不同黃曲霉菌株強(qiáng)化發(fā)酵對(duì)瀏陽豆豉鮮味形成的影響

周 曉，李 跑，吳梓仟，唐 輝,2，徐巨才，蔣立文，覃業(yè)優(yōu)，劉 洋,

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.廣東省粵北食藥資源利用與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 韶關(guān) 512005；3.五邑大學(xué)藥學(xué)與食品工程學(xué)院，廣東 江門 529020；4.湖南壇壇香食品科技有限公司，湖南 長沙 410128）

豆豉是我國一種傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品，其中曲霉型豆豉是目前起源最早且分布最廣的豆豉之一，占據(jù)廣泛的消費(fèi)市場。瀏陽豆豉作為湖南省曲霉型豆豉的典型代表，在《中國實(shí)業(yè)志》上有記載，瀏陽豆豉自唐朝時(shí)期就因其獨(dú)特的鮮香滋味而聞名相傳[1]。瀏陽豆豉采用傳統(tǒng)古法工藝，用煮熟的黑豆進(jìn)行兩階段發(fā)酵（制曲和渥堆發(fā)酵）[2]。原料豆在微生物所產(chǎn)蛋白酶和自身生長代謝的作用下，將蛋白質(zhì)、碳水化合物等大分子物質(zhì)水解成小分子多肽和氨基酸，產(chǎn)生大量的風(fēng)味物質(zhì)。而微生物多樣性的差異是造成豆豉風(fēng)味差異的重要原因。然而，現(xiàn)階段瀏陽豆豉的工業(yè)化生產(chǎn)工藝尚未完善，多采用自然發(fā)酵（natural fermentation，NF）的方式進(jìn)行生產(chǎn)，群落結(jié)構(gòu)易受到環(huán)境、氣候等多方面的影響，導(dǎo)致其產(chǎn)品品質(zhì)穩(wěn)定性較差[3]。

近年來，多方研究表明，引入特定的微生物強(qiáng)化發(fā)酵進(jìn)行控制和干預(yù)，可以在實(shí)現(xiàn)模擬NF過程中多菌株共同發(fā)酵的同時(shí)有效抑制雜菌污染，從而提升產(chǎn)品的穩(wěn)定性[4]。吳梓仟等[5]利用從瀏陽豆豉中鑒定分離出來的兩株黃曲霉進(jìn)一步發(fā)酵瀏陽豆豉，發(fā)現(xiàn)強(qiáng)化發(fā)酵能促進(jìn)瀏陽豆豉的蛋白降解及有機(jī)酸的形成，最終改善其風(fēng)味。Chen Yufei等[6]利用黑豆和黑曲菌進(jìn)行固態(tài)強(qiáng)化發(fā)酵，結(jié)果表明強(qiáng)化發(fā)酵顯著提高了黑豆的氨基酸態(tài)氮含量。Wang Chuan等[7]利用具有高產(chǎn)蛋白酶活性的貝萊斯芽孢桿菌、腸球菌和布拉氏酵母菌3 株菌進(jìn)行混菌強(qiáng)化發(fā)酵，小肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)從4.48%增加至47.4%，豆粕的品質(zhì)顯著提升。目前國內(nèi)外對(duì)瀏陽豆豉系統(tǒng)的研究較少，且較多集中于其生產(chǎn)過程中優(yōu)勢(shì)微生物的分離鑒定和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的研究[8-11]，少有關(guān)于強(qiáng)化發(fā)酵對(duì)豆豉鮮味提升的調(diào)控作用研究。

