中國母乳寡糖構(gòu)成特征分析

米麗娟，閆競宇，郭珊珊，賈 妮，逄金柱,

（1.內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司全球研發(fā)創(chuàng)新中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 011500；2.中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，遼寧 大連 116001；3.首都兒科研究所，北京 100020）

母乳寡糖（human milk oligosaccharides，HMOs）是人類母乳中的第三大固體成分，其含量僅次于乳糖和脂肪[1]。HMOs在初乳中的質(zhì)量濃度高達(dá)20～25 g/L[2]。HMOs的結(jié)構(gòu)通常由3～22 個(gè)單糖組成[3]，以葡萄糖、半乳糖、N-乙酰氨基葡萄糖、巖藻糖和N-乙酰神經(jīng)氨酸5 種單糖為基本組成單位[4]；以乳糖-N-四糖（lacto-Ntetraose，LNT）、乳糖-N-新四糖（lacto-N-neotetraose，LNnT）、乳糖-N-六糖（lacto-N-hexaose，LNH）和乳糖-N-新六糖（lacto-N-neohexaose，LNnH）為核心糖骨架結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步以直鏈或支鏈結(jié)構(gòu)再度延伸或進(jìn)行巖藻糖基化和唾液酸化，從而形成各種不同的HMOs（例如2’-巖藻糖基乳糖（2’-fucosyllactose，2’-FL）、3-FL、LNT、乳糖-N-巖藻糖基五糖I（lacto-N-fucopentaose I，LNFP-I）等）[5-6]。目前已經(jīng)鑒定出的HMOs大約有200多種[2,7]，其中包含中性寡糖和酸性寡糖；中性寡糖又可分為無巖藻糖基及含巖藻糖基的寡糖，占HMOs含量約75%～85%；酸性寡糖是包含唾液酸及硫酸鹽結(jié)構(gòu)的寡糖，占HMOs含量約10%～15%[1,8-9]。HMOs在人體中具有多種重要的生物學(xué)功能[2,4,10-11]：調(diào)節(jié)腸道菌群，促進(jìn)有益菌的增殖，抑制有害菌的生長[12]；作為抗黏附型抗菌劑，以誘餌型受體方式，防止病原體黏附到嬰兒的黏膜表面，降低感染風(fēng)險(xiǎn)[13]；調(diào)節(jié)表皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞應(yīng)答，減少黏膜白細(xì)胞的過度浸潤和過度激活；此外，能夠降低壞死性小腸結(jié)腸炎發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[14-15]；為嬰兒提供唾液酸作為大腦發(fā)育和認(rèn)知力提高的潛在必要營養(yǎng)物質(zhì)[16-17]。

HMOs的種類和含量受多種因素的影響，如地域、泌乳階段、乳母基因多態(tài)性等[18-22]。有關(guān)母乳寡糖的含量研究多采用橫斷面采樣法搜集母乳樣本進(jìn)行分析檢測，而對于HMOs來說，乳母基因多態(tài)性是影響其組成和含量的重要因素，因此橫斷面法易造成多因素交互影響檢測結(jié)果。故本研究采用縱向隊(duì)列研究方式搜集母乳樣本并進(jìn)行HMOs分析，真實(shí)客觀反映泌乳階段、地域?qū)MOs的影響，并分析中國代表性地區(qū)乳母基因多態(tài)性的呈現(xiàn)趨勢，概述中國代表性地區(qū)母乳寡糖的構(gòu)成特征。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 志愿者招募

2012 年6 月 至2013 年12 月，在我國6個(gè)城市（北京、包頭、西寧、昆明、濟(jì)南和深圳）募集足月分娩健康嬰兒和乳母，乳母年齡在35 周歲以下，身體健康，無慢性疾病和乳腺疾病，母乳喂養(yǎng)嬰兒至12 月齡。所有參與者在入組前都已簽署知情同意書。本研究得到首都兒科研究所科學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（倫理批號：SHERLL2013007）。

1.1.2 母乳采集

由科研人員上午9∶00—11∶00在醫(yī)院或入戶采集母乳，采用吸奶器采集單側(cè)乳房的全部乳汁。隨訪每名入組母親至嬰兒1 周歲左右，累計(jì)每人次縱向采集母乳共10 次。采集量為初乳10 mL，成熟乳60 mL，分裝至離心管。采集后樣本低溫冷鏈轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室，－80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。本研究主要分析初乳? 月齡和4 月齡3 個(gè)階段的母乳樣本。

