氯化血紅素緩解水稻幼苗期NaCl脅迫的生理特性研究

孟楓巖 馮乃杰 鄭殿峰 郭佳寶 陳小鳳 江海龍 江雄輝

摘??要：鹽脅迫已成為全球范圍內(nèi)最普遍的非生物脅迫，嚴(yán)重影響作物的生長(zhǎng)。水稻作為重要的糧食作物，通過(guò)化控技術(shù)提高其耐鹽能力具有重要意義。為研究NaCl脅迫對(duì)水稻幼苗生長(zhǎng)和生理特性的影響及氯化血紅素（hemin）緩解NaCl脅迫調(diào)控機(jī)制，以黃華占和湘兩優(yōu)900為材料進(jìn)行盆栽試驗(yàn)，在水稻三葉一心期葉面噴施5?μmol/L?hemin，48?h進(jìn)行50?mmol/L?NaCl脅迫處理。每品種設(shè)置3個(gè)處理，分別為（1）CK：0?mmol/L?NaCl+噴施蒸餾水；（2）S處理：50?mmol/L?NaCl+噴施蒸餾水；（3）SH處理：50?mmol/L?NaCl+5?μmol/L?hemin；NaCl處理后3、6、9、12?d進(jìn)行取樣，測(cè)定水稻幼苗生長(zhǎng)參數(shù)、氣體交換參數(shù)及生理指標(biāo)。結(jié)果表明：NaCl脅迫下，2個(gè)水稻品種的幼苗生長(zhǎng)受阻，光合速率下降、活性氧激增?？寡趸富钚栽诿{迫前期與CK相比顯著增加，但隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活性較CK顯著下降。其中，NaCl脅迫對(duì)黃華占的抑制作用強(qiáng)于湘兩優(yōu)900。葉面噴施hemin增加2個(gè)水稻品種的株高、莖基寬、生物量、總根長(zhǎng)、根表面積、根體積和根尖數(shù)；增強(qiáng)水稻葉片SPAD和光合能力；減少活性氧（O2·?和H2O2）積累，降低丙二醛（MDA）含量和電解質(zhì)滲漏率（EL）；激活水稻葉片超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）和抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）活性及提高抗壞血酸（AsA）和可溶性蛋白含量。結(jié)果表明，NaCl脅迫對(duì)水稻幼苗產(chǎn)生抑制作用，葉面噴施hemin可通過(guò)提高凈光合速率、抗氧化物活性或含量，降低膜脂過(guò)氧化程度來(lái)緩解NaCl脅迫對(duì)水稻幼苗所造成的損傷。

關(guān)鍵詞：水稻幼苗；NaCl脅迫；氯化血紅素；形態(tài)建成；生理特性中圖分類號(hào)：S511??????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Hemin?Alleviating?the?Physiological?Characteristics?of?Rice?Seedling?in?NaCl?Stress

MENG?Fengyan1，2，?FENG?Naijie1，2，3*，?ZHENG?Dianfeng1，2，3*，?GUO?Jiabao1，?CHEN?Xiaofeng1，?JIANG?Hailong1，?JIANG?Xionghui1

1.?College?of?Coastal?Agricultural?Sciences，?Guangdong?Ocean?University，?Zhanjiang，?Guangdong?524088，?China;?2.?South?China?Center?of?National?Saline-Tolerant?Rice?Technology?Innovation?Center，?Zhanjiang，?Guangdong?524088，?China;?3.?Shenzhen?Research?Institute，?Guangdong?Ocean?University，?Shenzhen，?Guangdong?518108，?China

Abstract：?Salt?stress?is?the?most?prevalent?abiotic?stress?globally，?severely?affecting?crop?growth.?Rice?is?an?important?food?crop，?it?is?important?to?improve?the?salt?tolerance?of?rice?through?chemical?control?technology.?To?further?provide?the?theoretical?basis?for?the?application?of?hemin?to?rice?cultivation?under?salt?stress，?it?is?important?to?study?the?adverse?effects?of?NaCl?on?rice?seedling?growth?and?to?understand?how?hemin?regulating?the?physiological?process?to?alleviate?stress.?A?pot?experiment?was?carried?out?with?the?rice?varieties?Huanghuazhan?and?Xiangliangyou?900?as?the?materials.?During?the?three?leaves?and?one?heart?period，?after?48?hours?of?5?μmol/L?hemin?treatment，?50?mmol/L?NaCl?was?applied?to?the?corresponding?cultivated?soil.?Each?variety?had?three?treatments，?（1）?control?group：?distilled?water，?（2）?S?group：?50?mmol/L?NaCl?solution;?and?（3）?SH?group：?50?mmol/L?NaCl?+5?μmol/L?hemin?solution.?Measurements?of?seedlings?growth?characteristics，?gas?exchange?parameters，?and?physiological?indicators?were?taken?after?the?3rd，?6th，?9th?and?12nd?days?after?NaCl?treatment，?respectively.?NaCl?stress?inhibited?the?seedling?growth?of?the?two?rice?varieties，?reduced?the?photosynthetic?rate，?and?increased?reactive?oxygen?species.?Compared?with?CK，?the?antioxidant?enzymes?activities?of?S?group?increased?significantly?in?the?early?stage，?but?decreased?significantly?as?the?extension?of?stress?time.?Among?them，?the?inhibitory?effect?of?NaCl?stress?on?Huanghuazhan?was?stronger?than?that?of?Xiangliangyou?900.?Compared?with?NaCl?treatment，?exogenous?hemin?increased?plant?height，?stem?base?width，?biomass，?total?root?length，?root?surface?area，?root?volume，?and?root?tip?number?of?the?two?rice?varieties.?Hemin?inhibited?reactive?oxygen?species?（O2×??and?H2O2）?accumulation，?decreased?malondialdehyde?（MDA）?content，?and?electrolyte?leakage?（EL）.?The?photosynthetic?capacity?and?SPAD?were?enhanced.?The?activities?of?superoxide?dismutase?（SOD），?peroxidase?（POD），?catalase?（CAT），?and?ascorbate?peroxidase?（APX）?were?increased.?Meanwhile，?the?ascorbic?acid?（AsA）?and?soluble?protein?levels?were?up-regulated?in?leaves.?The?results?of?this?experiment?indicate?that?NaCl?stress?inhibit?rice?seedlings，?and?the?application?of?hemin?can?mitigate?the?damage?caused?by?NaCl?stress?on?rice?seedlings?by?enhancing?the?net?photosynthetic?rate，?increasing?antioxidant?activity?or?content，?and?reducing?membrane?lipid?peroxidation.

