基于代謝組學(xué)的‘鐵觀音’和‘水仙’品種茶葉化學(xué)成分解析

周 闖，趙燕妮，周夢(mèng)雪，彭佳堃，陳 丹，王 哲，林 智，陳雪峰，戴偉東,

（1.陜西科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 西安 710021；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部茶樹(shù)生物學(xué)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，浙江 杭州 310008；3.陜西農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究院，陜西 西安 710021）

茶是世界三大無(wú)酒精飲料之一，因其獨(dú)特的滋味和香氣備受消費(fèi)者的青睞。茶中豐富多樣的代謝物，如茶多酚、茶氨酸、咖啡堿、茶多糖等賦予茶葉多層次的口感及濃郁的香氣[1]。茶葉品質(zhì)受品種、加工工藝、生長(zhǎng)區(qū)域、氣候條件、采摘季節(jié)、原料嫩度等因素的影響，其中茶樹(shù)品種是基礎(chǔ)，制茶工藝是關(guān)鍵[2-4]。

烏龍茶是我國(guó)六大茶類之一，以其優(yōu)雅的果香和花香而聞名，主要產(chǎn)自我國(guó)福建省閩南和閩北等地區(qū)。‘鐵觀音’和‘水仙’分別為我國(guó)閩南和閩北地區(qū)烏龍茶的代表，深受大眾的喜愛(ài)。不同茶樹(shù)品種茶葉的風(fēng)味特征具有較大差異，‘鐵觀音’茶樹(shù)品種為中灌木型，葉張肥厚，是閩南烏龍茶中重要的品種之一，通常按照閩南烏龍茶加工工藝制成清香型烏龍茶，所制‘鐵觀音’烏龍茶沖泡后有天然的蘭花香，滋味醇厚甘鮮，香氣馥郁持久，俗稱“觀音韻”，并有“七泡有余香”之譽(yù)[5]。研究表明，兒茶素、咖啡堿、檸檬烯、橙花叔醇、α-法呢烯、吲哚、丁酸苯乙酯、芳樟醇等化學(xué)成分對(duì)于‘鐵觀音’烏龍茶的滋味和香氣品質(zhì)具有重要貢獻(xiàn)，可能是‘鐵觀音’茶“觀音韻”品質(zhì)特征形成的重要因素[6-7]?！伞铇?shù)品種為小喬木型，葉肉厚，葉張較普通小葉種大一倍以上[8]，是烏龍茶產(chǎn)區(qū)種植最廣泛的茶樹(shù)品種，制作清香型和濃香型烏龍茶均較適宜，所制‘水仙’烏龍茶具有尖銳而典型的花香，滋味醇厚、回味甘爽，深受消費(fèi)者的喜愛(ài)；所制紅茶和綠茶條索肥壯，顯毫，香高味濃[9]。有研究表明，‘水仙’茶葉特有的香氣主要來(lái)源于香葉醇和橙花醇[10]。綠茶（未發(fā)酵茶）、清香和濃香烏龍茶（半發(fā)酵茶）、紅茶（全發(fā)酵茶）是我國(guó)消費(fèi)的主要茶類，不同制茶工藝對(duì)茶葉化學(xué)成分和風(fēng)味品質(zhì)具有重要影響[11]。未發(fā)酵和半發(fā)酵茶通常含有較高含量的茶多酚，苦澀味較強(qiáng)；茶多酚經(jīng)茶葉發(fā)酵過(guò)程中多酚氧化酶催化的氧化反應(yīng)，茶湯苦澀味降低，滋味變得醇厚[12]。此前，已有研究針對(duì)不同等級(jí)‘鐵觀音’烏龍茶的代謝物差異和不同加工工藝對(duì)‘水仙’烏龍茶香氣成分的影響展開(kāi)研究，但目前對(duì)于‘鐵觀音’和‘水仙’兩個(gè)品種的化學(xué)成分差異以及茶葉在不同加工過(guò)程中化學(xué)物質(zhì)的變化規(guī)律還有待系統(tǒng)性研究[13-14]。