本研究以陜西腎型小黑豆為原料，利用實(shí)驗(yàn)室前期從瀏陽豆豉中鑒定并分離純化出4 株不產(chǎn)毒的優(yōu)勢(shì)黃曲霉菌株[2]，采用NF、優(yōu)勢(shì)黃曲霉菌株（Aspergillus flavus7214、A.flavus7622、A.flavus6112、A.flavus5322）強(qiáng)化發(fā)酵以及混菌強(qiáng)化發(fā)酵（M4，A.flavus7214∶A.flavus7622∶A.flavus6112∶A.flavus5322＝1∶1∶1∶1）制備瀏陽豆豉。通過對(duì)比不同優(yōu)勢(shì)菌株的產(chǎn)蛋白酶能力及酶系組成特點(diǎn)，結(jié)合強(qiáng)化發(fā)酵豆豉與NF豆豉的氨基酸態(tài)氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)、水溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、感官評(píng)價(jià)以及肽組成情況，分析強(qiáng)化發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)降解規(guī)律，進(jìn)一步評(píng)價(jià)強(qiáng)化發(fā)酵菌株對(duì)瀏陽豆豉鮮味的影響機(jī)制，以期為瀏陽豆豉的品質(zhì)提升和工業(yè)化生產(chǎn)菌株的選育和開發(fā)提供一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

A.flavus7214、A.flavus5322由實(shí)驗(yàn)室從瀏陽豆豉分離純化所得；A.flavus6112、A.flavus7622 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；M4為將以上4 種黃曲霉等比例混合（1∶1∶1∶1）。

麩皮 山東祥瑞飼料廠；黑豆（陜西腎型小黑豆）湖南壇壇香食品科技有限公司。

氫氧化鈉、硼酸、甲醇、乙酸、考馬斯亮藍(lán)R-250、甲醛、丙酮、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、檸檬酸、亮氨酸、氯化鈉（均為分析純）國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；濃硫酸、濃鹽酸（均為分析純）成都市科隆化學(xué)品有限公司；味精、明礬（均為食品級(jí)）河南省利捷化工有限公司；苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）抑制劑、天冬氨酸蛋白酶（pepstatin A）抑制劑、半胱氨酸蛋白酶抑制劑E-64、氨肽酶抑制劑（bestatin）（均為分析純）上海碧云天生物技術(shù)有限公司；甘氨酸、十二烷基硫酸鈉、β-巰基乙醇、三羥甲基氨基甲烷、甘油、丙烯酰胺、過硫酸銨、四甲基乙二胺（均為電泳級(jí)）上海麥克林生化科技有限公司；Marker 26616（10～170 kDa）廣州賽國生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-50 KBS型立式高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；BD/BC-521DKM（E）轉(zhuǎn)換型冷藏冷凍箱合肥美的電冰箱有限公司；SPX-250B III型恒溫培養(yǎng)箱天津泰斯特儀器有限公司；DW-HL218型超低溫冷凍儲(chǔ)存箱 中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司；SHZ-82B水浴恒溫振蕩器 常州金南儀器制造有限公司；AUY220電子天平 日本島津科技有限公司；TS-5000Z電子舌日本Insent公司；Read Max 1900光吸收全波長酶標(biāo)儀上海閃譜生物科技有限公司；KDN-19Y凱氏定氮儀上海纖檢儀器有限公司；SW-CJ-1FD型無菌操作臺(tái)蘇州凈化設(shè)備有限公司；SHZ-82B水浴恒溫振蕩器常州金南儀器制造有限公司；HSS T3色譜柱 美國Waters公司；Ultimate3000-Q Exactive Orbitrap液相色譜-超高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國賽默飛世爾科技公司；SCIENTZ-10N冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；PHS-3C雷磁pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 瀏陽豆豉的制備

參照吳梓仟等[5]的方法。瀏陽豆豉生產(chǎn)工藝如圖1所示。

圖1 瀏陽豆豉生產(chǎn)工藝流程Fig.1 Flow chart for the production process of Liuyang Douchi

將不同豆豉同一批次生產(chǎn)過程中各個(gè)階段的樣品，采集后裝至已消毒的透明聚乙烯塑料袋中于－20 ℃凍庫冷藏。樣品采集完畢后，將其置于含有冰袋的泡沫采樣箱中低溫運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。樣品信息如表1所示。