Keywords：?rice?seedings;?NaCl?stress;?hemin;?morphogenesis;?physiological?characteristics

DOI：?10.3969/j.issn.1000-2561.2024.02.017

近年來(lái)，由于高溫和干旱等極端天氣的增加和工業(yè)污染的排放，土壤鹽漬化程度逐漸加劇。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，世界范圍內(nèi)已有20%的農(nóng)田和近50%的耕地受到鹽漬化的影響，這嚴(yán)重限制了作物的生長(zhǎng)和產(chǎn)量[1-2]。我國(guó)沿海灘涂面積約2??106?hm2，其中濱海鹽漬土面積高達(dá)5×106?hm2，引起土地資源的浪費(fèi)和生態(tài)環(huán)境的惡化，產(chǎn)生重大經(jīng)濟(jì)損失。鹽脅迫對(duì)植物產(chǎn)生滲透脅迫、離子毒害和氧化損傷等多種傷害。首先，高濃度鹽導(dǎo)致土壤滲透勢(shì)降低，植物吸水困難，氣孔部分關(guān)閉，光合作用強(qiáng)度減弱，從而減緩植物生長(zhǎng)發(fā)育[3]。此外，鹽脅迫下，植物細(xì)胞活性氧激增，引發(fā)膜脂過(guò)氧化作用，細(xì)胞膜系統(tǒng)受損[4]。水稻（Oryza?sativa）作為一種中度鹽敏感作物，其幼苗期極易

受鹽脅迫影響，出現(xiàn)生長(zhǎng)受阻、老葉死亡和綠葉失綠等現(xiàn)象[5]。大量研究表明噴施植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑可有效提高水稻的耐鹽性。例如，外源海藻酸鈉寡糖（AOS）顯著增加鹽脅迫下水稻FL478和IP29幼苗的莖基寬和生物量[6]。外源鈣可改善鹽脅迫對(duì)水稻幼苗光合作用的損害，提高葉片葉綠素含量，增強(qiáng)抗氧化酶活性[7]。低濃度一氧化氮供體硝普鈉（SNP）能有效減少水稻幼苗葉片膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物的積累，提高抗氧化能力，增強(qiáng)抗鹽性[8]。向警等[9]研究表明褪黑素（MT）通過(guò)增加可溶性蛋白等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的表達(dá)量來(lái)緩解鹽脅迫對(duì)水稻糯稻89-1的抑制作用。

氯化血紅素（hemin）作為一種新型植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，由一分子亞鐵絡(luò)合原卟啉而成，是天然血紅素（heme）的體外基團(tuán)氯代物，其化學(xué)性質(zhì)與血紅素相似[10]，可協(xié)調(diào)植株地上部與地下部的生長(zhǎng)[11-12]。研究表明，hemin作為高效抗逆劑，可以有效緩解植物的重金屬、鹽堿、干旱等多種非生物脅迫[13-14]。外源hemin可緩解鹽脅迫對(duì)小麥葉片[15]的傷害和對(duì)大豆萌發(fā)率的抑制作用[16]。此外，hemin可提高鹽溶液下武育粳3號(hào)水稻種子的萌發(fā)率[17]。但目前有關(guān)hemin誘導(dǎo)苗期水稻抵御鹽脅迫的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。三葉一心期正值水稻移栽前的關(guān)鍵時(shí)期，采取化控技術(shù)提高秧田期水稻幼苗的抗逆性，對(duì)沿海灘涂地帶或鹽堿地種植水稻育苗移栽具有重要的意義。因此本研究以2個(gè)水稻品種黃華占和湘兩優(yōu)900為材料，研究三葉一心期葉面噴施hemin對(duì)鹽脅迫下水稻幼苗形態(tài)建成及生理代謝的影響，旨在揭示hemin增強(qiáng)水稻耐鹽性的作用機(jī)制，以期為鹽地水稻抗逆栽培提供理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。

1??材料與方法

1.1??材料

供試水稻品種為黃華占和湘兩優(yōu)900，由廣東海洋大學(xué)濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院種質(zhì)資源庫(kù)提供。供試調(diào)節(jié)劑為氯化血紅素（hemin），由上海長(zhǎng)得多農(nóng)業(yè)科技有限公司提供。試驗(yàn)用土為磚紅壤過(guò)篩后與沙子按照3∶1的比例混合而成。土壤理化性質(zhì)為：pH?7.02、有機(jī)質(zhì)3.52?g/kg、堿解氮1.26?mg/kg、速效磷2.62?mg/kg、速效鉀83.39?mg/kg。