代謝組學(xué)可同時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)樣品中的低分子質(zhì)量代謝物進(jìn)行全面系統(tǒng)的定性和（半）定量分析，能夠全面、準(zhǔn)確地解析茶葉內(nèi)物質(zhì)的變化規(guī)律。本研究采用基于超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF/MS）的非靶向代謝組學(xué)方法與超高效液相色譜-四極桿靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜（ultrahigh performance liquid chromatography-quadrupole orbitrap mass spectrometry，UPLC-Q-Exactive/MS）、氨基酸分析儀的絕對(duì)定量分析方法相結(jié)合，分別對(duì)‘鐵觀音’和‘水仙’不同品種茶葉及‘水仙’品種經(jīng)過(guò)不同加工工藝制成的綠茶、清香烏龍茶、濃香烏龍茶和紅茶的化學(xué)成分進(jìn)行分析，闡釋‘鐵觀音’和‘水仙’茶樹(shù)品種及不同加工工藝對(duì)茶葉化學(xué)成分的影響，并進(jìn)一步探討茶葉化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)與風(fēng)味品質(zhì)的關(guān)系，以期為厘清‘鐵觀音’和‘水仙’烏龍茶品質(zhì)形成機(jī)理提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

取福建省永春縣同一產(chǎn)地的‘鐵觀音’（Camellia sinensiscv.Tieguanyin）和‘水仙’（Camellia sinensiscv.Shuixian）品種一芽二葉鮮葉，分別加工制成‘鐵觀音’品種的綠茶、清香烏龍茶、濃香烏龍茶、紅茶以及‘水仙’品種的綠茶、清香烏龍茶、濃香烏龍茶、紅茶，共計(jì)8 種樣品。綠茶經(jīng)過(guò)攤放、殺青、揉捻、干燥加工制成；2 種香型烏龍茶均經(jīng)歷萎凋、做青（涼青和搖青）、殺青、包揉與干燥（焙火）的加工步驟，其中，清香烏龍茶做青程度較輕，通過(guò)較低溫（80～90 ℃）干燥制成，而濃香烏龍茶做青程度高于清香烏龍茶，并經(jīng)過(guò)高溫（90～100 ℃）焙火而成；紅茶經(jīng)過(guò)萎凋、揉捻、發(fā)酵和干燥制成。制得的茶樣經(jīng)磨碎后放入－20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆茫怨┖罄m(xù)的代謝組學(xué)等分析。

氨基酸類化合物、兒茶素類化合物、沒(méi)食子酸、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-半乳糖苷、山柰酚-3-半乳糖苷、山柰酚-3-蕓香糖苷、牡荊素、異牡荊素、楊梅素-3-半乳糖苷等標(biāo)準(zhǔn)品，乙腈、甲醇（色譜級(jí)）美國(guó)Sigma-Aldrich公司；咖啡堿 美國(guó)Enzo Life Sciences公司；茶氨酸、蘆丁、槲皮素-3-蕓香糖苷（標(biāo)準(zhǔn)品）北京百靈威科技有限公司；甲酸 日本TCI公司；AlCl3上海美興化工股份有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

S-433 D 氨基酸分析儀 德國(guó)Sykam 公司；ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色譜儀 英國(guó)Waters公司；UPLC-Q-TOF/MS儀 美國(guó)Agilent Technologies公司；UV-3600紫外分光光度計(jì) 日本Shimadzu公司；UPLC-Q-Exactive/MS儀 美國(guó)Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取0.1 g茶樣于離心管中，加入20 mL體積分?jǐn)?shù)70%甲醇溶液，充分浸潤(rùn)后放入70 ℃水浴中浸提30 min，8000 r/min離心10 min，取上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾[15]。每個(gè)樣品設(shè)置3 個(gè)平行重復(fù)。

1.3.2 氨基酸、兒茶素類、咖啡堿和沒(méi)食子酸含量測(cè)定

用氨基酸分析儀檢測(cè)茶樣中游離氨基酸組分，參考Yang Chen等[16]的處理方法，采用Na＋型磺酸基強(qiáng)酸陽(yáng)離子交換樹(shù)脂進(jìn)行分離，流速為0.25 mL/min。波長(zhǎng)設(shè)為570 nm和440 nm，柱溫40 ℃，通過(guò)與氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液比較峰保留時(shí)間進(jìn)行定性，用外標(biāo)法測(cè)定濃度。

參考課題組前期已建立的方法[17]，采用UPLC-QExactive/MS測(cè)定兒茶素類化合物、咖啡堿和沒(méi)食子酸含量。BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），柱溫35 ℃。采用二元流動(dòng)相洗脫，流速為0.35 mL/min，進(jìn)樣量5 μL。A相為0.1%甲酸溶液、B相為純甲醇。梯度洗脫方法：0～3 min，97%～92% A、3%～8% B；3～7.5 min，92%～80% A、8%～20% B；7.5～11 min，80%～40% A、20%～60% B；11～13 min，40%～20% A、60%～80% B；13～14.5 min，20%～40% A、80%～60% B；14.5～15 min，40%～97% A、60%～3% B；15～19 min，97% A、3% B。采用外標(biāo)法測(cè)定兒茶素類化合物、咖啡堿和沒(méi)食子酸含量。

