肌少癥動物模型的造模方法研究進(jìn)展

王安彥,王紅梅

(1新疆醫(yī)科大學(xué)研究生院,烏魯木齊830001;2新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院綜合保健內(nèi)科,烏魯木齊 830001)

人口老齡化是全人類所面臨的重大課題,預(yù)計在本世紀(jì)中葉中國的老齡化程度將達(dá)到34.6%,邁入重度老齡化社會[1]。肌少癥全稱“肌肉減少綜合征”,是一種增齡相關(guān)的肌肉量減少、肌肉力量下降和(或)軀體功能減退的老年綜合征[2]。隨著人口老齡化進(jìn)程的加劇,肌少癥已經(jīng)成為一種不可忽視的疾病,其發(fā)病率高、起病隱匿、危害機(jī)體功能等特點,給老年人的健康和預(yù)后造成極大威脅[3]。早期預(yù)防、發(fā)現(xiàn)、干預(yù)肌少癥對提升老年人的生命質(zhì)量,降低老年人摔倒、骨折、殘疾及死亡等風(fēng)險至關(guān)重要,同時可減輕家庭及社會醫(yī)療支出負(fù)擔(dān),故肌少癥的防治已成為推進(jìn)我國健康老齡化的重要課題。動物模型的構(gòu)建是研究肌少癥發(fā)病機(jī)制、預(yù)防及臨床干預(yù)方案的基礎(chǔ)。本文主要從近年來肌少癥動物模型造模方法進(jìn)行綜述。

肌少癥發(fā)病機(jī)制未明,其病因包括細(xì)胞衰老、氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、脂肪積累、蛋白質(zhì)平衡失衡、炎癥、營養(yǎng)不足、激素變化及衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量和再生能力的減少等[4]。在肌少癥發(fā)病機(jī)制研究中,通常從上述角度出發(fā),選擇在生理上與人類擬合度高、經(jīng)濟(jì)、實驗可重復(fù)性高、操作簡單的動物造模。構(gòu)建肌少癥動物模型的方法有兩大類:一類是衰老模型(包括老齡動物和加速衰老模型),一類是誘發(fā)肌肉萎縮模型。

1 衰老模型

1.1 老齡動物(自然衰老模型)

自然衰老動物模型多選用鼠類。肌少癥的兩大主要改變是骨骼肌細(xì)胞萎縮和間質(zhì)纖維化,老年小鼠骨骼肌間質(zhì)存在纖維結(jié)締組織的增多。Kadoguchi等[5]在研究小鼠衰老過程中氧化應(yīng)激、線粒體功能和肌肉萎縮的變化時選用了6、12和24個月的C57BL/6J小鼠建立模型,12月齡與24月齡小鼠肌肉質(zhì)量和平均肌細(xì)胞面積顯著減少,并且老年組小鼠氧化應(yīng)激標(biāo)志物水平升高,肌肉生長和肌肉分化的負(fù)調(diào)節(jié)因子肌肉萎縮盒F基因(muscle atrophy F-box,MAFbx/Atrogin1)和肌肉環(huán)指蛋白1(muscle RING finger protein-1,MuRF1)的蛋白水平顯著增加,證實自然衰老小鼠動物模型構(gòu)建成功。老齡動物是研究肌少癥最可靠的動物模型,最大程度還原了衰老的過程,對研究肌少癥促進(jìn)因素大有裨益。雖然自然衰老模型有得天獨(dú)厚的優(yōu)勢,但在使用過程中也存在限制:(1)高成本,老年動物飼養(yǎng)周期長,相應(yīng)的成本會提升;(2)耗時持久,老年動物難獲得且健康情況差;(3)條件表型差異,不同老年動物藥物吸收、分布和代謝上的差異性會很大。因此,研究者常建立其他復(fù)合性的衰老模型來縮短肌少癥建模時間。

1.2 加速衰老模型

快速衰老小鼠(senescence-accelerated mouse,SAM)肌肉會隨著年齡的增長出現(xiàn)快速老化的癥狀,其特征和人類衰老相似,包括與年齡相關(guān)的肌肉質(zhì)量、力量和纖維體積的下降[6],故常用于衰老的研究。SAM有12個品系:包括9個易衰老系(senescence-accelerated mouse prone,SAMP),SAMP1、SAMP2、SAMP3、SAMP6、SAMP7、SAMP8、SAMP9、SAMP10和SAMP11;3個正常衰老系(senescence accelerated mouse resistant,SAMR),SAMR1、SAMR4和SAMR5[6]。其中SAMP6[6]、SAMP8[7]、SAMP10系常被用于肌少癥組,SAMR1小鼠常用作對照組[8]。