1.2??方法

1.2.1??試驗(yàn)設(shè)計(jì)??盆栽試驗(yàn)于2021年在廣東海洋大學(xué)日光溫室中進(jìn)行。挑選飽滿完整的水稻種子，用3%過(guò)氧化氫消毒15?min后，用蒸餾水多次沖洗，直至徹底沖洗干凈，于30?℃黑暗條件下清水浸種和催芽各24?h。取露白一致的種子點(diǎn)播于規(guī)格為19?cm×?14?cm×17?cm的無(wú)孔塑料盆中，每盆裝入約3?kg試驗(yàn)用土，每盆65株。播種前1?d，按照每千克試驗(yàn)用土尿素0.07?g、氯化鉀0.0625?g和磷酸二銨0.1?g的比例，溶于清水中，每盆均澆灌800?mL。正常水分管理至幼苗生長(zhǎng)到三葉一心期，在晴天無(wú)風(fēng)的下午17：00左右，葉面噴施5?μmol/L?hemin（由預(yù)試驗(yàn)確定的最佳濃度），以噴施等量清水為對(duì)照，每片葉子的正反面濕潤(rùn)不流滴為宜。48?h時(shí)，每盆澆灌1?L濃度為50?mmol/L?NaCl溶液。之后模擬大田試驗(yàn)，再澆灌清水使每盆保持約2?cm的水層。每天利用土壤鹽度計(jì)（順科達(dá)TR-6D）實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)鹽分，維持鹽濃度在EC=（5.00±0.50）dS/m，相當(dāng)于（50±?0.50）mmol/L。試驗(yàn)采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，每個(gè)水稻品種分別設(shè)置3處理，每個(gè)處理35盆，即（1）CK：0?mmol/L?NaCl+噴施蒸餾水；（2）S處理：50?mmol/L?NaCl?+噴施蒸餾水；（3）SH處理：50?mmol/L?NaCl?+5?μmol/L?hemin，每個(gè)處理設(shè)置4次重復(fù)。在NaCl處理后3、6、9、12?d進(jìn)行取樣，生理指標(biāo)測(cè)定樣品用液氮速凍30?min，立即保存于?40?℃冰箱待測(cè)。

1.2.2??測(cè)定指標(biāo)與方法??（1）生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定。NaCl脅迫3、6、9、12?d，先用自來(lái)水清洗各處理的水稻幼苗，再用蒸餾水沖洗干凈，吸水紙吸干表面水分，將地上和地下部分開(kāi)，每處理選取代表群體幼苗20株。用直尺和游標(biāo)卡尺（0.1?mm）測(cè)定單株的株高、莖基寬，用電子天平（0.0001?g）稱量單株的地上部和地下部鮮重，隨后將水稻幼苗置于105?℃殺青30?min，80?℃烘干至恒重，測(cè)定地上干重和根干重，計(jì)算葉片的含水量。葉片含水量=（葉片鮮重-葉片干重）/葉片鮮重×100%。

（2）根系形態(tài)指標(biāo)測(cè)定。水稻幼苗根系用臺(tái)式掃描儀（Epson?CORP，?Japan）進(jìn)行掃描，并用WinRHIZO根系分析軟件（Regent?Instruments，?Quebec，?Canada）對(duì)圖像進(jìn)行分析計(jì)算，獲得根系總長(zhǎng)度、總根表面積、總根體積和總根尖數(shù)等相關(guān)指標(biāo)。

（3）SPAD值和氣體交換參數(shù)測(cè)定。NaCl脅迫3、6、9、12?d，用SPAD-502型葉綠素儀測(cè)定水稻倒二葉葉片的上、中、下3個(gè)部位的SPAD值，取平均值。同時(shí)用LI-6800便攜式光合測(cè)定系統(tǒng)在NaCl脅迫3、6、9?d上午9：00—11：30測(cè)定倒二葉葉片的氣體交換參數(shù)，包括凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、胞間CO2（Ci）和蒸騰速率（Tr）。光合有效輻射（PAR）為1000?μmol/（m2·s），葉室CO2濃度為400?μmol/mol，葉溫為26.0?℃。

（4）生理生化指標(biāo)測(cè)定。分別于NaCl脅迫后3、6、9、12?d進(jìn)行取樣，電解質(zhì)滲漏率（EL）測(cè)定參照AFSAR等[18]的方法。根據(jù)RASHEED等[19]描述的方法，采用硫代巴比妥酸法測(cè)定丙二醛（MDA）含量；過(guò)氧化氫（H2O2）含量參考TAHJIB-UL-?ARIF等[20]的方法，用紫外分光光度法測(cè)定；超氧陰離子（O2·?）染色參考董亞茹等[21]的方法?？寡趸富钚詤⒄铡吨参锷韺W(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》[22]測(cè)定，超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮藍(lán)四唑（NBT）顯色法測(cè)定；過(guò)氧化物酶（POD）測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法；抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）和過(guò)氧化氫酶（CAT）測(cè)定采用分光光度計(jì)法。還原型抗壞血酸（AsA）含量測(cè)定采用4，7-二苯基-1，10-菲咯啉顯色，采用考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定可溶性蛋白含量[23]。

1.3??數(shù)據(jù)處理

利用Excel?2019軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用SPSS?19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，3個(gè)處理平均值間的比較采用方差分析（ANOVA），多重比較采用鄧肯多重檢驗(yàn)（Duncans?Test），用Origin?2021軟件制圖。