1.3.3 代謝組學(xué)分析

色譜條件：參考課題組前期已建立的方法[18]，采用UPLC-Q-TOF/MS進(jìn)行茶葉代謝組學(xué)分析。Zorbax Eclipse Plus C18色譜柱（150 mm×3.0 mm，1.8 μm），柱溫40 ℃。采用二元流動(dòng)相洗脫，流速為0.4 mL/min，進(jìn)樣量4 μ L。A 相為0.1%甲酸溶液、B 相為純甲醇。梯度洗脫方法：0～3 min，95%～90% A、5%～10% B；3～4 min，90%～85% A、10%～15% B；4～7 min，85%～70% A、15%～30% B；7～16 min，70%～50% A、30%～50% B；16～20 min，50%～5% A、50%～95% B；20～22 min，5% A、95% B；22～22.5 min，5%～95% A、95%～5% B；22.5～26 min，95% A、5% B。

質(zhì)譜條件：質(zhì)譜采用雙射流電噴霧離子源，正離子模式掃描，毛細(xì)管電壓為4000 V，干燥氣溫度325 ℃，流速10 L/min，霧化氣壓強(qiáng)40 psi，氣溫度325 ℃，流速11 L/min；質(zhì)譜掃描范圍為m/z100～1000。

1.4 數(shù)據(jù)處理

UPLC-Q-TOF/MS得到的原始譜圖采用Profinder B.08.00軟件和Mass Profiler Professional 13.0軟件進(jìn)行峰提取和峰匹配；使用SIMCA-P 14.1軟件進(jìn)行偏最小二乘判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLSDA）和正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）；使用SPSS 25軟件進(jìn)行非參數(shù)Mann-Whitney U檢驗(yàn)；使用Origin 2021軟件繪制柱狀圖；采用Mev 4.7.4軟件完成熱圖分析；實(shí)驗(yàn)結(jié)果以表示。

2 結(jié)果與分析

為了研究‘鐵觀音’和‘水仙’品種茶及不同加工工藝對(duì)茶葉化學(xué)成分的影響，利用基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的非靶向代謝組學(xué)方法進(jìn)行分析。經(jīng)峰匹配與峰面積校準(zhǔn)后共得到2216 個(gè)化合物離子用于后續(xù)分析。通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品比較、一級(jí)質(zhì)譜、二級(jí)質(zhì)譜、以及結(jié)合課題組之前的工作[18]共鑒定出156 種化合物，包括兒茶素類15 種：兒茶素（catechin，C）、表兒茶素（epicatachin，EC）、表沒(méi)食子兒茶素（epigallocatachin，EGC）、表兒茶素沒(méi)食子酸酯（epicatachin gallate，ECG）和表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（epigallocatachin gallate，EGCG）、沒(méi)食子兒茶素（catechin gallate，GC）和沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（gallocatechin gallat，GCG）、(－)-表沒(méi)食子兒茶素-3-O-（3’’-O-甲基）沒(méi)食子酸酯（EGCG3’’Me）、(－)-表沒(méi)食子兒茶素-3-O-(4’’-O-甲基)沒(méi)食子酸酯（EGCG4’’Me）、表兒茶素-3-O-(3’’-O-甲基)-沒(méi)食子酸酯（ECG3’’Me）等；二聚兒茶素類14 種：原花青素B1、茶黃素、聚酯型兒茶素A、表兒茶素-4α-8-表兒茶素沒(méi)食子酸酯等；氨基酸類14 種：茶氨酸、色氨酸、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）、脯氨酸等；生物堿類10 種：咖啡堿、可可堿、甘油磷酸膽堿、(S)-5’-脫氧-5’-(甲基亞磺?；?、腺苷等；酚酸類14 種：綠原酸、茶沒(méi)食子素、4-咖啡酰奎寧酸、3-香豆?？鼘幩岬龋挥袡C(jī)酸類5 種：奎寧酸、泛酸、哌啶甲酸等；香氣糖苷類5 種：芳樟醇氧化物櫻草糖苷、芳樟醇櫻草糖苷、苯甲醇櫻草糖苷等；N-乙基-2-吡咯烷酮取代的兒茶素（N-ethyl-2-pyrrolidinone-substituted flavan-3-ols，EPSF）類7 種：(5’’S)-N-乙基-2-吡咯烷酮取代的表兒茶素（(5’’S)-Nethyl-2-pyrrolidinone-substituted epicatechin，(S)-ECcThea）、(5’’R)-N-乙基-2-吡咯烷酮取代的表兒茶素（(5’’R)-N-ethyl-2-pyrrolidinone-substituted epicatechin，(R)-EC-cThea）、(5’’’R)-N-乙基-2-吡咯烷酮取代的表兒茶素沒(méi)食子酸酯（(5’’’R)-N-ethyl-2-pyrrolidinonesubstituted epicatechin gallate，(R)-ECG-cThea）、(5’’S)-N-乙基-2-吡咯烷酮取代的表沒(méi)食子兒茶素（(5’’S)-Nethyl-2-pyrrolidinone-substituted epigallocatechin，(S)-EGC-cThea）、(5’’R)-N-乙基-2-吡咯烷酮取代的表沒(méi)食子兒茶素（(5’’R)-N-ethyl-2-pyrrolidinone-substituted epigallocatechin，(R)-EGC-cThea）、(5’’’S)-N-乙基-2-吡咯烷酮取代的表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（(5’’’S)-N-ethyl-2-pyrrolidinone-substituted epigallocatechin gallate，(S)-EGCG-cThea）、(5’’’R)-N-乙基-2-吡咯烷酮取代的表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（(5’’’R)-N-ethyl-2-pyrrolidinone-substituted epigallocatechin gallate，(R)-EGCG-cThea）；黃酮（醇）糖苷類31 種：山柰酚-3-葡萄糖苷、楊梅-3-半乳糖苷、柚皮素、牡荊素、芹菜素-6,8-C-二葡萄糖苷等；脂類33 種：甘油單酯（18:0）、溶血磷脂酰膽堿（16:0）、棕櫚酸、磷脂酰乙醇胺（34:3）等；其他化合物8 種：羥基茉莉酸葡萄糖苷、二氫獼猴桃內(nèi)酯等。