表1 豆豉樣品信息Table 1 Sampling information of Douchi

1.3.2 蛋白酶活力測定

蛋白酶抑制劑制備參考Budak等[12]的方法并修改。制備蛋白酶抑制劑，確定PMSF、E-64和bestatin的最終濃度為5 mmol/L，pepstatin A和EDTA最終濃度為10 mmol/L。將5 μL蛋白酶抑制劑加入待測樣品中，并在室溫孵育40 min后進(jìn)行測定。蛋白酶活力測定參照GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》采用福林法測定，抑制率根據(jù)下式計(jì)算：

1.3.3 氨基酸態(tài)氮含量測定

參照GB 5009.235—2016《食品中氨基酸態(tài)氮的測定》，采用酸度計(jì)法測定氨基酸態(tài)氮含量。

1.3.4 水溶性蛋白質(zhì)含量測定

參照NY/T 1205—2006《大豆水溶性蛋白含量的測定》。

1.3.5 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）

參照張遠(yuǎn)紅等[13]的方法并修改。采用三氯乙酸-丙酮沉淀法提取豆豉樣品中的蛋白質(zhì)，凍干備用。取上述干燥樣品5 mg置于1.5 mL離心管中，加入100 μL 5×上樣緩沖液，振蕩30 s，靜置10 min。沸水浴加熱10 min后10000 r/min離心10 min，上清液即為樣液。采用SDSPAGE垂直板電泳不連續(xù)系統(tǒng)，分離膠和濃縮膠的體積分?jǐn)?shù)分別為15%和5%。上樣體積為8 μL，先恒壓70 V至樣品進(jìn)入分離膠，后切換電壓至100 V。電泳完成后，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%考馬斯亮藍(lán)R-250染色40 min，再用脫色液（5%（體積分?jǐn)?shù)，后同）甲醇、7%冰乙酸和88%去離子水）進(jìn)行脫色處理（24～48 h），并于凝膠成像系統(tǒng)上拍照記錄。

1.3.6 感官評(píng)價(jià)

1.3.6.1 感官評(píng)定

將豆豉粉與去離子水（1∶10，m/m）混合，在40 ℃下振蕩1.5 h，超聲提取1.5 h后，過濾，取上清液并于室溫條件下離心（10000 r/min，10 min），收集上清液即為豆豉水提取物。感官評(píng)估在（25±2）℃的感官評(píng)估室中進(jìn)行。使用9分制對(duì)樣品的豆豉水提物味道特征進(jìn)行評(píng)估。標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度-評(píng)分關(guān)系如表2所示。

表2 標(biāo)準(zhǔn)溶液評(píng)分Table 2 Criteria for sensory evaluation of standard solutions

1.3.6.2 電子舌

樣品前處理同1.3.6.1節(jié)，測試前，將豆豉水提取物的電導(dǎo)率調(diào)節(jié)至8.0～8.5 mS/cm。在所有膜的電位在標(biāo)準(zhǔn)味道溶液中穩(wěn)定后，開始測試。味覺傳感器和參比電極共清洗222 s，平衡30 s，每次樣品測試持續(xù)30 s，回味測試30 s，測試溫度控制在20 ℃左右。為確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)行4 次電子舌測試，取后3 組數(shù)據(jù)用于后續(xù)分析。電子舌傳感器對(duì)應(yīng)的基本味道及回味描述見表3。

表3 TS-5000Z電子舌的傳感陣列Table 3 Performance descriptions of sensor arrays of electronic tongue TS-5000Z

1.3.7 液相色譜-質(zhì)譜分析

液相色譜-質(zhì)譜分析參照蘇國萬等[14]的方法并加以修改。

樣品制備：準(zhǔn)確稱量0.02～2 mg樣品于2～5 mL 離心管中，加入1.5 mL超純水，過濾膜（0.22 μm）后于超高效液相色譜-電噴霧/四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用（ultra-high performance liquid chromatographyelectrospray/quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry，UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS）儀上分析檢測，進(jìn)樣蛋白質(zhì)量濃度為2 mg/mL。