1.1.3 試劑

乙酸銨、乙腈、甲醇、乙醇 西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；蒸餾水 廣州屈臣氏食品飲料有限公司；HMOs標(biāo)準(zhǔn)品：LNT、LNnT、2’-FL、3-FL、二巖藻糖基乳糖（lactodifucotetraose，LDFT）、LNFP-I、LNFP-III、LNFP-II、乳糖-N-二巖藻糖基新六糖II（lacto-N-neodifucohexaose II，LNnDFH-II）、乳糖-N-二巖藻糖基六糖II（lacto-N-difucohexaose II，LNDFH-II）、LNDFH-I &LNnDFH-I、單巖藻糖基乳糖-N-新六糖（monofucosyllacto-N-neohexaose，MFLNnH）、單巖藻糖基乳糖-N-六糖III（monofucosyllacto-N-hexaose III，MFLNH-III）、MFLNH-I、雙巖藻基-對-乳糖-N-新六糖（difucosyl-para-lacto-N-neohexaose，DFpLNnH）、二巖藻糖基-乳糖-N-六糖a（difucosyllacto-N-hexaose a，DFLNHa）、3’-唾液酸化乳糖（3’-sialyllactose，3’-SL）、6’-SL、唾液酸化-乳糖-四糖b（sialyllacto-tetrasaccharide b，LSTb）、LSTc、二唾液酸化-乳糖-N-四糖（disialyllacto-N-tetraose，DSLNT）、3’-唾液酸化乳糖-N-巖藻糖基五糖II（3’-sialyllatco-N-fucopentaose II，3’-SLNFP-II）&6’-唾液酸化乳糖-N-巖藻糖基五糖VI（6’-sialyllatco-Nfucopentaose VI，6’-SLNFP-VI）中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

HClass-Xevo TQ-XS超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜、BEH Amide色譜柱（2.1 mm×150 mm，1.7 m）沃特世科技（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 母乳樣本前處理

取冷凍母乳樣本于37 ℃水浴超聲5～10 min，取1 mL樣品4 ℃、7000 r/min低溫離心6 min，之后取100 μL中層清液再經(jīng)4 ℃、7000 r/min離心6 min。之后再取50 μL上層清液，加入2 倍體積的色譜級乙醇溶液，4 ℃、7000 r/min離心6 min，取80 μL上層清液，加入等體積純水，經(jīng)渦旋充分混勻后4 ℃、7000 r/min離心6 min，最后取50 μL離心后的上清液，加入700 μL體積分?jǐn)?shù)50%乙腈溶液，等待上機(jī)備用。

1.3.2 母乳寡糖檢測

母乳樣品均采用超低溫冷鏈運(yùn)輸至中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所進(jìn)行檢測。具體方法：通過不同濃度的寡糖標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線對樣品中的寡糖含量進(jìn)行測定。根據(jù)樣品中的含量將標(biāo)準(zhǔn)品分為高含量組（2’-FL、3-FL、3’-SL、6’-SL、LNT、LNnT、LDFT、LNFP-I、LNFP-I、LNFP-II、LNDFH-I &LNnDFH-I、DSLNT）和低含量組（LNFP-III、LSTb、LSTc、LNnDFH-II、LNDFH-II、3’-SLNFP-II &6’-SLNFP-VI、MFLNnH、MFLNH-III、MFLNH-I、DFpLNnH、DFLNHa），高含量組標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣2 μL、低含量標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣5 μL。進(jìn)樣2 針，分別對高含量組分和低含量組分進(jìn)行測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用GraphPad Prism 9軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和繪圖。數(shù)據(jù)采用表示，服從正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（One-way analysis of variance，One-way ANOVA）法進(jìn)行組間差異比較，未知或不服從正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異比較；P＜0.05時(shí)，組間差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 人口學(xué)資料統(tǒng)計(jì)分析