2??結(jié)果與分析

2.1??外源hemin對(duì)NaCl脅迫下水稻幼苗生長(zhǎng)的影響

由表1和圖1可知，黃華占和湘兩優(yōu)900在NaCl脅迫后生長(zhǎng)受到抑制，各項(xiàng)形態(tài)指標(biāo)均顯著下降。NaCl脅迫處理3～12?d，與CK相比，黃華占S處理的莖基寬，顯著下降16.67%～20.00%，湘兩優(yōu)900?S處理的莖基寬顯著減少19.42%～?24.77%。在地下部鮮重和干重方面，黃華占S處理較CK分別顯著降低56.79%～59.44%和36.21%～54.45%，湘兩優(yōu)900?S處理的較CK分別顯著下降24.82%～30.68%和22.48%～38.69%。上述結(jié)果表明NaCl脅迫嚴(yán)重抑制水稻幼苗的生長(zhǎng)，且對(duì)黃華占地下部的抑制作用更強(qiáng)。NaCl脅迫下葉面噴施hemin能夠緩解NaCl脅迫對(duì)水稻幼苗生長(zhǎng)的毒害作用，黃華占和湘兩優(yōu)900的SH處理形態(tài)指標(biāo)在4個(gè)時(shí)間點(diǎn)均與S處理達(dá)到顯著差異水平。NaCl脅迫處理3～12?d，較S處理相比，黃華占SH處理的地上部鮮重和干重分別提高9.98%～39.49%和14.43%～30.96%，地下部鮮重和干重分別增加37.71%～55.50%和35.04%～?58.24%。湘兩優(yōu)900?SH處理與S處理相比地上部鮮重和干重分別提高17.99%～29.01%和17.37%～?26.02%，地下部鮮重和干重分別增加19.56%～?25.88%和12.29%～40.20%。上述結(jié)果說(shuō)明外源hemin可有效緩解NaCl脅迫對(duì)水稻幼苗生長(zhǎng)的抑制作用，且對(duì)黃華占的調(diào)控效果強(qiáng)于湘兩優(yōu)900。

由圖2可知，隨著NaCl脅迫時(shí)間的增加，黃華占和湘兩優(yōu)900的葉片含水量呈逐漸下降趨勢(shì)。NaCl脅迫3～12?d，黃華占S處理的葉片含水量較CK顯著下降6.74%～9.09%，湘兩優(yōu)900?S處理顯著減少5.78%～8.61%。NaCl脅迫下，葉面噴施hemin提高黃華占和湘兩優(yōu)900的葉片含水量。其中NaCl脅迫3～12?d時(shí)，黃華占SH處理比S處理顯著提高3.62%～4.30%，湘兩優(yōu)900?SH處理顯著增加3.26%～4.27%。表明葉面噴施外源

hemin使黃華占和湘兩優(yōu)900的葉片具有更高的

含水量。

2.2??外源hemin對(duì)NaCl脅迫下水稻根系生長(zhǎng)的影響

由表2可知，黃華占和湘兩優(yōu)900的S處理下根系總長(zhǎng)度、總根表面積、總根體積和總根尖數(shù)均顯著低于CK。NaCl脅迫3～12?d，黃華占?S處理的根系總長(zhǎng)度、總根表面積、總根體積和總根尖數(shù)分別較CK降低25.20%～34.17%、42.19%～?46.26%、34.59%～59.14%和37.15%～53.98%。湘兩優(yōu)900?S處理與CK相比分別下降22.47%～?30.80%、22.25%～28.69%、36.11%～49.51%和23.17%～43.15%。NaCl脅迫下葉面噴施hemin后，2個(gè)水稻品種的根系指標(biāo)在一定程度上得到提高，4個(gè)時(shí)間點(diǎn)SH處理均與S處理達(dá)到顯著差異。NaCl脅迫3～12?d，黃華占SH處理的根系總長(zhǎng)度、總根表面積、總根體積和總根尖數(shù)分別較S處理增加10.72%～35.29%、42.19%～46.26%、34.59%～?59.14%、37.51%～53.98%；湘兩優(yōu)900?SH處理分別提高22.47%～30.80%、22.25%～28.69%、38.60%～?49.51%、23.17%～43.15%?？梢?jiàn)，噴施外源hemin能夠正向調(diào)控NaCl脅迫下2個(gè)水稻品種的根系生長(zhǎng)，且對(duì)黃華占的調(diào)控效果強(qiáng)于湘兩優(yōu)900。

2.3??外源hemin對(duì)NaCl脅迫下水稻葉片SPAD值和氣體交換參數(shù)的影響

由圖3可知，NaCl脅迫下，黃華占和湘兩優(yōu)900的Pn、Gs、Ci、Tr和SPAD與CK相比顯著降低。具體表現(xiàn)為，NaCl脅迫3?d時(shí)，黃華占S處理的Pn、Gs、Ci和Tr較CK分別顯著下降22.04%、59.82%、32.12%和57.79%，湘兩優(yōu)900?S處理Pn顯著下降21.75%，其余指標(biāo)與CK相比略有增

