王 迎,董明盛, ,張國強,韓月峰
(1.南京農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院,江蘇 南京 210095;2.江蘇勤善堂健康產(chǎn)業(yè)有限公司,江蘇 南京 210042)
天麻是蘭科天麻屬植物天麻的干燥塊莖,為我國傳統(tǒng)的名貴中藥材,主產(chǎn)于中國貴州、四川、云南等地[1]。中醫(yī)學認為天麻具有平抑肝陽、祛風通絡的功效,臨床上主要用于治療風虛眩暈、頭疼等癥狀[2]?,F(xiàn)代研究表明,天麻具有改善認知記憶,改善睡眠,調節(jié)血脂、血糖及血壓,改善肝損傷等功效[3]。天麻主要功效成分包括天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷等,其中對羥基苯甲醇是天麻素的苷元,也稱為天麻苷元。天麻素與對羥基苯甲醇對治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有積極作用[4-5],其作用機制包括調節(jié)神經(jīng)遞質、抗氧化、抗炎等[6]。目前天麻已被納入藥食同源目錄(國衛(wèi)食品函〔2019〕311號),這為其作為保健食品開發(fā)提供了依據(jù)。在天麻產(chǎn)地,天麻主要食用方式包括用于燉肉、入菜、火鍋等,或者將鮮天麻炮制成天麻粉沖飲[7],但對于沒有天麻食用習慣的消費者,直接食用往往難以接受天麻獨特的令人不愉快的藥材氣味(俗稱“馬尿臭”)[8]。
紅茶菌是一種歷史悠久的酸性保健飲料,它是以糖、茶、水為原料,主要經(jīng)醋酸菌、酵母菌等多種微生物共同發(fā)酵而成[9]。紅茶菌發(fā)酵受共生微生物驅動,在發(fā)酵過程中會發(fā)生許多生物化學反應,主要包括醇、醛的形成,以及醇、醛向酸、酯的轉化,能產(chǎn)生豐富的營養(yǎng)功能性物質以及甜香的風味物質[10-11],其主要代謝產(chǎn)物包括醋酸、乙醇、葡萄糖酸、葡萄糖醛酸、氨基酸、維生素等[12]。紅茶菌具有很多對人體有益的保健功能,包括清理腸胃、消除疲勞、增強食欲、幫助消化、防治高血壓和動脈硬化、預防和治療糖尿病,以及防癌抗癌、增強機體免疫力等[13-14]。
已有研究利用紅茶菌改善食品的不良氣味,如王旭冰[15]利用紅茶菌發(fā)酵技術對養(yǎng)殖的美國紅魚去腥,經(jīng)紅茶菌發(fā)酵后,紅魚肉中的醛類、酮類、烷烴含量均相對減少,同時產(chǎn)生很多具有香氣的新醇類、醛類、烷烴類揮發(fā)性物質,在很大程度上減少了紅魚肉的腥味。Tu Chuanhai等[16]利用紅茶菌發(fā)酵豆腐黃漿水制備飲料,結果表明發(fā)酵不僅提高了黃漿水的功能性,而且賦予黃漿水令人愉快的果香。基于此,本研究利用紅茶菌對天麻進行發(fā)酵,期望改善天麻的不愉快氣味,為天麻食品深度開發(fā)和利用提供理論依據(jù)和技術支撐。
紅茶菌由南京農(nóng)業(yè)大學食品科學與技術學院微生物組實驗室保存,經(jīng)宏基因組學分析表明紅茶菌菌群主要由醋酸菌、酵母菌、乳酸菌組成[17];天麻片由江蘇勤善堂健康產(chǎn)業(yè)有限公司提供(試材經(jīng)中藥材專家鑒定);紅糖購自廣西馬山南華糖業(yè)有限公司;白糖為市售甘蔗白糖。
纖維素酶 上海吉至生化科技有限公司;苯酚、濃H2SO4、福林-酚 國藥集團化學試劑有限公司;葡萄糖、葡萄糖醛酸、沒食子酸、天麻素、對羥基苯甲醇標準品 上海源葉生物科技有限公司。
PEN-3型電子鼻 德國Airsense公司;TSQ 8000 Evo三重四極桿氣相色譜-質譜聯(lián)用儀 美國賽默飛世爾科技公司;1260型高效液相色譜儀 美國Agilent公司。
1.3.1 紅茶菌接種液的制備
糖茶水的制備:10 g/L紅茶葉加入至100 g/L的白糖水中煮沸,過濾得到糖茶水。