Makida等[7]采用SAMP6研究維生素D缺乏和紫外線照射與肌少癥的關(guān)系。SAMP8小鼠在40周齡時出現(xiàn)肌少癥典型特征:小鼠腓腸肌肌肉質(zhì)量、肌肉橫截面積、力量(握力)下降,肌肉萎縮因子Atrogin1和MuRF1明顯上調(diào),且SAMP8小鼠肌少癥典型特征出現(xiàn)時間早,發(fā)生速度是SAMR1小鼠2倍[8]。另有研究證實:SAMP8、SAMP6小鼠骨骼肌肌肉量和肌肉力量均下降,但SAMP8小鼠肌肉衰老的典型特征出現(xiàn)速度是SAMP6小鼠的2倍,故SAMP8作為肌少癥動物模型比SAMP6更為理想[9]。SAMP8小鼠是SAM系小鼠中的優(yōu)良模型,其具有時間成本低,可被用于研究肌少癥伴隨骨質(zhì)疏松與骨折、肌少癥預(yù)防與治療等。同自然衰老模型相比,加速衰老模型時間成本降低,但局限性在于SAM小鼠模型肌少癥發(fā)病機(jī)制擬合度低于自然衰老動物,并不能全面解釋肌少癥發(fā)病機(jī)制。

2 誘發(fā)肌肉萎縮模型

2.1 基因工程法

肌肉蛋白質(zhì)合成主要是由胰島素樣生長因子1-磷脂酰肌醇-3激酶-絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶-哺乳動物雷帕霉素靶點(insulin-like growth factor 1- phosphoinositide-3-kinase-Akt/protein kinase B-mammalian target of rapamycin,IGF1-PI3K-Akt/PKB-mTOR)信號通路控制。IGF1與細(xì)胞內(nèi)受體結(jié)合并激活胰島素受體底物蛋白1(insulin receptor substrate-1, IRS-1)繼而引發(fā)PI3K激活誘導(dǎo)Akt磷酸化,繼而抑制蛋白復(fù)合物結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物1-結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物2(tuberous sclerosis complex 1-tuberous sclerosis complex 2, TSC1-TSC2),隨后通過雷帕雷素靶蛋白1(mammalian target of rapamycin 1, mTORC1)的兩個主要下游效應(yīng)物激活mTOR途徑:p70S6激酶1(S6 kinase beta-1,S6K1)和eIF-4E結(jié)合蛋白(4E binding protein 1,4E-BP1)。PI3K/Akt的激活還可通過磷酸化叉頭盒O(forkhead box O,FOXO)轉(zhuǎn)錄因子和促進(jìn)其從核酸中排除來負(fù)調(diào)節(jié)阻止骨骼肌蛋白質(zhì)降解[10]?；蚬こ谭椒ㄊ峭ㄟ^干預(yù)蛋白質(zhì)合成、降解來構(gòu)建肌少癥動物模型。

2.1.1 基因敲除法 基因敲除是基因法造模的常見方法,以減少骨骼肌蛋白質(zhì)合成為主要思路。因?qū)嶒災(zāi)康牟煌?可敲除特定的基因,是基因工程法造模中相對成熟的技術(shù)。應(yīng)用該技術(shù)成功構(gòu)建肌少癥動物模型的研究報道如下。

Mavalli等[11]靶向敲除生長激素受體(growth hormone receptor,GHR)、胰島素生長因子-1受體(insulin-like growth factor 1 receptor,IGF-1R)。GHR基因敲除小鼠自12周齡始體質(zhì)量明顯增加,脂肪含量增高,16周齡時肌纖維直徑小于野生型小鼠。IGF-1R基因敲除小鼠6周齡、16周齡時的肌肉纖維橫截面積均減少且小鼠體質(zhì)量減少、脂肪質(zhì)量低,26周齡時握力及轉(zhuǎn)棒實驗?zāi)土档?。提示GHR基因敲除模型可用于肌少性肥胖研究,IGF-1R基因敲除小鼠模型可應(yīng)用于研究生長激素在骨骼肌中作用。