液相色譜條件：色譜柱采用HSS T3色譜柱（1.0 mm×100 mm，1.7 μm），進(jìn)樣量1 μL，柱溫35 ℃，流速0.05 mL/min。流動(dòng)相由A液（0.1%的甲酸水溶液）和B液（乙腈）組成，洗脫程序：0～4 min，95% A、5% B；4～6 min，95%～90% A、5%～10% B；6～30 min，90%～60% A、10%～40% B；30～34 min，60%～10% A、40%～90% B；34～40 min，10% A、90% B；40～42 min，10%～95% A、90%～5% B；42～50 min，95% A、5% B。

質(zhì)譜條件：質(zhì)譜工作于full MS/DD-MS2模式（正離子采集）下，一級(jí)分辨率設(shè)置為35000，質(zhì)荷比范圍m/z100～1500，TopN設(shè)置為4，轟擊能量為梯級(jí)能量（20～40～60），二級(jí)分辨率設(shè)置為35000，動(dòng)態(tài)質(zhì)荷比采集范圍。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有測試均重復(fù)3 次，使用Origin 2021、SPSS Statistics 26和Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，使用OmicStudio工具（https://www.omicstudio.cn/tool）進(jìn)行相關(guān)性熱圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌株產(chǎn)蛋白酶特性分析

大豆含有約42%的蛋白質(zhì)，微生物產(chǎn)生的蛋白酶能催化蛋白質(zhì)水解生成多肽及小分子氨基酸，其活性也反映了豆豉中蛋白質(zhì)水解的速率，決定了豆豉發(fā)酵成熟的周期。有研究表明，曲霉是發(fā)酵食品中重要的蛋白酶來源之一，可促使發(fā)酵食品中的蛋白質(zhì)發(fā)生降解[15]。如圖2A所示，本實(shí)驗(yàn)所有菌株均表現(xiàn)出較強(qiáng)的產(chǎn)蛋白酶活性，其中A.flavus5322菌株活力最強(qiáng)，總蛋白酶活力為（4314.43±26.73）U/g，其次為M4（混菌），A.flavus7622最低，為（2516.62±67.39）U/g，且主要以堿性蛋白酶為主，但由于傳統(tǒng)曲霉型豆豉發(fā)酵過程為酸性環(huán)境[16]，堿性蛋白酶活力受到抑制，無法最大程度發(fā)揮效果。而從產(chǎn)酸性蛋白酶的分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，A.flavus5322能力顯著高于其余3 種菌及混菌。在曲霉屬中鑒定的大多數(shù)蛋白酶可分為以下幾種：絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、氨肽酶和金屬蛋白酶，各組主要的抑制劑分別為PMSF、E-64、pepstatin A、bestatin和EDTA[12]。圖2B結(jié)果表明，各菌株的蛋白酶主要受PMSF抑制劑的影響，且在A.flavus5322中表現(xiàn)最為強(qiáng)烈，抑制率高達(dá)33.79%。E-64、pepstatin A和bestatin的抑制率在所有樣品中普遍較低。EDTA的整體抑制效果較PMSF弱，但在不同菌株中檢測到的抑制活性差異較大，在M4（混菌）中表現(xiàn)出最高的抑制活性。表明4 株黃曲霉菌株中主要以絲氨酸蛋白酶為主，半胱氨酸蛋白酶占比最小。Budak等[12]研究了7 種曲霉的蛋白酶活力，也發(fā)現(xiàn)主要蛋白酶為絲氨酸蛋白酶，這與絲氨酸蛋白酶編碼基因是曲霉中最大的蛋白酶組分相關(guān)。EDTA的抑制效果可能源于其他類別蛋白酶的表達(dá)，同時(shí)也需要金屬離子存在[17-18]。

圖2 不同菌種關(guān)鍵酶活力分析Fig.2 Activities of key enzymes from different Aspergillus strains