紅茶菌接種液的制備:向糖茶水中加入體積分數(shù)為5%的紅茶菌菌液和30 g/L紅茶菌菌膜,放至30 ℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵10~15 d,得到紅茶菌接種液。
1.3.2 天麻發(fā)酵體系構建
將天麻片(干基)按料液比1∶10(g/mL)加入80 g/L的紅糖溶液中,121 ℃滅菌20 min,得到紅糖天麻溶液。
實驗組(EG組):在紅糖天麻溶液中加入體積分數(shù)5%的紅茶菌發(fā)酵液以及0.3 g/L纖維素酶;對照組(CG組):在紅糖天麻溶液中加入0.3 g/L纖維素酶。將實驗組與對照組放入30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d,記錄發(fā)酵過程中天麻-紅茶菌發(fā)酵液理化性質和功能性物質的變化。
1.3.3 pH值與總酸質量濃度測定
每24 h取一次樣品,測定pH值。使用NaOH滴定法測定總酸質量濃度,計算公式如下:
式中:X為總酸質量濃度/(g/100 mL);c為NaOH標準溶液的濃度/(mol/L);V為滴定消耗NaOH標準溶液的體積/mL;V樣為樣品體積/mL;V0為樣品稀釋液總體積/mL;V1為滴定時吸取的樣品體積/mL;K為換算為主要酸的系數(shù),即1 mmol氫氧化鈉消耗乙酸的質量,為0.060 g/mmol。
1.3.4 有機酸質量濃度測定
使用高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)法測定[18]。發(fā)酵液使用0.22 μm有機濾膜過濾。色譜條件:Atlanis T3色譜柱,流動相為0.02 mol/L KH2PO4溶液(pH 2.6),流速0.4 mL/min,等度洗脫,柱溫30 ℃、檢測波長210 nm。
1.3.5 微生物生長動力學評價
使用平板涂布計數(shù)法對紅茶菌的微生物生長動力學進行評估。每24 h對發(fā)酵液取一次樣,對酵母菌、醋酸菌、乳酸菌分別進行平板涂布計數(shù),細菌37 ℃生長24 h后計數(shù),酵母28 ℃生長48 h后計數(shù)。微生物數(shù)量最后用lg(CFU/mL)表示。
1.3.6 總糖質量濃度測定
采用苯酚-硫酸法[19]。使用孔徑為1~3 μm的慢速濾紙過濾發(fā)酵液,之后對濾液進行稀釋,取稀釋液1.0 mL加入5.0 mL濃H2SO4和1.0 mL質量分數(shù)5%的苯酚溶液,100 ℃水浴15 min后在490 nm波長處測定吸光度,代入標準曲線中計算總糖質量濃度。
1.3.7 多酚與黃酮質量濃度測定
樣品中總多酚質量濃度測定參考王淑珍等[20]的方法。取200 μL樣液加入試管中,再依次加入800 μL去離子水、200 μL福林-酚試劑,振搖混勻,避光保存6 min,再加入2 mL質量分數(shù)為7%的Na2CO3溶液和1.6 mL去離子水,避光條件下放置90 min,于760 nm波長處測定吸光度,代入標準曲線計算總酚質量濃度。
樣品中總黃酮含量測定參照Juan等[21]的方法。取5.0 mL樣液加入試管中,加入0.3 mL質量分數(shù)為5%的亞硝酸鈉溶液,搖勻,靜置6 min,再加入0.3 mL質量分數(shù)為5%的Al(NO3)3,搖勻,靜置6 min,再加入4.0 mL質量分數(shù)為4%的NaOH溶液、0.4 mL體積分數(shù)30%的乙醇溶液,混勻,放置12 min后于510 nm波長處測定吸光度,代入標準曲線計算總黃酮質量濃度。
1.3.8 天麻素與對羥基苯甲醇含量測定