Aguilar等[12]發(fā)現(xiàn)S6K1基因敲除小鼠肌細(xì)胞橫截面積減小,肌肉脂質(zhì)含量減少一半;S6K1缺失會增加一磷酸腺苷/三磷酸腺苷(adenosine monophosphate/adenosine triphosphate,AMP/ATP)水平并激活腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPK),導(dǎo)致能量應(yīng)激和肌肉細(xì)胞萎縮。Castets等[13]證實mTSC基因敲除小鼠,在12月齡時Ⅰ型纖維明顯萎縮,Ⅱ型纖維則萎縮、肥大均有;與野生型小鼠相比,其肌肉的特定抽搐和強(qiáng)直力降低到50%以下且體質(zhì)量明顯減輕。但上述模型小鼠壽命短,且更類似于肌營養(yǎng)不良的表現(xiàn),故應(yīng)用領(lǐng)域較局限。

與野生型小鼠相比,白細(xì)胞介素(interleukin, IL)-10基因敲除小鼠、IL6/IL10雙基因敲除小鼠的體質(zhì)量、脂肪含量、肌肉質(zhì)量下降,IL10基因敲除小鼠肌力下降,表現(xiàn)與肌少癥癥狀類似且有衰弱表現(xiàn),提示該模型適用于肌少癥及其他慢性病的研究[14]。與野生型相比,鐘控基因Rev-erb-α基因敲除小鼠肌肉質(zhì)量顯著下降、平均肌纖維直徑顯著降低;Rev-erb-α基因小鼠模型在后述基因過度表達(dá)法與藥物注射誘導(dǎo)法(地塞米松誘導(dǎo)法)中同樣有運(yùn)用,Rev-erb-α過度表達(dá)會減弱地塞米松對小鼠成肌細(xì)胞系中萎縮基因的誘導(dǎo)及體內(nèi)肌肉質(zhì)量的減少[15]。該法目前技術(shù)還不成熟,并未廣泛運(yùn)用。

2.1.2 基因過度表達(dá)法 基因過度表達(dá)法構(gòu)建肌少癥動物模型的思路,主要是從干預(yù)增加蛋白質(zhì)降解途徑入手。p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)、核因子κB(nuclear factor-kappa B, NF-κB)途徑是蛋白質(zhì)降解過程中兩條主要途徑[16]。Li等[17]發(fā)現(xiàn)促炎癥因子腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)激活的NF-κB轉(zhuǎn)錄因子可調(diào)節(jié)肌肉降解,TNF轉(zhuǎn)基因(tumor necrosis factor transgenic,TNF-Tg)小鼠肌肉衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量、肌纖維橫截面積、肌纖維數(shù)量顯著低于野生型小鼠;衰老和成年TNF-Tg小鼠TNF水平升高,提示TNF基因過度表達(dá)可誘導(dǎo)老年野生型小鼠和成年TNF-Tg轉(zhuǎn)基因小鼠的肌肉萎縮。過度表達(dá)FoxO1的轉(zhuǎn)基因小鼠在3月齡時Ⅰ型、Ⅱ型纖維的體積顯著減少,伴體質(zhì)量降低,符合肌少癥特征[18]。但該類模型用于某一特定因子在肌少癥發(fā)病中的機(jī)制研究,適用范圍局限,無法大規(guī)模運(yùn)用。

2.1.3 基因突變法 有研究發(fā)現(xiàn)HtrA2/Omi蛋白276位絲氨酸錯義突變導(dǎo)致的運(yùn)動神經(jīng)元退變(motor neuron degeneration 2,mnd2),mnd2純合子小鼠的肌量、肌力和運(yùn)動功能低于野生型和雜合子小鼠,進(jìn)一步通過肌肉形態(tài)、肌纖維高通量、基因表達(dá)分析,證實mnd2小鼠表現(xiàn)出肌少癥癥狀以及早衰性死亡[19],此類方法為肌少癥模型構(gòu)建提供新思路。該造模方法的適用范圍、局限性同基因過度表達(dá)法類似。