2.2 不同菌種強(qiáng)化發(fā)酵豆豉可溶性蛋白質(zhì)和氨基酸態(tài)氮變化規(guī)律分析

蛋白質(zhì)是豆類及其制品的重要成分之一，同時(shí)也是食品中重要的營養(yǎng)評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)之一。如圖3A所示，強(qiáng)化發(fā)酵豆豉和NF豆豉可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化趨勢(shì)類似，制曲階段呈緩慢增長，洗霉（S8）工序引起可溶性蛋白質(zhì)流失，造成其質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降[19]。渥堆階段出現(xiàn)猛增，且在渥堆24 h（S9）達(dá)到最大值。而在渥堆48 h（S10）出現(xiàn)下降，可能隨著轉(zhuǎn)桶時(shí)食鹽的加入，滲透壓快速升高，豆豉中的酶系和微生物生長代謝均受到抑制，蛋白質(zhì)降解能力變?nèi)鮗20]，而微生物生長代謝所需的氮源消耗了之前累積的氨基酸及小肽，導(dǎo)致可溶性蛋白質(zhì)下降。其中，Q7214豆豉在S6（制曲第6天）降低了0.09%，這可能是不溶性大分子蛋白質(zhì)的分解速率低于其降解產(chǎn)物被微生物利用的速率，導(dǎo)致其質(zhì)量分?jǐn)?shù)減少[21]。渥堆結(jié)束后，5 種強(qiáng)化發(fā)酵豆豉的可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于NF豆豉（1.12%），其中QM4最高，達(dá)到1.62%，其次是Q5322（1.38%），說明強(qiáng)化發(fā)酵能在一定程度上增強(qiáng)蛋白質(zhì)的水解。

圖3 不同菌種強(qiáng)化發(fā)酵豆豉可溶性蛋白質(zhì)（A）和氨基酸態(tài)氮（B）變化規(guī)律Fig.3 Changes in water-soluble protein (A) and amino acid nitrogen content (B) in Liuyang Douchi fermented by different Aspergillus strains

蛋白質(zhì)在高溫、高濕的發(fā)酵環(huán)境中，可在微生物和蛋白酶的作用下被分解成肽和氨基酸，因此，氨基酸態(tài)氮常作為表征豆豉發(fā)酵成熟度的關(guān)鍵因子，反映蛋白質(zhì)的水解程度[22]。從圖3B可以看出，不同豆豉發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化趨勢(shì)和可溶性蛋白質(zhì)類似。在制曲階段（S1～S7）增加緩慢，洗霉階段的沖洗引起游離氨基酸和肽流失，因此，洗霉后（S8）樣品游離氨基酸態(tài)氮出現(xiàn)大幅度下降。在渥堆（S8～S10）期間，前24 h蛋白質(zhì)水解劇烈，導(dǎo)致其迅速上升，而隨著食鹽的添加，抑制了蛋白酶活性，且部分游離氨基酸參與了美拉德反應(yīng)，使得氨基酸態(tài)氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)增幅減弱，這和陳怡[23]的研究結(jié)果類似。通常，傳統(tǒng)的發(fā)酵豆豉產(chǎn)品含有超過0.2%的游離氨基酸態(tài)氮被認(rèn)為符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[24]。因此，本研究中5 種強(qiáng)化發(fā)酵豆豉氨基酸態(tài)氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)（1.11%（Q5322）～0.81%（Q7214））均大于NF豆豉，說明4 株菌株均適宜于豆豉的生產(chǎn)，且能促進(jìn)蛋白質(zhì)的水解。