參照Liu Yang等[22]的方法,使用0.22 μm有機濾膜過濾發(fā)酵液后進行HPLC測定。HPLC條件:色譜柱為Thermo BDS C18(4.6 mm×150 mm,5 μm);流動相為乙腈-體積分數(shù)0.1%的H3PO4溶液(體積比為3∶97);流速0.1 mL/min;檢測波長為220 nm;柱溫25 ℃;進樣10 μL。
1.3.9 感官分析
1.3.9.1 揮發(fā)性成分測定
采用PEN-3便攜式電子鼻對實驗組與對照組發(fā)酵5 d的樣品進行揮發(fā)性成分的初步分析。取5 mL樣品放置于20 mL頂空瓶中,60 ℃水浴30 min后進行檢測[23]。結果參照表1對兩組發(fā)酵液進行氣味分析。
表1 電子鼻傳感器物質響應類型Table 1 Performance description of the sensor arrays of the PEN-3 electronic nose
采用固相微萃取-氣相色譜-質譜(solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,SPME-GC-MS)法對發(fā)酵液的揮發(fā)性成分進行分析[24]。取樣品5 mL置于SPME采樣瓶中,插入裝有2 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMS StableFlex萃取頭的手動進樣器,在60 ℃平板頂空萃取60 min后,移出萃取頭并立即插入GC儀進樣口(溫度250 ℃)中,熱解吸進樣。氣相色譜條件:HP-5MS(60 mm×0.25 mm,0.25 μm)彈性石英毛細管色譜柱,初始溫度40 ℃,維持2 min,以6 ℃/min升溫至280 ℃;氣化室溫度250 ℃;載氣為高純He(99.999%);載氣流量1.0 mL/min,不分流。質譜條件:電子電離源;離子源溫度230 ℃;四極桿溫度150 ℃;接口溫度280 ℃;質量范圍29~500 amu。通過質譜計算機數(shù)據(jù)系統(tǒng)對總離子流圖中的各峰進行檢索及核對NIST數(shù)據(jù)庫,對揮發(fā)性成分進行定性分析。
1.3.9.2 感官評價
對發(fā)酵5 d的實驗組與對照組進行感官評價,感官評價標準見表2。
表2 天麻-紅茶菌飲料感官評價標準Table 2 Criteria for sensory evaluation of Gastrodia elata beverage fermented with Kombucha consortium
紅茶菌發(fā)酵天麻的微生物菌群主要包括醋酸菌、酵母菌以及乳酸菌3 類,對3 種微生物數(shù)量進行計數(shù),結果見圖1。發(fā)酵初始,醋酸菌、酵母菌、乳酸菌的數(shù)量分別為6.35、6.02、5.64(lg(CFU/mL))。發(fā)酵2 d,醋酸菌的數(shù)量逐漸增加,增至最大值8.33(lg(CFU/mL)),隨后又逐漸降低至7.12(lg(CFU/mL))(5 d)。發(fā)酵3 d,酵母菌與乳酸菌數(shù)量均逐漸增加,分別增長至8.84(lg(CFU/mL))和7.38(lg(CFU/mL));發(fā)酵5 d,二者分別逐漸減少至7.27、6.80(lg(CFU/mL))。紅茶菌天麻在發(fā)酵初期,其醋酸菌數(shù)量高于酵母菌與乳酸菌;發(fā)酵2 d,醋酸菌含量逐漸減少,發(fā)酵第3天,酵母菌與乳酸菌數(shù)量顯著增加,并且酵母菌數(shù)量超過醋酸菌數(shù)量;到發(fā)酵后期,微生物數(shù)量均相應降低,可能是可利用有機物的減少所致。
圖1 微生物數(shù)量在發(fā)酵過程的變化Fig.1 Changes in microbial load during fermentation