本研究共招募志愿者109 人，其中北京（東經(jīng)116°20’，北緯39°56’）17 人、包頭（東經(jīng)109°84’，北緯40°66’）21 人、西寧（東經(jīng)101°77’，北緯36°62’）20 人、昆明（東經(jīng)102°，北緯24°）11 人、濟(jì)南（東經(jīng)117°，北緯36°40’）20 人、深圳（東經(jīng)114°03’，北緯22°32’）20 人。出生時(shí)乳母和嬰兒的基本情況如表1所示，6 組乳母分娩時(shí)的年齡無顯著差異。剖宮產(chǎn)54 人，順產(chǎn)55 人，各個(gè)城市2 種分娩方式比例接近1∶1。分娩前昆明的乳母體質(zhì)量略低，其他各城市無顯著差異，經(jīng)過ANOVA檢驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)其與北京、西寧和深圳無顯著差異（P＞0.05），但顯著低于包頭和濟(jì)南（P＜0.05）。6 個(gè)城市嬰兒出生體質(zhì)量無顯著差異。嬰兒出生身長除昆明顯著低于其他城市外（P＜0.05），其他5 個(gè)城市無顯著差異（P＞0.05）。

表1 出生時(shí)乳母和嬰兒的基本情況Table 1 Basic information of lactating mothers and infants at birth

2.2 不同地區(qū)中國母乳寡糖組成和質(zhì)量濃度的差異

圖1顯示6 個(gè)城市健康母乳成熟乳中總HMOs質(zhì)量濃度、非巖藻糖基中性寡糖、巖藻糖基中性寡糖和酸性寡糖的質(zhì)量濃度差異。北京、包頭和西寧3 個(gè)城市的母乳總HMOs質(zhì)量濃度無顯著差異（P＞0.05），昆明、濟(jì)南和深圳3 個(gè)城市間母乳總HMOs質(zhì)量濃度無顯著差異（P＞0.05）。除深圳和西寧母乳無顯著差異外（P＞0.05），昆明、濟(jì)南和深圳3 個(gè)城市母乳總HMOs質(zhì)量濃度顯著高于北京、西寧和包頭（P＜0.05）。本研究中非巖藻糖基中性寡糖主要包括LNT和LNnT兩種寡糖單體，二者總質(zhì)量濃度除北京母乳顯著低于昆明、濟(jì)南和深圳母乳外（P＜0.05），其他城市間無顯著差異。而巖藻糖基中性寡糖（15 種寡糖）質(zhì)量濃度的變化趨勢與總HMOs質(zhì)量濃度一致，昆明、濟(jì)南和深圳顯著高于北京、西寧和包頭（P＜0.05）；而對于酸性寡糖（6 種酸性寡糖），6 個(gè)城市間均無顯著差異（P＞0.05）。

圖1 中國不同城市母乳寡糖質(zhì)量濃度差異分析Fig.1 Differential analysis of mass concentrations of HMOs among different cities of China

基于巖藻糖基寡糖的顯著差異，對15 種巖藻糖基中性寡糖單體（2’-FL、3-FL、LDFT、LNnDFH-II、LNDFH-II、LNDFH-I、LNnDFH-I、LNFP-I、LNFP-III、LNFP-II、MFLNnH、MFLNH-III、MFLNH-I、DFpLNnH、DFLNHa）的城市間差異進(jìn)行分析，如圖2所示，7 種寡糖在不同城市母乳間存在顯著差異（P＜0.05），其余8 種均無顯著差異（P＞0.05）。深圳母乳3-FL質(zhì)量濃度顯著高于包頭；濟(jì)南和深圳母乳中LDFT質(zhì)量濃度顯著高于包頭；濟(jì)南母乳中LNDFH-I和LNnDFH-I總和質(zhì)量濃度顯著高于西寧；北京、包頭、西寧、昆明母乳中DFLNHa質(zhì)量濃度顯著高于深圳；北京母乳LNnDFH-II質(zhì)量濃度顯著高于包頭。

圖2 中國不同城市母乳寡糖中寡糖單體差異分析Fig.2 Differential analysis of concentrations of HMO monomers among different cities of China

2.3 泌乳時(shí)間對中國母乳寡糖組成和質(zhì)量濃度的影響

為了考察泌乳時(shí)間對母乳寡糖的影響，選擇北京地區(qū)初乳、1 月齡和4 月齡成熟乳，分析隨泌乳時(shí)間延長寡糖質(zhì)量濃度的變化。如圖3所示，總HMOs質(zhì)量濃度在初乳中最高（中位值可達(dá)9000 mg/L），隨著泌乳時(shí)間延長而顯著降低，到4 月齡時(shí)降低至4000 mg/L；同樣總非巖藻糖基中性寡糖和總酸性寡糖質(zhì)量濃度均呈現(xiàn)隨月齡增加呈現(xiàn)顯著降低趨勢（P＜0.05）；1 月齡時(shí)總巖藻糖基中性寡糖質(zhì)量濃度與初乳無顯著差異（P＞0.05），但4 月齡母乳中其質(zhì)量濃度顯著低于初乳和1 月齡成熟乳（P＜0.05）。