加但差異不顯著；6?d時(shí)，黃華占S處理的Pn、Gs、Ci和Tr較CK分別顯著下降33.55%、76.97%、50.61%和70.97%，湘兩優(yōu)900?S處理分別顯著下降18.00%、63.18%、39.47%和61.38%；9?d時(shí)，黃華占S處理的Pn、Gs和Tr與CK相比分別顯著減少27.09%、38.64%和35.49%，湘兩優(yōu)900?S處理的Pn、Gs、Ci和Tr與CK相比分別顯著下降24.75%。58.50%、22.81%和54.39%。NaCl脅迫3～12?d，黃華占S處理的SPAD值較CK顯著減少15.56%～21.15%，湘兩優(yōu)900顯著減少16.29%～19.92%。外源噴施hemin可緩解NaCl脅迫對(duì)2個(gè)水稻品種光合作用的損傷。NaCl脅迫3?d，黃華占SH處理的Pn、Gs、Ci和Tr較S處理分別顯著提高21.06%、54.00%、20.80%和58.90%，湘兩優(yōu)900?SH處理Pn顯著提高13.29%。NaCl脅迫6?d時(shí)，黃華占SH處理的Pn、Gs、Ci和Tr較S處理分別增加35.67%、56.93%、21.10%和59.10%，湘兩優(yōu)900?SH處理的上述指標(biāo)分別增加13.88%、35.79%、8.79%和45.93%，但均無(wú)顯著性差異。NaCl脅迫9?d時(shí)，與CK相比，黃華占SH處理Pn、Gs和Tr分別增加13.97%、7.89%和5.91%，湘兩優(yōu)900?SH處理的Pn、Gs、Ci和Tr則分別提高23.29%、42.62%、8.50%和26.64%，但差異均不顯著。結(jié)果表明，脅迫前期（3?d），hemin對(duì)2個(gè)水稻品種光合的調(diào)控效果更為顯著，脅迫后期（6?d和9?d），hemin緩解效果并不顯著。NaCl脅迫3～12?d，2個(gè)水稻品種SH處理的SPAD值均得到顯著提高。黃華占增加10.78%～20.21%，湘兩優(yōu)900增加8.36%～12.88%。

2.4??外源hemin對(duì)NaCl脅迫下水稻葉片膜損傷和ROS積累的影響

NaCl脅迫下，2個(gè)水稻品種的葉片EL、MDA含量和H2O2含量隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而增加（圖4）。在NaCl脅迫3～12?d時(shí)，黃華占?S處理的EL、MDA和H2O2含量較CK相比分別顯著提高28.80%～68.45%、45.04%～156.80%、10.66%～?51.34%，湘兩優(yōu)900?S處理分別顯著增加36.28%～?59.51%、45.88%～84.57%和14.96%～31.93%。說(shuō)明NaCl脅迫使水稻葉片中的ROS大量積累，破壞細(xì)胞膜系統(tǒng)的穩(wěn)定。通過(guò)對(duì)水稻葉片進(jìn)行O2·??染色發(fā)現(xiàn)（圖5），與CK相比，黃華占和湘兩優(yōu)900?S處理的水稻葉片藍(lán)色斑點(diǎn)明顯增多。表明NaCl脅迫破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，使水稻細(xì)胞產(chǎn)生大量的O2·?。葉面噴施hemin后，可在一定程度上緩解2個(gè)水稻品種的膜損傷和ROS積累，但含量仍顯著高于CK。在NaCl脅迫3～12?d時(shí)，黃華占SH處理的EL、MDA和H2O2含量較S相比分別顯著下降11.67%～16.73%、17.74%～41.83%和8.93%～17.99%，湘兩優(yōu)900?SH處理顯著減少5.78%～9.17%、17.19%～31.25%和4.04%～15.90%。此外，黃華占和湘兩優(yōu)900?SH處理的O2·?染色與S處理相比葉片藍(lán)色斑點(diǎn)明顯減少。這些結(jié)果表明外源添加hemin后，顯著減少水稻葉片ROS的積累，維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，且hemin對(duì)黃華占的調(diào)控效果強(qiáng)于湘兩優(yōu)900。

2.5??外源hemin對(duì)NaCl脅迫下水稻葉片抗氧化物質(zhì)的影響

由圖6可知，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，黃華占和湘兩優(yōu)900的抗氧化酶活性在前期與CK相比顯著提高，末期則顯著下降。黃華占S處理的SOD、POD、CAT和APX活性分別在3～6?d、3～6?d、3～9?d和3～9?d顯著高于CK，12?d時(shí)上述酶活性均顯著低于CK。湘兩優(yōu)900?S處理的SOD、POD、CAT和APX分別在3?d、3～9?d、3～12?d和3～9?d

顯著高于CK，SOD在9～12?d、POD和APX在12?d時(shí)顯著低于CK。以上結(jié)果表明面對(duì)外界環(huán)境的脅迫，植物先產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，而后隨著脅迫時(shí)間的增加，植物的抗氧化酶系統(tǒng)遭到破壞。葉面噴施hemin處理進(jìn)一步提高2種水稻葉片的抗氧化酶活性，其中黃華占SH處理較S處理的SOD活性在3～12?d顯著上升3.37%～13.87%；POD活性在3～9?d時(shí)顯著增加8.92%～18.46%，12?d時(shí)增加24.57%，但差異不顯著；CAT活性在3、6?d時(shí)分別提高9.73%和6.57%；APX活性在3～12?d顯著上升14.34%～27.70%。湘兩優(yōu)900?SH處理較S處理的SOD活性在3～12?d上升3.53%～15.38%；POD活性在3、9?d時(shí)分別顯著增加6.99%和3.92%；CAT活性在3、9、12?d時(shí)分別顯著提高7.17%、9.81%和4.89%；APX活性在3～9?d顯著上升14.94%～21.20%。說(shuō)明hemin能夠增強(qiáng)NaCl脅迫下黃華占和湘兩優(yōu)900水稻幼苗的抗氧化酶活性，從而提高其抗氧化能力。