由圖2a可以看出,隨著發(fā)酵時間的延長,實驗組的pH值逐漸降低,由4.40降至3.41,變化幅度較大;對照組的pH值最高為4.45,最低為4.35,pH值變化不顯著。由圖2b可以看出,實驗組的總酸質量濃度隨著發(fā)酵時間延長逐漸增加,由29.76 g/100 mL增加到64.14 g/100 mL,并且在發(fā)酵1~2 d顯著增加,推測發(fā)酵前期醋酸菌為發(fā)酵主要菌群。對照組總酸質量濃度在34.10~42.58 g/100 mL之間波動,變化幅度相對于實驗組來說較小。結合pH值與總酸含量變化可以看出,在紅茶菌發(fā)酵過程中,由于微生物作用,會產(chǎn)生大量的酸,導致發(fā)酵液的pH值降低,也進一步影響發(fā)酵液的理化性質與感官品質。
圖2 不同發(fā)酵時間pH值(a)和總酸含量(b)的變化Fig.2 Changes in pH (a) and total acid content (b) during fermentation
紅茶菌發(fā)酵過程中會產(chǎn)生大量的有機酸,包括乙酸、乳酸、酒石酸、琥珀酸等。如表3所示,在發(fā)酵過程中,乙酸與琥珀酸質量濃度分別由4.12、11.37 g/L增長至20.43、45.24 g/L。與發(fā)酵前2 d相比,第3、4、5天的發(fā)酵液中乙酸含量顯著提高(P<0.05),發(fā)酵5 d增長為原來的4.96 倍;琥珀酸質量濃度在發(fā)酵第5天達到最高值,為原來的3.98 倍;并且發(fā)酵第4、5天的含量顯著高于發(fā)酵前3 d。其次是酒石酸和乳酸,發(fā)酵5 d酒石酸質量濃度增長了2.55 g/L,乳酸質量濃度增長了4.42 g/L。蘋果酸在發(fā)酵過程中含量較穩(wěn)定,質量濃度在2.07~2.70 g/L之間。葡萄糖醛酸作為一種大分子酸,其質量濃度在發(fā)酵過程中有所下降,由36.80 g/L下降至27.54 g/L,主要在發(fā)酵第1天和第3天之間變化顯著,發(fā)酵3~5 d之間變化不顯著。
表3 不同發(fā)酵時間紅茶菌發(fā)酵天麻的有機酸質量濃度變化Table 3 Changes in organic acid concentration during fermentation of G.elata with Kombucha consortium g/L
紅茶菌中醋酸菌作為主要菌株之一[11],能夠利用有機物產(chǎn)生大量乙酸,因此乙酸的質量濃度增長幅度較大。琥珀酸在發(fā)酵過程中也出現(xiàn)大幅度增長的情況,由于天麻本身含有琥珀酸[25],在微生物發(fā)酵的作用下,其質量濃度也逐漸升高。紅茶菌中含有較多的葡萄糖醛酸,因此其在發(fā)酵初始階段的含量較高,而在紅茶菌發(fā)酵初期,微生物會利用葡萄糖醛酸中的糖基[26],因此,其含量隨之降低。發(fā)酵液中乳酸、酒石酸、蘋果酸等有機酸會改善發(fā)酵液的風味,增加發(fā)酵液的營養(yǎng)成分。
2.3.1 發(fā)酵對天麻總糖的影響
在紅茶菌發(fā)酵過程中,微生物可利用多糖進行代謝[27]。從圖3可知,實驗組總糖質量濃度在紅茶菌的作用下,由104.56 g/L降至60.57 g/L,消耗了43.99 g/L;對照組的總糖質量濃度在99.15~112.36 g/L之間。紅茶菌中的醋酸菌、乳酸菌、酵母菌均可利用糖類進行代謝活動,因此,在發(fā)酵過程中,糖類有利于微生物產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物,比如有機酸、乙醇等。
圖3 不同發(fā)酵時間紅茶菌-天麻總糖含量變化Fig.3 Changes in total sugar concentration during fermentation of G.elata with Kombucha consortium
2.3.2 發(fā)酵過程中多酚與黃酮含量變化