2.2 飲食誘導(dǎo)法

該方法在構(gòu)建肌少癥動物模型時應(yīng)用廣泛,通過改變碳水化合物、脂質(zhì)和維生素營養(yǎng)物質(zhì)攝入,改變宿主代謝狀態(tài),誘導(dǎo)肌少癥發(fā)病。有研究證明微生物衍生的飲食代謝途徑在衰老、肌少癥中起重要作用,年齡相關(guān)肌少癥大鼠的腸道微生物群不同于肌肉質(zhì)量正常大鼠[20]。

高脂飲食誘導(dǎo)法試驗成本低、實踐方法簡易,是常用的肌少癥造模方法。Brown等[21]選取4周齡C57BL/6雄性小鼠,分別予高脂肪飲食(60%脂肪)或正常食物(17%脂肪)喂養(yǎng),發(fā)現(xiàn)高脂飲食年輕、老年小鼠的肌肉橫截面積均減少,老年高脂飲食小鼠腓腸肌肌肉質(zhì)量下降、握力減低;高脂飲食喂養(yǎng)小鼠相對肌肉質(zhì)量的下降幅度高于正常食物喂養(yǎng)者。

維生素D在鈣、骨骼和肌肉穩(wěn)態(tài)維持中發(fā)揮著重要作用,因此維生素D誘導(dǎo)法同樣用于構(gòu)建肌少癥動物模型。Nakamura等[22]給予6周齡小鼠喂食低維生素D、標(biāo)準(zhǔn)維生素D飲食4周,然后采用下肢吻合器固定小鼠3周,發(fā)現(xiàn)低維生素D飲食的小鼠腓腸肌橫截面積顯著小于標(biāo)準(zhǔn)維生素D喂食小鼠。但維生素D誘導(dǎo)法尚不如高脂飲食誘導(dǎo)法成熟、應(yīng)用廣泛,維生素D基因敲除也同樣可用于肌少癥模型構(gòu)建[23]。

2.3 藥物注射誘導(dǎo)法

糖皮質(zhì)激素可通過減少蛋白質(zhì)合成與增加蛋白質(zhì)降解誘導(dǎo)骨骼肌萎縮[24]。Kim等[25]給小鼠腹腔注射地塞米松后,小鼠體質(zhì)量減輕、握力減少、肌肉萎縮,出現(xiàn)了典型的肌少癥癥狀,成功構(gòu)建肌少癥模型。D-半乳糖可以誘導(dǎo)線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激、細(xì)胞損傷和炎癥等途徑導(dǎo)致衰老發(fā)生[26],進(jìn)而引發(fā)骨骼肌萎縮。王可欣等[27]對8周齡KM小鼠每天皮下注射500mg/kg的D-半乳糖共計12d,發(fā)現(xiàn)小鼠體質(zhì)量凈增長減少、肌力下降,腓腸肌肌纖維和肌絲密度下降、收縮性能下降,與老年小鼠的骨骼肌老化相似,同時小鼠抗應(yīng)激能力低下,成骨細(xì)胞凋亡增加,該模型可用作肌少癥與骨質(zhì)疏松研究模型、亞急性衰老模型。上述藥物誘導(dǎo)的動物模型均可以觀察到肌少癥癥狀和病理特征,表明以上藥物誘導(dǎo)的動物模型可應(yīng)用于肌少癥的相關(guān)研究中,缺點在于小鼠個體差異大不易控制,藥物注射操作繁瑣、藥物種類劑量標(biāo)準(zhǔn)繁多、副作用不一,極易造成誤差,本模型同自然衰老模型相比免疫、行為差異大。其他藥物正在進(jìn)一步探索中。

2.4 廢用性萎縮法

廢用性萎縮本質(zhì)是利用失重或者微重力條件導(dǎo)致肌肉萎縮,目前常用的方法有后置固定、去神經(jīng)萎縮、后置卸載等。

固定化萎縮法是采用石膏或者夾持器固定動物,模擬長期臥床人群中肌減少癥的發(fā)生和發(fā)展。Nakamura等[22]采用夾持器將髖關(guān)節(jié)、膝關(guān)節(jié)和踝關(guān)節(jié)最大屈曲位置固定在左后足上,將背部皮膚拉至足部,右后肢作為對照,成功構(gòu)建了固定化肌萎縮模型。但此方法成本高、用途局限,未能大規(guī)模應(yīng)用。