同時(shí)本研究分析寡糖單體隨泌乳時(shí)間的變化趨勢，如圖4所示，2 種非巖藻糖基中性寡糖均隨泌乳時(shí)間延長呈現(xiàn)顯著降低趨勢。LNT在初乳時(shí)質(zhì)量濃度中位值可達(dá)1000 mg/L，到4 月齡時(shí)中位數(shù)值降低至100 mg/L，但初乳和1 月齡無顯著差異（P＞0.05）；LNnT在初乳時(shí)質(zhì)量濃度中位數(shù)值約為800 mg/L，隨著月齡延長呈現(xiàn)顯著降低趨勢，到4 月齡也降低至100 mg/L。

圖4 非巖藻糖基中性寡糖單體隨泌乳時(shí)間變化趨勢Fig.4 Changes in concentrations of non-fucosylated neutral oligosaccharide monomers with lactation time

對于15 種巖藻糖基寡糖，3 種寡糖（3-FL、LDFT和LNnDFH-II）呈現(xiàn)隨泌乳時(shí)間延長升高的趨勢，經(jīng)差異顯著分析后發(fā)現(xiàn)只有3-FL具有顯著升高趨勢（圖5）。2 種單巖藻基六糖（MFLNnH和MFLNH-III）隨泌乳時(shí)間延長呈現(xiàn)先升高再降低趨勢（圖6）。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)1 月齡單巖藻基六糖質(zhì)量濃度最高，顯著高于4 月齡母乳中質(zhì)量濃度（P＜0.05），但與初乳無顯著差異（P＞0.05）。其余10 種巖藻糖基中性寡糖均呈現(xiàn)隨泌乳時(shí)間延長而降低的趨勢，經(jīng)差異分析后發(fā)現(xiàn)LNFP-I、LNDFH-II、LNDFH-I &LNnDFH-I、MFLNH-I、DFpLNnH和DFLNHa隨泌乳時(shí)間延長呈現(xiàn)顯著降低趨勢（P＜0.05）。

圖5 3-FL質(zhì)量濃度隨泌乳時(shí)間變化趨勢Fig.5 Changes in 3-FL concentration at different lactation stages

圖6 2 種單巖藻糖基六糖隨泌乳時(shí)間變化趨勢Fig.6 Changes in concentrations of two monofucosylhexasaccharides at different lactation stages

圖7顯示了7 種酸性寡糖隨泌乳時(shí)間的變化趨勢，由于3’-SLNFP-II和6’-SLNFP-VI兩種寡糖在檢測中未分開，故二者以質(zhì)量濃度和的形式呈現(xiàn)。寡糖單體隨泌乳時(shí)間延長逐漸降低，但經(jīng)差異顯著分析后發(fā)現(xiàn)：3’-SL質(zhì)量濃度在120～180 mg/L之間，不同泌乳時(shí)間組無顯著差異（P＞0.05）；6’-SL在初乳時(shí)質(zhì)量濃度可達(dá)620 mg/L，但隨著泌乳時(shí)間延長顯著降低，到4 月齡時(shí)不足100 mg/L；LSTb 和LSTc 質(zhì)量濃度隨泌乳時(shí)間延長顯著降低（P＜0.05），尤其LSTb從初乳近400 mg/L降至4 月齡時(shí)的不足50 mg/L；DSLNT在初乳和1 月齡成熟乳中質(zhì)量濃度（220～350 mg/L）無顯著差異（P＞0.05），但到4 月齡時(shí)顯著降低至100 mg/L以下；3’-SLNFP-II和6’-SLNFP-VI兩種寡糖總和在初乳時(shí)可達(dá)150 mg/L，到1 月齡時(shí)略有降低，但差異不顯著（P＞0.05），到4 月齡時(shí)顯著降低至50 mg/L。

圖7 泌乳時(shí)間對酸性寡糖質(zhì)量濃度的影響Fig.7 Effect of lactation time on concentrations of acidic oligosaccharides