多酚與黃酮是天然的抗氧化劑,其含量影響發(fā)酵液的抗氧化性[28]。紅茶菌發(fā)酵天麻會導致發(fā)酵液的多酚與黃酮含量發(fā)生變化。通過表4可知,實驗組發(fā)酵1 d多酚質量濃度并沒有發(fā)生顯著變化,發(fā)酵2~5 d,不同發(fā)酵時間之間的多酚質量濃度均有顯著差異(P<0.05),并且總酚質量濃度隨著發(fā)酵時間的延長逐漸增加,由685.78 mg/L增加到1070.09 mg/L。對照組的總酚質量濃度在部分發(fā)酵時間之間也存在顯著差異,總體來看,其總酚質量濃度在714.07~792.27 mg/L之間變化,變化幅度相對于實驗組較小。
表4 不同發(fā)酵時間多酚與黃酮的含量Table 4 Total phenolic and flavonoid contents during fermentation
黃酮質量濃度在發(fā)酵過程中變化明顯。實驗組發(fā)酵2~4 d,其黃酮質量濃度顯著增加,發(fā)酵初始黃酮質量濃度為171.08 mg/L,發(fā)酵后達到最大值245.25 mg/L,增長74.17 mg/L;對照組的黃酮質量濃度總體變化不顯著,發(fā)酵時間對黃酮質量濃度影響較小,最大值為184.83 mg/L,最小值為169.42 mg/L。
2.3.3 發(fā)酵過程中天麻素和對羥基苯甲醇質量濃度變化
由圖4可知,天麻經(jīng)紅茶菌發(fā)酵后,發(fā)酵液中的天麻素與對羥基苯甲醇(天麻苷元)質量濃度發(fā)生明顯變化。發(fā)酵前2 d,實驗組的天麻素質量濃度變化幅度較小,從第3天開始,天麻素質量濃度大幅降低,天麻素質量濃度由835.68 μg/mL降至11.04 μg/mL;對羥基苯甲醇從第3天開始有明顯增加趨勢,發(fā)酵初始質量濃度為78.05 μg/mL,發(fā)酵5 d達到最大值456.66 μg/mL,為初始質量濃度的5.85 倍。對照組的天麻素與對羥基苯甲醇質量濃度分別維持在712.58~891.62 μg/mL和94.86~191.97 μg/mL之間,與實驗組的變化幅度相比,總體變化不顯著,其質量濃度的變化可能是發(fā)酵過程中天麻釋放部分對羥基苯甲醇導致。實驗組的天麻素與對羥基苯甲醇的總質量濃度降低。天麻素屬于小分子酚型糖苷類化合物,部分天麻素經(jīng)微生物作用后,分解產(chǎn)生對羥基苯甲醇,還有巴利森苷等小分子物質[29]。因此,發(fā)酵過程中,紅茶菌不但會利用多糖,還會利用天麻素中的葡萄糖基,分解產(chǎn)生小分子物質,導致其含量大大減少。
圖4 發(fā)酵過程中天麻素與對羥基苯甲醇含量變化Fig.4 Changes in gastrodin and gastrodigenin contents during fermentation
2.4.1 電子鼻分析紅茶菌天麻發(fā)酵液揮發(fā)性成分
紅茶菌發(fā)酵會改變發(fā)酵液的風味,改善天麻不愉快氣味。經(jīng)電子鼻分析,實驗組發(fā)酵5 d的風味相較于對照組更加明顯(圖5)。其中,發(fā)酵液對W1S(甲基類化合物)、W5S(氮氧化合物)的響應值最大,其次是W2W(芳香成分、有機硫化物)、W2S(醇類、醛酮類化合物)、W1W(硫化物),其余響應值整體沒有明顯變化。這說明紅茶菌-天麻經(jīng)發(fā)酵后,短鏈烷烴如甲烷、氮氧化合物、芳香物質、醇、醛、酮等物質含量顯著增加,導致實驗組與對照組風味存在明顯差異,使得發(fā)酵液風味更加濃郁。
圖5 電子鼻分析紅茶菌-天麻發(fā)酵液雷達圖Fig.5 Radar map for electronic nose responses to G.elata fermented with Kombucha consortium
2.4.2 SPME-GC-MS分析紅茶菌天麻發(fā)酵液揮發(fā)性成分