2.1 ‘鐵觀音’與‘水仙’品種茶葉化學(xué)成分分析

由圖1A可知，‘鐵觀音’與‘水仙’茶在第1主成分（R2X[1]＝0.246）上具有明顯的分離趨勢(shì)，表明‘鐵觀音’與‘水仙’兩個(gè)品種制作的綠茶、清香烏龍茶、濃香烏龍茶、紅茶的化學(xué)成分含量存在明顯差異。載荷圖也叫相關(guān)性圖，化合物之間相關(guān)性越強(qiáng)越聚攏，差異性越強(qiáng)越分散；如圖1B所示，大部分生物堿類、脂類、甲基化兒茶素類化合物分布在載荷圖的左側(cè)，即在‘鐵觀音’茶中含量較高；而茶氨酸和大部分兒茶素類、黃酮（醇）糖苷類、酚酸類、EPSF類化合物分布在載荷圖的右側(cè)，即在‘水仙’茶中含量較高。進(jìn)一步選取位于載荷圖中距離原點(diǎn)較遠(yuǎn)的化合物，即對(duì)模型分類貢獻(xiàn)較大的差異化合物進(jìn)行熱圖分析。

圖1 ‘鐵觀音’與‘水仙’品種茶葉樣本的OPLS-DA得分圖（A）和載荷圖（B）Fig.1 OPLS-DA score plot (A) and loading plot (B) of tea samples made from ‘Tieguanyin’ and ‘Shuixian’ tea cultivars

如圖2A所示，大部分的生物堿類（咖啡堿、甘油磷酸膽堿）、脂類（甘油二酯（36:6）、磷脂酰膽堿（36:6）、磷脂酰乙醇胺（34:2）等）在‘鐵觀音’茶中含量較高?？Х葔A是茶葉中重要的生物堿，是茶葉中主要的苦味物質(zhì)[10]，推測(cè)‘鐵觀音’茶較‘水仙’茶可能具有更顯著的苦味。脂類含量在‘鐵觀音’和‘水仙’茶中存在差異，‘鐵觀音’茶中大多數(shù)磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺以及甘油二酯類化合物含量較高，而大部分溶血磷脂酰膽堿類化合物含量在‘水仙’茶中含量較高。大部分黃酮（醇）糖苷類化合物在‘水仙’茶中含量較高，只有少量黃酮（醇）糖苷類化合物如山柰酚糖苷等在‘鐵觀音’茶中較高。此外，EGCG3’’Me和焦脫鎂葉綠酸α甲酯在‘鐵觀音’茶中含量較高，且EGCG3’’Me在‘鐵觀音’品種茶中的平均含量是‘水仙’茶的1.5 倍。