NaCl脅迫對(duì)2個(gè)水稻品種的非酶抗氧化劑AsA含量產(chǎn)生不同的影響（圖6）。NaCl脅迫3～?12?d時(shí)，黃華占?S處理的AsA含量顯著低于CK。湘兩優(yōu)900?S處理的AsA含量在NaCl脅迫3?d顯著高于CK，在NaCl脅迫6、9、12?d時(shí)則顯著低于CK。結(jié)果顯示，與黃華占相比，湘兩優(yōu)900自身的抗氧化系統(tǒng)在NaCl脅迫時(shí)發(fā)揮一定作用。NaCl脅迫3、6、9、12?d，黃華占S處理的AsA含量較CK顯著減少29.93%、34.91%、25.62%和29.94%。NaCl脅迫6、9、12?d，湘兩優(yōu)900?S處理較CK分別下降39.04%、42.70%和39.88%。經(jīng)hemin處理后，黃華占和湘兩優(yōu)900的AsA含量得到進(jìn)一步的提高。NaCl脅迫3、6、9?d時(shí)，黃華占SH處理較S處理分別顯著提高27.97%、11.73%和11.67%，湘兩優(yōu)900?SH處理分別顯著提高7.81%、33%和36.52%。而NaCl脅迫12?d

時(shí)，黃華占和湘兩優(yōu)900的SH處理AsA含量較S處理分別增加2.57%和30.77%，但均未達(dá)到顯著水平?？梢?jiàn)，hemin可以提高AsA含量，促進(jìn)水稻葉片清除ROS。

2.6??外源hemin對(duì)NaCl脅迫下水稻葉片可溶性蛋白含量的影響

由圖7可知，NaCl脅迫下，黃華占和湘兩優(yōu)900?S處理的可溶性蛋白含量呈先上升后下降的趨勢(shì)。NaCl脅迫3、6?d時(shí)，黃華占S處理的可溶性蛋白含量較CK處理分別顯著提高2.01%和1.15%，在NaCl脅迫9?d時(shí)含量增加但不顯著，而12?d時(shí)，其含量顯著降低2.21%。在NaCl脅迫3、6?d時(shí)，湘兩優(yōu)900?S處理組與CK相比，可溶性蛋白含量顯著提高5.14%和4.82%，脅迫9、12?d時(shí)，其含量與CK相比無(wú)顯著差異。外源添加hemin后，有效增加2個(gè)水稻品種葉片的可溶性蛋白含量。NaCl脅迫3～12?d，黃華占SH處理顯著增加0.97%～2.72%，湘兩優(yōu)900?SH處理組顯著增加1.94%～7.59%。上述結(jié)果表明，hemin促進(jìn)水稻葉片滲透調(diào)劑物質(zhì)的產(chǎn)生，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。

2.7??黃華占和湘兩優(yōu)900各指標(biāo)間的相關(guān)性分析

由圖8可知，黃華占的形態(tài)指標(biāo)（株高、莖基寬、地上部干/鮮重、地下部干/鮮重及含水量）與

光合指標(biāo)（Pn、Gs、Ci及Tr）、SPAD值和AsA含量均呈顯著或極顯著正相關(guān)，與MDA含量和電解質(zhì)滲漏率呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)。根系指標(biāo)（根長(zhǎng)、根表面積、根體積及根尖數(shù)）與形態(tài)指標(biāo)具有相同規(guī)律，即與光合指標(biāo)、SPAD值和AsA含量呈顯著或極顯著正相關(guān)，與MDA含量和電解質(zhì)滲漏率呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)。MDA含量與POD活性及AsA含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，H2O2含量與SOD、POD?活性、及AsA含量呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)。

由圖9可知，湘兩優(yōu)900形態(tài)指標(biāo)（株高、莖基寬、地上部干/鮮重、地下部干/鮮重及含水量）和根系指標(biāo)均與SPAD值呈極顯著正相關(guān)，均與電解質(zhì)滲漏率、MDA及H2O2含量呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)。光合指標(biāo)Pn與莖基寬、地上鮮/干重、地下鮮重、葉片含水量、根長(zhǎng)、根表面積及根尖數(shù)呈顯著或極顯著正相關(guān)，Gs與株高、莖基寬、地上鮮/干重、葉片含水量及根長(zhǎng)呈顯著或極顯著正相關(guān)，而與其他形態(tài)和根系指標(biāo)呈正相關(guān)但不顯著。MDA含量與SOD活性和AsA含量呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)，電解質(zhì)滲漏率與POD及APX活性呈顯著正相關(guān)，H2O2含量與SOD、POD及CAT活性呈顯著或極顯著正相關(guān)。

由此可見(jiàn)，2個(gè)水稻品種在形態(tài)和根系參數(shù)方面均與電解質(zhì)滲漏率及MDA含量呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)，表明NaCl脅迫加深水稻葉片膜脂過(guò)氧化程度，抑制植株正常生長(zhǎng)。但對(duì)于氣體交換參數(shù)來(lái)說(shuō)，黃華占的Pn、Gs、Ci和Tr均與形態(tài)和根系指標(biāo)呈顯著或極顯著正相關(guān)。表明光合作用促進(jìn)地上部葉片的生長(zhǎng)，進(jìn)而促進(jìn)地下部根系的生長(zhǎng)。湘兩優(yōu)900則只有Pn和Gs與部分形態(tài)和根系指標(biāo)呈顯著或極顯著正相關(guān)。