使用SPME-GC-MS對發(fā)酵5 d的天麻-紅茶菌實驗組和對照組的揮發(fā)性物質進行分析,共鑒定出39 種揮發(fā)性物質。由表5可以看出,發(fā)酵后,實驗組與對照組的揮發(fā)性物質存在明顯區(qū)別,醇類、酯類等物質相對含量明顯增加,它們能增加發(fā)酵液的風味。其中實驗組的乙醇(20.99%)、異戊醇(3.18%)、苯乙醇(9.70%)、2,3-環(huán)氧-1-丁醇(2.81%)是主要醇類物質,這些物質含量的增加使發(fā)酵液具有明顯的酒香味。
表5 紅茶菌天麻發(fā)酵液的揮發(fā)性物質及其相對含量分析Table 5 Relative contents of volatile compounds in G.elata fermented with Kombucha consortium
天麻經(jīng)紅茶菌發(fā)酵后,主要變化的酯類物質有乙酸苯乙酯(4.67%)、己酸苯乙酯(1.73%)、辛酸乙酯(11.37%)、癸酸乙酯(2.58%)等,這些酯類物質相對含量相較于對照組明顯增加,使發(fā)酵液具有明顯的果香味。而對照組中主要的風味物質是檸檬烯-6-醇特戊酸酯(55.10%),發(fā)酵后,該物質相對含量大大降低,推測該物質為天麻本身風味物質,發(fā)酵過程中被微生物降解。
烷烴類、酸類、酮類物質經(jīng)發(fā)酵后,相對含量也發(fā)生變化。發(fā)酵后6-甲基十八烷(6.49%)、2,6,10-三甲基十四烷(4.33%)、2,6-二甲基十一烷(1.21%)這3 種主要的烷烴物質明顯增多;經(jīng)發(fā)酵后乙酸(2.79%)、丙二酸(2.18%)相對含量也明顯增加。對照組的丙酮相對含量為6.46%,發(fā)酵后未檢測到丙酮,丙酮具有辛辣味,發(fā)酵改善天麻的風味。除此之外,實驗組發(fā)酵液中檢測到的百里香酚(14.00%)也賦予其辛香味;并且2,4-二叔丁基酚相對含量經(jīng)發(fā)酵后由11.25%降至0.39%,該風味物質的減少也能夠改善天麻的不愉快氣味。
2.4.3 感官評價
由圖6可以看出,經(jīng)紅茶菌發(fā)酵后,實驗組的口感、滋味、氣味評分均優(yōu)于對照組,色澤與組織狀態(tài)上差別不大,均為棕色較清澈的液體,有少量沉淀。實驗組有明顯的甜香氣,酸與醇味相協(xié)調,酸甜適中,而且?guī)缀趼劜怀鎏炻榈牟挥淇煳?,極大地改善天麻的可接受性,提高食用愉悅感。
圖6 天麻-紅茶菌飲料感官評價雷達圖Fig.6 Radar map for sensory evaluation of G.elata fermented with Kombucha consortium
研究紅茶菌液態(tài)發(fā)酵天麻后,發(fā)酵液性質的變化以及功能性物質的產(chǎn)生情況。結果表明天麻經(jīng)過液態(tài)發(fā)酵,其營養(yǎng)、功能、感官性能方面都大大提升。紅茶菌的發(fā)酵使發(fā)酵液中的有機酸更加豐富,其中乙酸與琥珀酸的質量濃度增長為原來的4.96 倍和3.98 倍。發(fā)酵減少天麻中的天麻素含量,但提升了對羥基苯甲醇功能性成分的含量,為原來的5.85 倍。經(jīng)發(fā)酵后,天麻的總多酚、總黃酮質量濃度也分別達到1070.09 mg/L和245.25 mg/L,與未發(fā)酵對照組比較,分別增加至原來的1.56 倍和1.43 倍,有利于提升其抗氧化性。對揮發(fā)性物質進一步分析,共檢測出39 種揮發(fā)性物質,表明天麻-紅茶菌發(fā)酵液具有較豐富的風味,在一定程度上能夠改善天麻的不愉快氣味。并且經(jīng)過感官評價,也證實天麻-紅茶菌飲料具有較優(yōu)良的風味??偟貋碚f,對紅茶菌發(fā)酵天麻的研究有助于進一步開發(fā)新型天麻食品,并深入探究其潛在的功能價值。