80 ℃、85 ℃進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，見表1。由表2可知，對CME提取率影響最大的是提取溫度，其次是水料比、提取次數(shù)，提取時(shí)間對CME提取率的影響最小。超聲輔助提取CME的最佳提取工藝參數(shù)為A2B2C2D2，但因?yàn)檎辉囼?yàn)中沒有出現(xiàn)A2B2C2D2，所以進(jìn)行該條件的補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)：在A2B2C2D2條件下提取CME，提取率為7.51%，均高于正交試驗(yàn)的所有組合。因此超聲波輔助提取CME最佳的提取條件：提取溫度為80 ℃、水（mL）料（g）比為40∶1、提取次數(shù)為3次、提取時(shí)間為75 min為。

表1 試驗(yàn)因素水平及編碼

表2 CME正交試驗(yàn)結(jié)果

2.3 活性成分測定結(jié)果

2.3.1 多糖含量測定

葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.1228x+0.0839，R2=0.9877。根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算CME的多糖含量為67.29%±0.58%。

2.3.2 總黃酮含量測定

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=5.193 1x+0.063 8，R2=0.998 7。根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，CME總黃酮含量為1.93%±0.06%。

2.4 抗氧化能力測定結(jié)果

2.4.1 羥自由基清除能力測定

由圖5a可知，在質(zhì)量濃度為0.06～1.92 g/L時(shí)，CME和L-抗壞血酸對羥自由基的清除能力均有明顯提升。CME對羥自由基的清除率從53.79%增加到65.04%，L-抗壞血酸對羥自由基的清除率從90.59%增加到98.77%。CME羥自由基的清除能力隨質(zhì)量濃度增加而上升，而L-抗壞血酸羥自由基的清除能力隨質(zhì)量濃度增加而上升的趨勢變化較小。試驗(yàn)結(jié)果表明，CME與陽性對照L-抗壞血酸相比，CME對羥自由基的清除率較弱，但CME依然表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除羥自由基的能力。

圖5 CME抗氧化活性測定結(jié)果

2.4.2 DPPH自由基清除能力測定

由圖5b可知，在質(zhì)量濃度為0.06～1.92 g/L時(shí)，CME和L-抗壞血酸對DPPH自由基的清除能力均有明顯增強(qiáng)的趨勢。CME對DPPH自由基的清除率從21.20%增加到53.30%，L-抗壞血酸對DPPH自由基的清除率從95.09%增加到96.24%。CME對DPPH自由基的清除能力隨質(zhì)量濃度增加而上升，而L-抗壞血酸對DPPH自由基的清除能力隨質(zhì)量濃度增加而上升的趨勢變化較小。結(jié)果表明，CME與陽性對照L-抗壞血酸相比，CME對DPPH自由基的清除率較弱，但CME依然表現(xiàn)出比較強(qiáng)的清除DPPH自由基的能力。

2.4.3 ABTS自由基清除能力測定

由圖5c可知，在質(zhì)量濃度為0.06～1.92 g/L時(shí)，CME和L-抗壞血酸對ABTS自由基的清除能力均有明顯增強(qiáng)的趨勢。CME對ABTS自由基的清除率從11.27%增加到19.98%，L-抗壞血酸對ABTS自由基的清除率從20.27%增加到98.01%。CME對ABTS自由基的清除能力隨質(zhì)量濃度增加而上升，而L-抗壞血酸對ABTS自由基的清除能力隨質(zhì)量濃度增加而上升的趨勢變化較小。結(jié)果表明，CME與陽性對照L-抗壞血酸相比，CME對ABTS自由基的清除率較弱，但CME依然表現(xiàn)出比較強(qiáng)的清除ABTS自由基的能力。

2.4.4 總抗氧化能力測定（FRAP法）

由圖5d可知，在質(zhì)量濃度為0.06～1.92 g/L時(shí)，CME和L-抗壞血酸的總抗氧化能力均有明顯增強(qiáng)的趨勢。CME對FRAP鐵離子的還原能力從2 192.24 μmol/L增加到2 575.75 μmol/L，L-抗壞血酸對FRAP鐵離子的還原能力從1 158.62 μmol/L增加到2 782.83 μmol/L。在質(zhì)量濃度為0.06～0.24 g/L時(shí)，CME對FRAP鐵離子的還原能力明顯強(qiáng)于L-抗壞血酸，但隨著質(zhì)量濃度的增加，L-抗壞血酸對FRAP鐵離子的還原能力逐漸強(qiáng)于CME。結(jié)果表明，CME與陽性對照L-抗壞血酸相比，CME對FRAP鐵離子的還原能力較弱，但CME依然表現(xiàn)出比較強(qiáng)的FRAP鐵離子的還原能力。

2.5 保濕能力測定結(jié)果

含有3個(gè)羥基結(jié)構(gòu)的甘油是非常優(yōu)秀的保濕劑，以10%的甘油作為參照評價(jià)CME的保濕效果。由圖6可知，0～24 h，相對濕度為85%條件下，10%CME保濕效果始終優(yōu)于去離子水但低于10%甘油溶液；在相對濕度為43%條件下，0～9 h，10%CME保濕效果優(yōu)于去離子水且優(yōu)于10%甘油溶液，9～24 h時(shí)，10%CME保濕效果優(yōu)于去離子水但略低于10%甘油溶液。當(dāng)時(shí)間為24 h，相對濕度為85%條件下，10%甘油保濕率為97.60%，10%CME保濕率為95.83%；當(dāng)時(shí)間為24 h，相對濕度為43%條件下，10%甘油保濕率為90.60%，10%CME保濕率為87.74%。CME的保濕效果僅略低于甘油，說明CME表現(xiàn)出良好的保濕能力，可以作為良好的保濕劑。

圖6 CME保濕能力測定結(jié)果

3 小結(jié)

采用超聲輔助提取珍稀大型食藥用真菌蛹蟲草有效成分并優(yōu)化提取條件，確定CME提取率最高達(dá)7.51%。影響CME提取率的最主要因素為提取溫度。測定CME中的活性成分表明，糖含量可達(dá)67.29%，總黃酮含量達(dá)1.93%，說明CME大部分組成成分為多糖，可預(yù)估CME有良好的保濕及抗氧化功效；CME對羥自由基、ABTS自由基和DPPH自由基的清除能力及鐵離子還原能力測定結(jié)果表明，在質(zhì)量濃度為0.06～1.92 g/L時(shí)，其清除自由基及還原能力均隨質(zhì)量濃度增加呈上升趨勢。當(dāng)質(zhì)量濃度為1.92 g/L時(shí)，其羥自由基的清除率為65.04%，DPPH自由基的清除率為53.30%，ABTS自由基的清除率為19.98%，鐵離子還原能力達(dá)到2 575.75 μmol/L，CME表現(xiàn)出良好的抗氧化性。CME保濕效果始終略低于甘油，但在24 h、相對濕度85%條件下，CME保濕率也達(dá)到95.83%。說明CME的保濕效果良好。

研究獲取抗氧化、保濕效果良好的珍稀大型食藥用真菌提取物CME，為中草藥抗氧化及保濕能力的研究提供數(shù)據(jù)支撐，為中草藥在化妝品、保健品等領(lǐng)域的開發(fā)應(yīng)用提供參考和借鑒。