3??討論

3.1??外源hemin對(duì)NaCl脅迫下水稻植株形態(tài)建成的影響

相關(guān)研究曾指出鹽脅迫抑制水稻幼苗的正常生長(zhǎng)，具體表現(xiàn)為葉片面積減小、株高降低和生物量積累減少[23]。根是最先遭受鹽脅迫的器官。LI等[24]指出根系具有靈活性和可塑性，能夠及時(shí)調(diào)整形態(tài)以減少對(duì)有毒離子的吸收。本研究中，NaCl脅迫顯著降低黃華占和湘兩優(yōu)900的株高和生物量，且對(duì)2種水稻根系指標(biāo)均達(dá)到顯著抑制作用。這可能是由于鹽脅迫產(chǎn)生滲透脅迫，干擾植物正常代謝過(guò)程，導(dǎo)致細(xì)胞吸水受阻，葉片相對(duì)含水量降低，生長(zhǎng)延緩，生物量積累減少[25]。葉面噴施hemin有效緩解鹽脅迫對(duì)水稻生長(zhǎng)的抑制作用，株高、莖基寬、生物量等指標(biāo)均有不同程度的提高；同時(shí)，能夠使葉片維持較高水平的含水量。這與HUANG等[26]研究hemin可阻止小麥幼苗在鹽脅迫下干重的減少和水分的流失等結(jié)果一致。此外，hemin明顯改善NaCl脅迫對(duì)水稻根系生長(zhǎng)的不利影響。根據(jù)前人研究可知，hemin作為血紅素加氧酶-1（HO-1）的底物和促進(jìn)劑，能夠提高該酶活性。HO-1可作為一氧化氮（NO）下游信號(hào)分子來(lái)激活細(xì)胞循環(huán)基因，參與到番茄側(cè)根的形成過(guò)程中[27]。另外，hemin在植物體內(nèi)被降解，產(chǎn)生一氧化碳（CO）。CO可提高小麥[28]和油菜[29]的耐鹽性，解除對(duì)根系細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。推測(cè)本研究中hemin緩解鹽脅迫對(duì)水稻幼苗的傷害可能有2種方式，一種是通過(guò)自身催化HO-1表達(dá)，另一種是分解產(chǎn)生CO，其內(nèi)在機(jī)理有待于進(jìn)一步研究。

3.2??外源hemin對(duì)NaCl脅迫下水稻SPAD值和氣體交換參數(shù)的影響

鹽脅迫下，植物葉綠素含量下降，光合作用受阻[30-31]。本研究發(fā)現(xiàn)，NaCl脅迫3～12?d，2個(gè)水稻品種的SPAD值顯著減小，主要是鹽脅迫提高植物體內(nèi)葉綠素酶活性，加速葉綠素降解并阻礙其生物合成。NaCl脅迫3、6、9?d，黃華占葉片的Ci和Gs同時(shí)下降；NaCl脅迫6、9?d，湘兩優(yōu)900的Ci和Gs均下降。說(shuō)明鹽脅迫下黃華占和湘兩優(yōu)900光合速率的降低主要是由氣孔限制。外源使用hemin提高SPAD值，這可能是hemin調(diào)節(jié)葉綠素生物合成相關(guān)酶的活性和促進(jìn)血紅素加氧酶1對(duì)光敏色素發(fā)色團(tuán)的保護(hù)作用[32-33]。黃華占和湘兩優(yōu)900經(jīng)hemin處理后Pn、Ci、Gs和Tr均顯著提高，表明hemin有效緩解NaCl脅迫對(duì)水稻氣孔限制的原因可能是維持較高水平的Gs和Tr。Gs的增加有利于CO2進(jìn)入植物體內(nèi)進(jìn)行氣體交換，促進(jìn)碳同化；Tr的提高增強(qiáng)植物吸水及運(yùn)輸?shù)哪芰?，有利于光合作用的進(jìn)行，這與前人的研究結(jié)果相一致[34-35]。此外，張春平等[36]研究發(fā)現(xiàn)，血紅素處理提高NaCl脅迫下黃連幼苗的Gs并降低Ci，但在本研究中hemin提高水稻幼苗的Ci和Gs，推測(cè)可能跟作物種類、脅迫程度和時(shí)間有關(guān)，相關(guān)具體原因仍需進(jìn)一步研究。

相關(guān)性分析顯示，2個(gè)水稻品種的SPAD值與氣體交換參數(shù)呈顯著或極顯著正相關(guān)，表明SPAD值的提高，有利于水稻葉片進(jìn)行光合作用。這些結(jié)果說(shuō)明hemin可能通過(guò)保護(hù)葉片的光合活性及增加SPAD值，保證水稻在NaCl脅迫下具有較高的光合作用。但關(guān)于hemin是如何調(diào)控NaCl脅迫下水稻幼苗葉綠素含量和光合作用的具體原因仍需進(jìn)一步研究。