2.3 不同菌種強(qiáng)化發(fā)酵豆豉SDS-PAGE變化分析

蛋白質(zhì)水解作用貫穿了豆豉發(fā)酵的全過程，選取豆豉生產(chǎn)過程中不同階段的樣品進(jìn)行電泳分析。從圖4可知，豆豉發(fā)酵過程中出現(xiàn)了大豆分離蛋白7S和11S組分的特征亞基條帶，即α、α’、β亞基及酸性亞基AS和堿性亞基BS[13]，5 種強(qiáng)化發(fā)酵豆豉中蛋白質(zhì)水解趨勢(shì)大體一致。前發(fā)酵階段（S1～S8）蛋白質(zhì)水解程度較弱，隨著后發(fā)酵進(jìn)行，分子質(zhì)量在35 kDa以上的條帶逐漸模糊，大豆蛋白7S組分和11S酸性亞基AS基本觀察不到，發(fā)酵結(jié)束后（S10）蛋白質(zhì)水解的最終產(chǎn)物的分子質(zhì)量主要集中在10～15 kDa之間，說明在后發(fā)酵階段開始，前發(fā)酵階段積累的蛋白酶開始發(fā)揮作用，大分子蛋白質(zhì)被迅速降解，生成小分子蛋白、多肽和氨基酸[25]，這與可溶性蛋白質(zhì)及氨基酸態(tài)氮分析結(jié)果相符合（圖3）。發(fā)酵結(jié)束后，堿性亞基BS并未消失，說明在大豆發(fā)酵過程中，由于兩種亞基結(jié)構(gòu)緊密性的差異，親水性酸性亞基比疏水性堿性亞基更容易降解[26]。同時(shí)，從圖中可以看出分子質(zhì)量在10 kDa區(qū)域的條帶存在明顯的陰影區(qū)，這可能是因?yàn)樾》肿拥鞍踪|(zhì)較多，且分子質(zhì)量相近，導(dǎo)致其難以區(qū)分。

圖4 不同菌種強(qiáng)化發(fā)酵豆豉發(fā)酵過程中SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of Liuyang Douchi fermented by different Aspergillus strains at different fermentation times

2.4 不同菌種強(qiáng)化發(fā)酵豆豉滋味評(píng)價(jià)分析

6 種豆豉樣品的感官評(píng)價(jià)結(jié)果如圖5A所示。所有樣品表現(xiàn)出較強(qiáng)的鮮味和咸味，酸味、苦味和澀味得分較低，但差異也較為明顯。強(qiáng)化發(fā)酵豆豉中，Q5322鮮味得分最高（7.1），其次是Q6112（7），其余3 種強(qiáng)化發(fā)酵豆豉均低于NF（6.9）。豆豉的鮮味主要來源于蛋白質(zhì)降解生成的鮮味氨基酸和鮮味肽，此結(jié)果說明菌株A.flavus5322和A.flavus6112強(qiáng)化發(fā)酵能促進(jìn)鮮味肽的生成。此外，Q5322咸度的增加能提升舌頭對(duì)鮮味的感知[27]，使得Q5322鮮味得分較高。豆豉的酸味來源于發(fā)酵過程中碳水化合物的降解[28]，QM4酸味得分最低，僅為3.3 分。而苦味可能源于大豆發(fā)酵過程蛋白質(zhì)和肽水解不平衡，導(dǎo)致酶水解產(chǎn)物中產(chǎn)生了苦味[29]，雖然苦味會(huì)造成豆豉味道欠佳，但適度的苦味可提升豆豉的鮮味[30]。除QM4和Q7214豆豉外，其余3 種強(qiáng)化發(fā)酵豆豉苦味相較于NF都出現(xiàn)不同程度的增強(qiáng)，其中Q5322最明顯，苦味評(píng)分增強(qiáng)了25%。曲霉型豆豉由于制曲過程中的分生孢子而具有一定的澀味[31]，5 種強(qiáng)化發(fā)酵豆豉的澀味評(píng)分均高于NF。

圖5 不同菌種強(qiáng)化發(fā)酵豆豉滋味評(píng)價(jià)Fig.5 Radar plots of the taste of Douchi fermented by different Aspergillus strains using sensory evaluation and electronic tongue analysis