去神經(jīng)萎縮法包括切斷脛神經(jīng)或坐骨神經(jīng)。銀歡等[28]對雄性Wistar大鼠,一組切斷中段坐骨神經(jīng),另一組結(jié)扎切斷脛神經(jīng),發(fā)現(xiàn)兩組大鼠的肌肉濕重、橫截面積均降低,但切斷坐骨神經(jīng)的部分大鼠出現(xiàn)皮膚潰瘍、壞死,故建議選用脛神經(jīng)切斷術(shù)構(gòu)建肌少癥模型。

后置卸載萎縮法是通過單側(cè)后肢懸吊、雙側(cè)后肢懸吊、尾部牽引懸吊等方法,引起神經(jīng)肌肉連接不穩(wěn)定或去神經(jīng)支配導(dǎo)致肌少癥。動物后肢卸載前2周內(nèi),肌肉質(zhì)量迅速減少直至達(dá)到最低點,并保持新的低水平穩(wěn)定狀態(tài)。后肢懸吊可減少腓腸肌、股四頭肌的肌肉質(zhì)量[29]。發(fā)現(xiàn)該方法不需要專業(yè)設(shè)備及手術(shù)干預(yù),且肢體卸載部分可逆,可進(jìn)行更多實驗設(shè)計,故在廢用性萎縮模型中更常用。

2.5 骨髓移植法

骨髓移植法通過影響衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量與功能導(dǎo)致肌肉衰老。Wang等[30]將年輕或年老的骨髓細(xì)胞移植(transplantation of bone marrow cells,BMCs)于年輕小鼠體內(nèi),將年輕的BMCs移植到年輕或老年小鼠體內(nèi),發(fā)現(xiàn)接受年輕BMCs的10月齡和20月齡小鼠肌纖維橫截面積和對照組相似,接受老年小鼠BMCs的20月齡老年小鼠肌纖維橫截面積低于移植老年BMCs(或非移植)的10月齡小鼠,證明肌少癥發(fā)生率、肌纖維表型的變化與骨髓細(xì)胞年齡密切相關(guān)。此類模型可用于肌少癥免疫系統(tǒng)相關(guān)機(jī)制的研究,目前該類方法還處于初步探索階段,尚未能大規(guī)模應(yīng)用。

2.6 卵巢切除模型

雌激素水平降低改變氧化還原平衡、影響線粒體功能及生物合成,從而導(dǎo)致肌肉質(zhì)量及力量水平下降[31]。更年期后雌激素缺乏是老年女性肌肉質(zhì)量下降的重要原因,Peyton等[32]通過對C57BL/6J雌性小鼠進(jìn)行雙側(cè)卵巢切除術(shù),模擬更年期女性雌激素喪失,在雌激素缺乏16周后,解剖脛骨前肌,對小鼠骨骼肌進(jìn)行整體磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析。實驗結(jié)果證明卵巢切除組與對照組小鼠體質(zhì)量存在顯著差異;雌激素喪失會重塑骨骼肌磷酸蛋白質(zhì)組,影響肌節(jié)的磷酸蛋白,而肌節(jié)是肌纖維的重要收縮單位。此類模型在研究肌肉萎縮性疾病中雌激素相關(guān)的細(xì)胞分子機(jī)制、性別差異等方面發(fā)揮重要作用。

3 小 結(jié)

綜上,肌少癥動物模型有衰老模型和誘發(fā)肌肉萎縮模型兩大類,造模方法包括自然衰老、加速衰老、基因工程、飲食誘發(fā)、藥物注射、失用性萎縮、骨髓移植、卵巢切除等。各種造模方法的機(jī)制各不相同,造模時間、造模工具、造模成本及模型適用范圍也不盡相同,目前最佳的肌少癥模型及造模方法尚未有定論,動物壽命、死亡率、造模周期、試驗成本、機(jī)制一致性、實驗精準(zhǔn)性都是研究熱點。研究者可根據(jù)研究目的、方向選擇合適的造模方法構(gòu)建單種或多種肌少癥動物模型,進(jìn)行肌少癥機(jī)制、預(yù)防、治療靶點等方面研究。