3.3??外源hemin對(duì)NaCl脅迫下水稻葉片膜損傷和抗氧化系統(tǒng)的影響

植物在正常生長(zhǎng)狀態(tài)下，體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除處于動(dòng)態(tài)平衡。NaCl脅迫下，植物產(chǎn)生過(guò)量的活性氧，引起MDA等膜脂過(guò)氧化物的積累，破壞細(xì)胞膜的完整性，最終導(dǎo)致生理代謝紊亂，抑制植物生長(zhǎng)[37]。本研究中，與CK相比，隨著NaCl脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，2個(gè)水稻品種S處理的電解質(zhì)滲漏率、MDA和H2O2含量呈上升趨勢(shì)且O2·?染色藍(lán)色斑點(diǎn)數(shù)量增加。同時(shí)，S處理的SOD、POD、CAT和APX活性呈先升后降的趨勢(shì)。黃華占S處理的AsA含量均顯著低于CK，而湘兩優(yōu)900?S處理的AsA含量在3?d時(shí)顯著高于CK，6、9、12?d時(shí)顯著低于CK。這表明短時(shí)期鹽脅迫下，水稻通過(guò)抗氧化防御系統(tǒng)去除活性氧，緩解水稻鹽害損傷；長(zhǎng)期鹽脅迫使水稻積累更多活性氧物質(zhì)，抗氧化系統(tǒng)遭到破壞，無(wú)法緩解脅迫帶來(lái)的氧化損傷，這些與VAIDYANATHAN等[38]和龐春花等[39]的研究相似。葉面噴施hemin后，黃華占和湘兩優(yōu)900?SH處理的抗氧化酶（SOD、POD、CAT和APX）活性和AsA含量均較S處理顯著增加，而電解質(zhì)滲漏率、MDA和H2O2含量保持較低水平，O2·?染色斑點(diǎn)減少。前人研究報(bào)道hemin減少相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量，提高相關(guān)抗氧化酶活性，且上調(diào)NtGSH1基因的表達(dá)，調(diào)控GSH的合成，保護(hù)堿脅迫下煙草細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性[40]。CUI等[41]發(fā)現(xiàn)hemin降低硫代巴比妥酸（TBARS）含量，調(diào)節(jié)APX、SOD、POD活性及AsA和GSH含量，緩解由Cd導(dǎo)致紫花苜蓿的氧化損傷。上述結(jié)果均說(shuō)明hemin減少活性氧積累、激活抗氧化酶活性和增加非酶抗氧化劑含量，有效提高植物的抗逆性，但有關(guān)hemin如何調(diào)控其他抗氧化酶活性和GSH等抗氧化劑含量還有待進(jìn)一步探索。

相關(guān)性分析表明，黃華占SOD活性與H2O2含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，POD活性與H2O2和MDA含量均呈極顯著負(fù)相關(guān)。AsA含量與電解質(zhì)滲漏率、MDA和H2O2含量均呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)。推測(cè)NaCl脅迫下，黃華占體內(nèi)的AsA含量、SOD和POD活性不能清除過(guò)量的活性氧，需要靠hemin的調(diào)控作用緩解氧化脅迫。湘兩優(yōu)900的POD和APX活性均與電解質(zhì)滲漏率呈顯著或極顯著正相關(guān)，SOD、POD及CAT活性與H2O2含量均呈顯著或極顯著正相關(guān)，而AsA含量與電解質(zhì)滲漏率及MDA含量呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)?？赡苁窍鎯蓛?yōu)900在受到NaCl脅迫時(shí)，通過(guò)增強(qiáng)自身抗氧化酶活性，減輕膜脂過(guò)氧化程度，從而維持細(xì)胞膜的完整性。

3.4??外源hemin對(duì)NaCl脅迫下水稻可溶性蛋白的影響

植物通過(guò)增加滲透物質(zhì)含量以抵御鹽脅迫的傷害[42]，可溶性蛋白作為一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，具有較強(qiáng)的親水性，可增強(qiáng)植物細(xì)胞保水能力[43]。本研究中，NaCl脅迫下，水稻葉片中可溶性蛋白含量顯著增加，可能是鹽脅迫導(dǎo)致幼苗體內(nèi)Na+和Cl-激增，細(xì)胞內(nèi)外離子濃度失衡，引起滲透脅迫，而幼苗通過(guò)提高滲透物質(zhì)（可溶性蛋白）的含量來(lái)降低鹽脅迫帶來(lái)的滲透損傷。隨著鹽脅迫時(shí)間的增加，蛋白含量下降。根據(jù)前人研究，推測(cè)植物受到脅迫后蛋白質(zhì)合成受阻或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)被破壞而降解[44]，產(chǎn)生大量的游離氨基酸。噴施外源hemin有效提高2個(gè)水稻品種的可溶性蛋白含量，有助于細(xì)胞吸收外部環(huán)境中的水分，從而減輕NaCl脅迫帶來(lái)的傷害。劉紫薇等[45]研究指出hemin可提高有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)（可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸等）含量及無(wú)機(jī)離子K+、Ca2+和Mg2+的吸收，降低體內(nèi)Na+的積累，從而誘導(dǎo)煙草植株抵御堿脅迫。然而，本研究只表明施用外源hemin可提高可溶性蛋白含量，對(duì)于可溶性糖、脯氨酸、K+和Ca2+等其他滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的調(diào)控作用目前正在研究中，相關(guān)機(jī)制將在后續(xù)發(fā)表的論文中深入研究和分析。

4??結(jié)論

鹽脅迫顯著抑制水稻幼苗生長(zhǎng)，造成ROS代謝紊亂，增加膜脂過(guò)氧化程度。葉面噴施hemin通過(guò)增強(qiáng)凈光合速率，增加生物量的積累，激活抗氧化酶（SOD、POD、CAT、APX）活性和促進(jìn)滲透物質(zhì)的積累緩解由鹽脅迫造成的損傷。本研究結(jié)果為外源hemin提高水稻幼苗抗逆性及鹽堿地種植水稻提供技術(shù)指導(dǎo)和理論依據(jù)。

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