電子舌結(jié)果表明，6 種豆豉整體風(fēng)味輪廓相似，酸味得分均低于標(biāo)樣味覺值（－0.17）（圖5B）。除Q53222以外，其余豆豉的咸味得分均低于標(biāo)準(zhǔn)溶液味覺值（－0.01）。從苦味來看，Q7622、Q7214、Q6112和QM4相較于NF豆豉都出現(xiàn)一定的增加，其中Q7622提升最為明顯，達(dá)16.49%。綜合來看，Q5322豆豉滋味最濃郁，表現(xiàn)為最強(qiáng)的鮮味、咸味和澀味，與感官評(píng)價(jià)結(jié)果一致；而其苦味得分最低，與感官評(píng)價(jià)結(jié)果相反，可能因?yàn)榕c鮮味-苦味在味覺受體水平上存在拮抗作用[32]，電子舌具有單獨(dú)的味覺傳感器，因此苦味評(píng)估不受其他風(fēng)味的影響。

2.5 強(qiáng)化發(fā)酵豆豉多肽組成

UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS包括超高壓液相色譜技術(shù)、電噴霧電離技術(shù)以及質(zhì)譜技術(shù)3 個(gè)部分，以其高通量和高分辨率為特征，通常被用作肽組學(xué)分析的工具。肽組學(xué)是一種計(jì)算和分析技術(shù)，屬于蛋白質(zhì)組學(xué)的一個(gè)分支和補(bǔ)充，可以對(duì)食品中復(fù)雜的肽組分進(jìn)行分類、篩選和鑒定[33]。通常，肽是發(fā)酵食品中重要的呈味物質(zhì)，而鮮味組分的分子質(zhì)量通常在500 Da以內(nèi)[15,34]。在本研究中，通過UPLC-QTOF-MS/MS從所有樣品中鑒定出131 條短肽（六肽及以下）。進(jìn)一步通過偏最小二乘判別分析（partial least squares-discrimination analysis，PLS-DA）建立能夠區(qū)分6 種豆豉的分類模型，以鑒定的肽強(qiáng)度作為X變量，將不同豆豉樣品作為Y變量，（1）為0.41，（2）為0.36，共同解釋量為0.77，表明該模型穩(wěn)定可靠，具有較強(qiáng)的預(yù)測能力[35]。圖6中可聚為3 組，分別為Q5322和NF豆豉、Q7622和Q7214豆豉以及QM4和Q6112豆豉，各組不同豆豉樣本之間距離較近，表明兩種豆豉在肽組成上相似。生產(chǎn)工藝的相似性可能是導(dǎo)致各組豆豉之間肽組成比較相近的原因。除Q5322強(qiáng)化發(fā)酵豆豉外，其余4 種強(qiáng)化發(fā)酵豆豉與NF豆豉之間都能實(shí)現(xiàn)良好區(qū)分，說明其在肽組成和含量上存在較大差異。

圖6 不同菌種強(qiáng)化發(fā)酵豆豉鮮味肽PLS-DAFig.6 PLS-DA of umami peptides in Douchi fermented by different Aspergillus strains

2.6 強(qiáng)化發(fā)酵豆豉潛在鮮味肽分析

為了更直觀呈現(xiàn)豆豉中多肽組成對(duì)豆豉風(fēng)味的影響，從已鑒定的6 種豆豉共有多肽中篩選出58 條肽（峰面積百分比＞0.1%）與滋味得分情況進(jìn)行相關(guān)性熱圖分析。如圖7A所示，部分多肽與感官鮮味表現(xiàn)出顯著相關(guān)性。其中WG和LD分別與感官鮮味呈最強(qiáng)的負(fù)相關(guān)和正相關(guān)，而與電子舌相關(guān)性分析可以看出，LM和AF表現(xiàn)為較強(qiáng)的負(fù)相關(guān)，GGL、NL和VN等8 條多肽呈明顯正相關(guān)。IGS、EK和LS則與感官鮮味和電子舌鮮味中均表現(xiàn)為正相關(guān)。EK在Noguchi等[36]的研究中已被證明具有鮮味。目前已鑒定的鮮味肽共有99 條，其中有83 條鮮味肽含有鮮味氨基酸[37]。一般情況下，鮮味氨基酸谷氨酸和天冬氨酸等對(duì)短肽的鮮味有重要貢獻(xiàn)[37-38]。本實(shí)驗(yàn)篩選出36 條含有已知鮮味肽或鮮味氨基酸的短肽及與鮮味呈顯著正相關(guān)的7 條潛在鮮味肽。