圖2 ‘鐵觀音’（A）與‘水仙’（B）品種茶葉中代表性差異化合物Fig.2 Contents of representative differential compounds in‘Tieguanyin’ (A) and ‘Shuixian’ (B) tea samples

茶氨酸作為茶葉中含量最高的氨基酸，是茶葉鮮味的主要來(lái)源[16]。本研究中，茶氨酸含量在‘水仙’茶中較高。與‘鐵觀音’茶相比，‘水仙’茶含有更豐富的黃酮（醇）糖苷類化合物，大部分為山柰酚糖苷，包括山柰酚-3-半乳糖苷、山柰酚-3-半乳糖基蕓香糖苷、山柰酚-3-葡萄糖苷等?！伞柚袃翰杷仡悾–、EC、ECG和EGCG等）和二聚兒茶素類（原花青素B1和原花青素B2等）比‘鐵觀音’茶中更豐富，如C在‘水仙’品種茶中平均含量是‘鐵觀音’茶的2 倍；較高含量的兒茶素類和二聚兒茶素類可能是‘水仙’品種鮮葉制作烏龍茶、綠茶、紅茶滋味均較醇厚的原因[10]?！伞柚? 種EPSF類化合物（(R)-EC-cThea、(R)-ECG-cThea、(R)-EGC-cThea、(R)-EGCG-cThea、(S)-EC-cThea、(S)-EGCcThea、(S)-EGCG-cThea）的含量高于‘鐵觀音’茶，且‘水仙’茶中的總EPSF含量是‘鐵觀音’茶的2 倍（圖2）。前期研究發(fā)現(xiàn)EPSF類成分是焙火程度較高的濃香烏龍茶的特征成分之一[19]，‘水仙’相比于‘鐵觀音’更容易在加工過(guò)程中形成EPSF類成分，可能是‘水仙’更適合制作濃香烏龍茶，而‘鐵觀音’更適合制作清香烏龍茶的原因。此外，少部分酚酸（如茶沒(méi)食子素）及香氣前體物質(zhì)（如芳樟醇櫻草糖苷）也在‘水仙’茶中含量較高；芳樟醇櫻草糖苷是茶葉重要香氣成分芳樟醇的前體物質(zhì)，具有清新花香[20]；‘水仙’茶中具有較高含量的芳樟醇櫻草糖苷，可能是‘水仙’烏龍茶往往具有較為馥郁花香的原因之一。

2.2 不同加工工藝‘水仙’品種茶葉化學(xué)成分分析

為探究加工工藝對(duì)茶葉化學(xué)成分的影響，選用‘水仙’作為代表性茶樹(shù)品種，對(duì)其茶鮮葉制成的綠茶、清香烏龍茶、濃香烏龍茶和紅茶進(jìn)行分析。

PLS-DA 發(fā)現(xiàn)，綠茶、清香烏龍茶、濃香烏龍茶和紅茶樣品在第1 主成分上具有明顯的分離趨勢(shì)（圖3A），說(shuō)明水仙茶鮮葉經(jīng)不同加工工藝處理后代謝物存在明顯差異。對(duì)模型擾動(dòng)測(cè)試200 次（圖3B），得到交叉驗(yàn)證的參數(shù)R2和Q2截距分別為0.143和－0.54，表明所建立的模型可靠。

圖3 不同加工工藝‘水仙’品種茶葉樣本的PLS-DA得分圖（A）和200 次擾動(dòng)測(cè)試得到的交叉驗(yàn)證圖（B）Fig.3 PLS-DA score plot (A) and cross validation plot obtained from 200 permutations (B) of different kinds of ‘Shuixian’ tea

從已鑒定的化合物中篩選出‘水仙’綠茶、清香烏龍茶、濃香烏龍茶和紅茶樣品中具有顯著差異（P＜0.05）的化合物共127 個(gè)。為進(jìn)一步研究它們?cè)? 種茶葉中的差異，采用熱圖分析并結(jié)合Pearson相關(guān)系數(shù)的聚類分析，結(jié)果如圖4所示。黃色表示樣品中的代謝物高于平均水平，藍(lán)色表示代謝物低于平均值?？梢钥闯觯G茶、清香烏龍茶、濃香烏龍茶和紅茶中化合物含量存在差異，以下對(duì)代表性的差異代謝物進(jìn)行分析與討論。