2.4 乳母血型狀態(tài)及母乳寡糖構(gòu)成分析

母親的遺傳特征決定了母乳中HMOs 的類型和數(shù)量[2,23-24]：S e基因編碼α1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶（fucosyltransferase 2，F(xiàn)UT2）。Se基因型活躍的女性被歸類為分泌型（Se＋），其乳汁中含有α1,2-巖藻糖基低聚糖；反之非Se基因型的女性則為非分泌型，其乳汁中不含有α1,2-巖藻糖基低聚糖。在Lewis血型系統(tǒng)中，Le基因編碼α1,4-FUT3。Le基因決定母乳中是否存在α1,4-巖藻糖基低聚糖。Le基因型活躍的女性被分類為Lewis陽性（Le＋），反之則為Lewis陰性（Le－）。從而會(huì)產(chǎn)生4 種主要的乳母血型基因型，即Se＋Le＋、Se＋Le－、Se－Le＋和Se－Le－。

乳母的血型基因型是造成母乳中寡糖含量差異的主要原因。本研究采用寡糖類型對乳母血型分泌型狀態(tài)以及Lewis血型狀態(tài)進(jìn)行了歸屬分析。采用2’-FL和LNFP-I作為指標(biāo)糖判斷分泌型（Se＋）和非分泌型（Se－）；采用LNFP-II作為指標(biāo)糖判斷Lewis陽性（Le＋）和Lewis陰性（Le－）。圖8結(jié)果顯示Se＋Le＋是中國乳母血型的主要基因類型，西寧地區(qū)該基因型的乳母占比最多，為95%；其次為昆明和包頭，分別為81.82%和80.95%。Se＋Le－在包頭和昆明地區(qū)分別有9.52%和9.09%的乳母，其他地區(qū)為6%以下。對于Se－Le＋，深圳乳母占比最高為25%，西寧和昆明地區(qū)無此基因型的乳母，包頭、北京和濟(jì)南在9%～20%。西寧和昆明各存在1 人次的弱分泌型Se－/Se w Le＋母乳，故這兩個(gè)地區(qū)Se－/Se w Le＋分型的占比分別為5.00%和9.09%，其他地區(qū)為0%。

圖8 不同城市乳母血型基因型分布圖Fig.8 Distribution of blood group genotypes of lactating mothers in different cities

圖9比較了不同血型基因型的母乳寡糖單體質(zhì)量濃度的差異。結(jié)果表明，相較于其他血型基因型，Se＋Le－型的乳母母乳中2’-FL、LNFP-I、MFLNH-I和DFLNHa的質(zhì)量濃度最高；Se－Le＋型的乳母母乳中3-FL、LNFP-II、MFLNH-III和3’-SL質(zhì)量濃度最高；Se－/Se w Le＋型的乳母母乳中3-FL、LNFP-II、LNT和DSLNT質(zhì)量濃度較高；而分泌所有寡糖單體的Se＋Le＋型，其乳母乳汁中寡糖質(zhì)量濃度并不一定是最高的，由圖9可知，除LNDFH-II、LNDFH-I &LNnDFH-I、6’-SL和LSTc質(zhì)量濃度比其他血型基因型高以外，其他寡糖的質(zhì)量濃度都不是最高的。

圖9 HMOs在不同血型基因型乳母母乳中的質(zhì)量濃度比較Fig.9 Comparison of HMO concentrations in breast milk from lactating mothers of different blood group genotypes