圖7 不同菌種強(qiáng)化發(fā)酵豆豉鮮味肽分析Fig.7 Analysis of umami peptides in Douchi fermented by different Aspergillus strains

從圖7B可知，Q6112和Q5322的潛在鮮味肽總峰面積接近，且明顯大于NF豆豉，Q 7214 最低。DL、SV、VS和LD在所有樣品中占比最大，且在6 種樣品中均大于10%（12.98%～15.75%）。韓富亮等[39]的研究證明，DL具有較強(qiáng)的鮮味，其閾值為2.5 mmol/L。已報(bào)道的鮮味肽中，除DL外，VD的相對(duì)峰面積在NF中占比達(dá)6.17%，在強(qiáng)化發(fā)酵豆豉中最高達(dá)10.76%（Q7622），最低為6.34%（QM4），EA、VDT、SVE和VG在5 種強(qiáng)化發(fā)酵豆豉中的相對(duì)峰面積相對(duì)于NF豆豉均出現(xiàn)了較大的提升。Azis等[40]通過對(duì)豆渣進(jìn)行強(qiáng)化發(fā)酵，也發(fā)現(xiàn)米曲霉發(fā)酵能提高蛋白質(zhì)含量、氨基氮含量和蛋白質(zhì)消化率，促進(jìn)發(fā)酵過程中小分子質(zhì)量肽和氨基酸的釋放。

3 結(jié)論

本研究以NF豆豉為對(duì)照，不同菌株強(qiáng)化發(fā)酵豆豉為實(shí)驗(yàn)組，采用理化分析、感官評(píng)定結(jié)合UPLC-ESIQ-TOF-MS/MS分析不同豆豉發(fā)酵過程中的蛋白質(zhì)降解情況和呈鮮特性差異，并通過相關(guān)性分析確定6 種豆豉中與鮮味相關(guān)的潛在鮮味肽。蛋白酶活力結(jié)果表明，A.flavus5322活力最強(qiáng)，其酸性蛋白酶活性遠(yuǎn)高于其余3 株菌及混菌，4 株黃曲霉菌株及混菌中的蛋白酶系均以絲氨酸蛋白酶為主。強(qiáng)化發(fā)酵豆豉的氨基酸態(tài)氮和水溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)在渥堆結(jié)束后均高于NF，說明強(qiáng)化發(fā)酵能在一定程度上促進(jìn)蛋白質(zhì)的降解，結(jié)合SDS-PAGE結(jié)果分析，6 種豆豉的蛋白質(zhì)降解趨勢(shì)一致，均在渥堆期迅速降解。感官評(píng)價(jià)和電子舌結(jié)果均表明A.flavus5322強(qiáng)化發(fā)酵豆豉具有最強(qiáng)的鮮味。利用UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS從Q7214、Q7622、Q6112、Q5322、QM4和NF豆豉中共鑒定出131 條短肽，通過相關(guān)性分析共篩選出43 條鮮味多肽，其中Q6112和Q5322潛在鮮味肽的總峰面積最高，且明顯大于NF，已報(bào)道的鮮味肽中，DL、VD、EA、VDT、SVE和VG在5 種強(qiáng)化發(fā)酵豆豉中的相對(duì)峰面積相較于NF豆豉均出現(xiàn)了較大的提升。綜上，強(qiáng)化發(fā)酵可通過促進(jìn)蛋白質(zhì)降解和潛在鮮味肽的釋放提升豆豉的鮮味，且A.flavus5322的效果顯著。本研究有助于進(jìn)一步解析強(qiáng)化發(fā)酵對(duì)瀏陽豆豉風(fēng)味的影響，為瀏陽豆豉的品質(zhì)提升和工業(yè)化生產(chǎn)菌株的選育提供理論支持。