圖4 不同加工工藝‘水仙’品種茶葉樣本中化合物含量變化熱圖Fig.4 Heatmap of changes in compound contents of different kinds of‘Shuixian’ tea

2.2.1 游離氨基酸及生物堿類化合物

氨基酸是茶葉中的主要化學(xué)成分之一，其含量約占茶葉干質(zhì)量的1%～4%，賦予了茶葉一定的鮮味和香氣，同時(shí)使茶湯呈現(xiàn)鮮爽的特征。一般認(rèn)為氨基酸含量較高的茶葉具有較好的風(fēng)味[21-22]。經(jīng)過(guò)不同加工工藝處理后，茶葉中總游離氨基酸的含量發(fā)生了顯著變化，結(jié)果如表1所示，綠茶中游離氨基酸總量最高（（2.14±0.09）mg/g），其次是清香烏龍茶（（0.97±0.07）mg/g）和紅茶（（0.90±0.03）mg/g），濃香烏龍茶中游離氨基酸總量最低（（0.30±0.02）mg/g）。

表1 不同加工工藝‘水仙’品種鮮葉制作的茶葉中化學(xué)成分（n＝3）Table 1 Contents of free amino acids,catechins,methylated catechins,EPSF,caffeine,and gallic acid in different kinds of ‘Shuixian’ tea (n=3)

茶氨酸是茶葉中特有的氨基酸，賦予茶葉獨(dú)特的鮮味，可以緩解咖啡因的苦味[23-24]。綠茶、清香烏龍茶、濃香烏龍茶和紅茶中茶氨酸的含量分別為1.23、0.50、0.12 mg/g和0.21 mg/g，分別占氨基酸總量的57.5%、51.5%、40%和23.3%。在綠茶、清香烏龍茶和紅茶中，隨著發(fā)酵程度的加深，氨基酸含量逐漸下降，這可能是氨基酸在茶葉發(fā)酵過(guò)程中自身發(fā)生氧化、通過(guò)Strecker降解與羰基化合物反應(yīng)，產(chǎn)生醛類化合物[25]。濃香烏龍茶中茶氨酸含量最低，是因?yàn)樵谧詈蟮母邷乇夯穑?0～100 ℃）工藝過(guò)程中，茶氨酸參與了美拉德反應(yīng)以及發(fā)生Strecker降解，進(jìn)一步與兒茶素類化合物結(jié)合形成EPSF類化合物[23,26]。

咖啡堿和可可堿是茶葉中最主要的嘌呤類生物堿，約占生物堿總含量的95%，同時(shí)也是茶葉中最重要的苦味成分[24]。綠茶中咖啡堿和可可堿含量最高，清香烏龍茶和紅茶次之，濃香烏龍茶中含量最低。研究表明咖啡堿和可可堿的含量與茶葉的苦味呈正相關(guān)[24]，因此，‘水仙’品種制成的綠茶可能會(huì)比相應(yīng)的濃香烏龍茶苦味更明顯。

2.2.2 兒茶素及EPSF類化合物

兒茶素屬于黃烷醇類化合物，是茶鮮葉中含量最豐富的多酚類物質(zhì)，占鮮葉干質(zhì)量的12%～24%，賦予茶葉良好的抗氧化、抗病毒、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)等多種健康功效[27-28]。目前，在茶葉中已鑒定的兒茶素主要包括EC、EGC、ECG和EGCG等。兒茶素以較強(qiáng)的抗氧化能力而受到廣泛關(guān)注；兒茶素在甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下可發(fā)生甲基化反應(yīng)，產(chǎn)生的甲基化兒茶素具有抗過(guò)敏、抗氧化、抗炎、降脂減肥、降血壓及預(yù)防心血管疾病等功效，可有效提高兒茶素的穩(wěn)定性和生物利用率，具有比母本化合物更強(qiáng)的生物活性[29-30]。在本研究中，大部分兒茶素化合物，包括C、EC、ECG、EGC、EGCG、ECG3”Me、EGCG3”Me、EGCG4”Me、表沒(méi)食子兒茶素3-香豆酸酯、表沒(méi)食子兒茶素3,5-雙沒(méi)食子酸酯等，在綠茶和清香烏龍茶中含量較高，在濃香烏龍茶和紅茶中較低。茶葉在發(fā)酵過(guò)程中，兒茶素類化合物在多酚氧化酶和過(guò)氧化物酶的作用下形成復(fù)雜的氧化聚合產(chǎn)物，因此，兒茶素的含量與茶葉的發(fā)酵程度呈負(fù)相關(guān)[28,31]。少部分兒茶素類如GC、GCG在濃香烏龍茶中的含量顯著高于其他茶樣，主要由于在濃香烏龍茶的高溫焙火過(guò)程中，表型兒茶素（如EGC、EGCG等）發(fā)生差向異構(gòu)化反應(yīng)，生成了非表型兒茶素（GC、GCG）[32]。