3 討論

3.1 地域因素對母乳寡糖組成和質(zhì)量濃度的影響

地域差異是影響母乳營養(yǎng)成分的重要因素。Erney等[25]分析來自10 個(gè)國家的435 名乳母母乳中9 種中性寡糖的組成差異，發(fā)現(xiàn)156 個(gè)墨西哥母乳樣本中都含有2’-FL，而22 個(gè)菲律賓母乳樣本中僅有46%含有2’-FL。2’-FL既是母乳中質(zhì)量濃度最高的巖藻糖基化寡糖，也是質(zhì)量濃度最高的HMO，因其結(jié)構(gòu)與腸道黏膜細(xì)胞表面的糖蛋白、糖鏈相似，可抑制病原體黏附，促進(jìn)有益菌定殖，降低感染的發(fā)生[26-27]。此外，臨床試驗(yàn)和預(yù)臨床模型證實(shí)2’-FL在促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)功能[13]、促進(jìn)腸道屏障功能和腸道成熟[28]、促進(jìn)大腦發(fā)育和認(rèn)知功能[29]等方面具有潛力。地域因素是造成母乳寡糖構(gòu)成差異的因素之一，可能是由于遺傳特性的不均勻分布造成的。姚文[24]對中國和美國母親母乳中性寡糖濃度差異及相關(guān)基因FUT2的多態(tài)性進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)美國母親母乳中α1,3-和α1,4-巖藻糖濃度遠(yuǎn)高于中國母親，而中國母親母乳中α1,2-巖藻糖濃度在總中性寡糖中的比例高于美國母親。其他涉及地域的研究文獻(xiàn)多是以某地區(qū)母乳樣本為例進(jìn)行母乳寡糖構(gòu)成和變化的影響分析。Asakuma等[30]研究發(fā)現(xiàn)日本母親成熟乳中2’-FL平均質(zhì)量濃度為1480 mg/L；Leo等[31]分析了南太平洋薩摩亞群島母親的初乳，其2’-FL質(zhì)量濃度為330 mg/L；魏遠(yuǎn)安等[21]以中國廣東江門地區(qū)為例分析中國母乳中寡糖組分及含量變化；郭文奎等[32]收集了哈爾濱63 位母親的母乳樣品，分析了6 種HMOs的組成和含量變化；張新景[33]檢測了石家莊地區(qū)母乳中12 種HMOs的含量及其影響因素；Wu Jiayi等[34]檢測了中國222 名母親母乳的24 種寡糖，其研究最終顯示2’-FL在分泌型母親中的濃度低于西方人群，但高于非洲人群。

我國地域遼闊，區(qū)域差異明顯，對多個(gè)代表地區(qū)母乳中HMOs組成和含量進(jìn)行深入剖析對于實(shí)現(xiàn)全民營養(yǎng)健康有重要意義。本研究比較了我國東西南北6 個(gè)城市母乳中HMOs的組成和質(zhì)量濃度差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)北京、包頭和西寧的HMOs組成和質(zhì)量濃度接近，昆明、濟(jì)南和深圳HMOs構(gòu)成相近，且總HMOs質(zhì)量濃度和總巖藻糖基中性寡糖前者低于后者；而總非巖藻糖基中性寡糖和總酸性寡糖無地區(qū)間差異。進(jìn)一步比較了15 種巖藻糖基中性寡糖單體的地區(qū)間差異，發(fā)現(xiàn)包頭地區(qū)的多種寡糖單體顯著低于其他城市，3-FL質(zhì)量濃度顯著低于深圳；LDFT質(zhì)量濃度顯著低于深圳和濟(jì)南；LNnDFH-II質(zhì)量濃度顯著低于北京；這說明包頭地區(qū)母乳中寡糖質(zhì)量濃度整體偏低，在嬰幼兒營養(yǎng)攝入中需重視母乳寡糖的補(bǔ)充。另外，從功能上看母乳寡糖與嬰幼兒腸道菌群和健康直接相關(guān)，應(yīng)當(dāng)重點(diǎn)關(guān)注該地區(qū)嬰兒腸道發(fā)育與健康狀況。此外，巖藻糖基寡糖和唾液酸性寡糖對嬰幼兒的神經(jīng)認(rèn)知發(fā)育都有潛在的促進(jìn)作用[35]，對于因地域因素受到影響的巖藻糖基寡糖和唾液酸性寡糖的單糖，在特定區(qū)域可額外補(bǔ)充或在嬰兒配方粉配方設(shè)計(jì)時(shí)重點(diǎn)考慮。