在茶葉加工過(guò)程中，茶氨酸可通過(guò)一系列Strecker降解和環(huán)化反應(yīng)形成1-乙基-5-羥基-2吡咯烷酮，進(jìn)一步在兒茶素的C6或C8位發(fā)生取代反應(yīng)，形成EPSF化合物[29]。有研究表明，EPSF類化合物可能具有抗心血管疾病及預(yù)防糖尿病發(fā)展的潛力[33-34]。本研究中，濃香烏龍茶中EPSF類化合物總量最高（（5.64±0.30）mg/g），紅茶（（1.81±0.15）m g/g）、清香烏龍茶次之（（1.46±0.09）mg/g），綠茶最低（（0.04±0.00）mg/g）（表1），主要原因可能是由于濃香烏龍茶在焙火過(guò)程中，高溫促進(jìn)了茶氨酸降解形成1-乙基-5-羥基-2吡咯烷酮，并與兒茶素反應(yīng)形成EPSF化合物[35]。

2.2.3 二聚兒茶素類化合物

在本研究中鑒定出具有顯著差異的二聚兒茶素類化合物包括原花青素類（原花青素B1、原花青素B2、原花青素B3、原花青素B5、原花青素C1）、茶黃素類（茶黃素、茶黃素-3,3’-雙沒(méi)食子酸酯、茶黃素-3’-沒(méi)食子酸酯、茶黃素-3-沒(méi)食子酸酯）、聚酯型兒茶素類（聚酯型兒茶素A、聚酯型兒茶素F）等（圖4）。紅茶加工過(guò)程中，鮮葉中兒茶素類成分發(fā)生酶促氧化反應(yīng)，生成的茶黃素類化合物具有抗菌、抗病毒、調(diào)節(jié)血脂等多種保健功能，并對(duì)紅茶的滋味和湯色品質(zhì)形成具有重要作用[36]。原花青素是一種天然抗氧化劑，可以清除體內(nèi)過(guò)多的自由基并抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的發(fā)生[37]。原花青素主要賦予茶葉澀味，它在酸性受熱條件下會(huì)分解成花青素，與茶黃素共同賦予了茶湯多樣的顏色，此外原花青素還會(huì)影響人體的唾液黏度，從而影響茶葉的滋味感官[38]。在本研究中，茶黃素類化合物在紅茶中含量最高，在其他茶中含量較低；原花青素類化合物在綠茶中的含量顯著高于其他茶中的含量（圖4）。

2.2.4 黃酮（醇）糖苷類化合物

茶葉中的黃酮類化合物主要以黃酮（醇）糖苷形式存在，約占茶葉干物質(zhì)的3%～4%，也是茶湯滋味中重要的苦澀味成分，呈味閾值較低，對(duì)咖啡堿的苦味具有增強(qiáng)作用[12,39]。有研究表明，黃酮（醇）糖苷類化合物具有抗炎、抗腫瘤、抗病毒、防止動(dòng)脈硬化等多種健康功效。茶葉中的黃酮（醇）糖苷按照苷元分類，主要包括槲皮素-3-O-糖苷、山柰酚-3-O-糖苷、楊梅素-3-O-糖苷、芹菜素-C-糖苷等[40-41]。在本研究中，經(jīng)鑒定篩選后得到黃酮（醇）糖苷類化合物共28 個(gè)，大部分槲皮素-3-O-糖苷在清香烏龍茶和濃香烏龍茶中含量高于綠茶和紅茶；大部分山柰酚糖苷在綠茶、清香烏龍茶和紅茶中含量較高，在濃香烏龍茶中含量較低；大部分芹菜素-C-糖苷在清香烏龍茶中含量最高，紅茶次之，在濃香烏龍茶和綠茶中含量較低；楊梅素-3-葡萄糖苷在清香和濃香烏龍茶中含量較高；楊梅素-3-半乳糖苷在清香烏龍茶中含量最高，綠茶次之，在濃香烏龍茶和紅茶最低。有研究表明，隨著茶葉發(fā)酵（酶促氧化反應(yīng)）程度的增加，黃酮（醇）糖苷的氧化程度加劇，但糖基和苷元結(jié)構(gòu)對(duì)黃酮（醇）糖苷的化學(xué)性質(zhì)和氧化轉(zhuǎn)化的影響尚不清楚，這可能是由于茶葉內(nèi)源性多酚氧化酶、過(guò)氧化物酶對(duì)不同苷元黃酮（醇）糖苷反應(yīng)活性不同[40,42-43]。Fang Zhoutao等[40]研究發(fā)現(xiàn)黃酮（醇）糖苷在綠茶殺青過(guò)程中較為穩(wěn)定，后續(xù)的加工步驟對(duì)黃酮（醇）糖苷變化影響也較小?？傮w來(lái)看，大部分黃酮（醇）糖苷在清香烏龍茶中含量較高，在濃香烏龍茶中含量較低，這可能導(dǎo)致由‘水仙’品種茶制成的濃香烏龍茶具有更低的苦澀味。

2.2.5 其他化合物

本研究中，大部分的脂類如甘油二酯、溶血磷脂酰膽堿在烏龍茶中含量較高，溶血磷脂酰膽堿在紅茶中含量最高（圖4），有研究表明，脂類與茶葉的鮮味呈正相關(guān)，表明‘水仙’品種茶制成的濃香烏龍茶和紅茶可能更加醇厚鮮香[15]。有機(jī)酸是茶葉中一種水溶性化合物，是茶葉香氣和滋味的重要成分之一，尤其對(duì)于酸味的形成具有重要作用[39,44]。大部分有機(jī)酸在濃香烏龍茶中含量較低，可能在濃香烏龍茶焙火過(guò)程中發(fā)生了降解反應(yīng)，導(dǎo)致含量降低。沒(méi)食子酸是茶葉中主要的酚酸類化合物，在紅茶中含量最高，濃香烏龍茶和清香烏龍茶中次之，在綠茶中最低，可能是由于酯型兒茶素在茶葉發(fā)酵過(guò)程中發(fā)生水解反應(yīng)生成沒(méi)食子酸[45]。

3 結(jié)論

本研究采用基于UPLC-Q-TOF/MS的代謝組學(xué)方法結(jié)合化合物絕對(duì)定量分析，對(duì)‘鐵觀音’和‘水仙’品種茶葉及‘水仙’品種制成的綠茶、清香烏龍茶、濃香烏龍茶、紅茶的化學(xué)成分及含量差異進(jìn)行比較分析。共鑒定出156 個(gè)化合物，包括兒茶素類、二聚兒茶素類、氨基酸類、生物堿類、酚酸類、有機(jī)酸類、香氣糖苷類、EPSF類、黃酮（醇）糖苷類、脂類和其他類化合物。通過(guò)OPLS-DA發(fā)現(xiàn)‘鐵觀音’和‘水仙’品種茶葉之間的化合物存在顯著差異，‘鐵觀音’品種茶葉含有更豐富的生物堿類和脂類化合物，‘水仙’品種茶葉中兒茶素類、黃酮（醇）糖苷類和EPSF類化合物含量較高。進(jìn)一步以‘水仙’茶為對(duì)象研究不同加工工藝對(duì)化學(xué)成分的影響，4 種茶在PLS-DA得分圖第1主成分上具有顯著分離的趨勢(shì)，對(duì)127 個(gè)顯著差異化合物進(jìn)行熱圖聚類分析，結(jié)果表明大部分兒茶素類、原花青素類、生物堿類及部分氨基酸類化合物在綠茶中的含量顯著高于其他茶葉；部分氨基酸類及黃酮（醇）糖苷類化合物在清香烏龍茶中含量相對(duì)較高；濃香烏龍茶中的EPSF類、部分黃酮（醇）糖苷及脂類化合物含量更高；而紅茶中則含有更豐富的茶黃素類化合物。本研究較為系統(tǒng)地闡明了茶樹(shù)品種及加工工藝對(duì)茶葉化學(xué)成分及品質(zhì)特征的影響，多角度揭示了茶葉代謝物的變化規(guī)律，可為消費(fèi)者合理、正確認(rèn)識(shí)茶產(chǎn)品提供理論依據(jù)和參考。