3.2 泌乳時(shí)間對母乳寡糖組成和質(zhì)量濃度的影響

泌乳時(shí)間是母乳營養(yǎng)成分的重要影響因素。Soyy?lmaz等[7]對31 個(gè)國家的HMOs含量進(jìn)行綜述，發(fā)現(xiàn)初乳中的總HMOs質(zhì)量濃度為17.7 g/L，過渡乳為13.3 g/L，成熟乳為11.3 g/L，并且每種HMOs濃度差異很大，隨著哺乳階段的不同而不同。魏遠(yuǎn)安等[21]研究發(fā)現(xiàn)15 種中性寡糖含量在泌乳初期（初乳）達(dá)到最高值后逐漸減少（成熟乳），但是3-FL質(zhì)量濃度在整個(gè)取樣階段持續(xù)增加；6 種酸性寡糖質(zhì)量濃度在泌乳初期穩(wěn)定但后期隨時(shí)間延長逐漸減少。朱婧等[36]研究不同泌乳階段10 種游離寡糖的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2’-FL、3’-SL、6’-SL、LNT、LNnT、LNFP-I與泌乳時(shí)間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，3-FL與泌乳時(shí)間存在正相關(guān)關(guān)系。Thurl等[1]綜述泌乳時(shí)間對母乳寡糖含量的影響：在母親產(chǎn)后前3 個(gè)月，3-FL隨泌乳時(shí)間延長而顯著增加（至少2 倍）；在產(chǎn)后前4 個(gè)月，LNFP-III含量呈不顯著的上升趨勢；在整個(gè)泌乳期LNFP-I（近2 倍）和LSTc（近4 倍）呈現(xiàn)顯著下降趨勢；其他幾種HMOs，如中性寡糖和酸性寡糖在泌乳過程中呈不顯著降低趨勢；6’-SL和LSTa含量在產(chǎn)后的100 d內(nèi)顯著降低。Elwakiel等[23]的研究表明中國母乳的總HMOs濃度在20 周內(nèi)隨泌乳期延長顯著降低，與母親的血型基因型無關(guān)，總酸性和中性HMOs濃度隨泌乳期延長也呈下降趨勢，但是下降水平受母親血型基因型影響。Wu Jiayi等[34]研究表明，酸性HMOs隨哺乳期的延長顯著降低，且與母親的血型基因型無關(guān)。

總體來看，本研究與前人報(bào)道基本一致，總HMOs、總酸性HMOs、總中性HMOs的質(zhì)量濃度均隨泌乳時(shí)間延長呈降低趨勢；中性寡糖（LNT、LNnT、LNFP-I、LNDFH-II、LNDFH-I &LNnDFH-I、MFLNH-I、DFpLNnH和DFLNHa）和酸性寡糖（6’-SL、DSLNT、3’-SLNFP-II &6’-SLNFP-VI）隨泌乳時(shí)間延長呈顯著降低趨勢。本研究發(fā)現(xiàn)除3-FL質(zhì)量濃度隨泌乳時(shí)間延長呈現(xiàn)顯著上升趨勢外，LDFT和LNnDFH-II也隨泌乳時(shí)間呈上升趨勢，但差異不顯著。2 種單巖藻基六糖（MFLNnH和MFLNH-III）隨泌乳時(shí)間延長呈現(xiàn)先升高再降低趨勢，到1 月齡時(shí)質(zhì)量濃度達(dá)到最高，之后持平或者略降低?？紤]到總HMOs和各大分類的HMOs質(zhì)量濃度均呈下降趨勢，同時(shí)不同單體又隨泌乳期延長呈現(xiàn)不同的變化規(guī)律，嬰幼兒配方食品在配方設(shè)計(jì)時(shí)可考慮面向不同時(shí)期嬰/幼兒進(jìn)行不同含量及不同配比的組合物設(shè)計(jì)。尤其在配方設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注隨泌乳期含量增加的3-FL，其在生理功能上已被廣泛證實(shí)與巖藻糖基化的2’-FL相近，包括益生特性、免疫調(diào)節(jié)作用、抗黏附、抗菌、抗病毒能力和胃腸道保護(hù)等[37]。

3.3 乳母血型狀態(tài)對母乳寡糖組成和含量的影響

Lewis血型系統(tǒng)中的Se基因編碼巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶FUT2，該酶控制α1,2-巖藻糖基寡糖的產(chǎn)生；Le基因編碼FUT3，調(diào)控α1,4-巖藻糖基寡糖的產(chǎn)生[9,23]。本研究中分泌型和非分泌型的比例分別為85.32%和14.68%，分泌型的比例略高于國內(nèi)外研究中報(bào)道的水平。Soyy?lmaz等[7]綜述指出，全球大約有80%的分泌型母親和20%的非分泌型母親。Wu Jiayi等[34]研究發(fā)現(xiàn)，222 名母親中77%是分泌型，23%是非分泌型。關(guān)于整體的母乳分型，本研究結(jié)果與Elwakiel等[23]報(bào)道一致，同樣發(fā)現(xiàn)了3 種基因組合類型的母乳（Se＋Le＋、Se－Le＋、Se＋Le－），未檢測到Se－Le－類型，且中國乳母血型基因型以Se＋Le＋為主，其占比為79.82%，Se－Le＋和Se＋Le－占比分別為12.84%和5.50%。本研究中包頭與Elwakiel等[23]研究城市呼和浩特地理位置非常接近，二者報(bào)道的3 種主要類型乳母比例較接近（包頭Se＋Le＋85%、Se－Le＋10%、Se＋Le－5%；呼和浩特Se＋Le＋73%、Se－Le＋20%、Se＋Le－7%）。同時(shí)本研究進(jìn)一步橫向?qū)Ρ任覈鴸|西南北不同城市中3 種主要基因類型的乳母比例，發(fā)現(xiàn)西寧和昆明地區(qū)存在弱分泌型Se－/Se w Le＋乳母（5.00%和9.09%），濟(jì)南和深圳地區(qū)非分泌型占比較高（20%和25%）；西寧的Se＋Le＋類型比例是6 個(gè)城市中最高的，超過90%。本研究進(jìn)一步分析不同基因型乳母中寡糖單體含量的差異（圖9），結(jié)果發(fā)現(xiàn)2’-FL和LNFP-I在Se＋Le－的乳母母乳中質(zhì)量濃度最高，3-FL和LNFP-II在Se－Le＋母乳中質(zhì)量濃度最高，LNT在Se－/Se w Le＋母乳中質(zhì)量濃度最高，而分泌所有寡糖單體的Se＋Le＋類型母乳中除了LNDFH-II、LNDFH-I &LNnDFH-I、6’-SL和LSTc質(zhì)量濃度比其他血型基因型高以外，其他18 種寡糖質(zhì)量濃度均低于其他血型基因型。對比城市差異時(shí)發(fā)現(xiàn)包頭地區(qū)總寡糖和多種寡糖單體的質(zhì)量濃度顯著低于其他城市，但該城市Se＋Le＋類型乳母比例達(dá)到80%以上。這也進(jìn)一步說明地域-血型基因型-母乳寡糖組成和含量的人群差異性及特征性。

4 結(jié)論

本研究采用縱向隊(duì)列研究方式對中國6 個(gè)代表性地區(qū)母乳樣本中的HMOs進(jìn)行分析，結(jié)果證實(shí)地區(qū)、泌乳階段和乳母血型基因型在一定程度上對母乳寡糖組成和含量的差異產(chǎn)生影響?？侶MOs含量和總巖藻糖基中性寡糖含量，從地域分布上呈現(xiàn)東南地區(qū)高于西北地區(qū)，而總酸性寡糖在各城市間均無明顯差異。對于泌乳期而言，總HMOs含量、非巖藻糖基中性寡糖、巖藻糖基中性寡糖和酸性寡糖含量均隨泌乳時(shí)間延長呈現(xiàn)明顯的下降趨勢；在寡糖單體類型上僅3-FL含量隨泌乳時(shí)間延長呈顯著上升趨勢。以分泌型和非分泌型的數(shù)據(jù)來看，其比例分別為85.32%和14.68%；以整體母乳的血型基因型分布看，我國主要為占比79.82%的Se＋Le＋，Se－Le＋和Se＋Le－分別占比為12.84%和5.50%。

本研究針對我國代表性地區(qū)的HMOs構(gòu)成特征研究，首先對HMOs的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供一定的數(shù)據(jù)參考，為未來我國嬰幼兒配方食品中HMOs的精準(zhǔn)化添加提供了重要科學(xué)支撐。如嬰幼兒配方粉或原料生產(chǎn)企業(yè)，可考慮針對特定地域和特定月齡定制HMOs組合物。其次，依托于現(xiàn)有研究對不同血型基因型乳母乳汁中HMOs的輪廓和含量分析，臨床上可進(jìn)一步探究其與嬰幼兒健康的關(guān)系，如結(jié)合喂養(yǎng)不同血型基因型乳母乳汁的嬰兒腸道菌群，及其生長發(fā)育、腸道舒適性、疾病等情況，進(jìn)行不同HMOs構(gòu)成、腸道菌群及健康三者之間的關(guān)聯(lián)性或機(jī)制的研究。