豐富環(huán)境訓(xùn)練結(jié)合頭穴叢刺對孤獨癥譜系障礙模型大鼠行為的影響

穆姿辰， 唐強， 史云秋， 王艷， 朱淑偉， 莊亞楠， 徐丹雙， 李宏玉， 李保龍,，張春艷,， 袁孟珂

1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱市 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江哈爾濱市 150001

0 引言

近年來，孤獨癥譜系障礙(autism spectrum disorder, ASD)發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢。美國疾病預(yù)防控制中心最新研究顯示，美國8 歲兒童ASD 患病率已達到1/36[1]。

ASD 起病于嬰幼兒時期，以社交溝通和社交互動障礙，行為、興趣或活動模式重復(fù)、受限等異常行為為特征[2]，重復(fù)刻板行為和/或興趣狹窄是其核心癥狀[3]。其病因和病理機制仍未明確，也尚未有療效確切的治療方法[4]。對ASD 患兒社交能力和異常行為的改善有助于其參與社會生活，提升生活質(zhì)量。

目前ASD異常行為模式的干預(yù)方法多采用感知治療、行為分析、音樂療法等一種或多種療法相結(jié)合的方式。豐富環(huán)境集觸覺、視覺、聽覺、運動和空間位置覺于一體，能夠改善ASD大鼠的社交能力，減少刻板行為[5]。

針灸尤其是頭穴叢刺一直被廣泛用于腦血管疾病的治療中[6]，近年來也逐漸被應(yīng)用到抑郁、ASD 等疾病治療中[7]。

有研究表明，ASD 患兒的社交能力和情緒變化與白細(xì)胞介素(interleukin, IL)-6、IL-1β密切相關(guān)[8]。

本研究觀察豐富環(huán)境訓(xùn)練結(jié)合頭穴叢刺對ASD大鼠行為學(xué)癥狀及炎性因子的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取SPF 級健康成年Wistar 大鼠，其中雌性16只，體質(zhì)量(250±10) g，雄性8只，體質(zhì)量(290±10) g，均購于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心(批號20210321)，實驗動物使用許可證號SYXK(黑)2020-004。大鼠飼養(yǎng)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)腦功能與神經(jīng)康復(fù)實驗室。飼養(yǎng)環(huán)境保持溫度(22±2) ℃，濕度(50±10)%，自然晝夜節(jié)律變化光照，國家標(biāo)準(zhǔn)大鼠生長繁殖飼料飼養(yǎng)，自由飲用食水。本研究對動物的處理嚴(yán)格遵守《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》。

1.2 模型制備及分組

適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，當(dāng)日20:00 按雌雄比2∶1 進行合籠，次日晨8:00 進行陰道涂片，顯微鏡下觀察是否受精，將母鼠受精的當(dāng)天記為妊娠第0.5 天。將受孕母鼠隨機分為對照組母鼠(n= 2)和實驗組母鼠(n=6)，參考Schneider 等[9]的方法建立動物實驗?zāi)Ｐ?。實驗組在妊娠第12.5 天時腹腔注射丙戊酸鈉(valproic acid, VPA) 600 mg/kg，按250 mg/mL 溶解于0.9%氯化鈉溶液，對照組孕鼠同等時間注射同等劑量的氯化鈉溶液。子鼠出生當(dāng)天記為1 d，選取雄性子鼠于生后7～21 d 持續(xù)進行生長發(fā)育學(xué)測試，評估造模是否成功。實驗組母鼠產(chǎn)下雄性后代即為孤獨癥行為異常模型鼠，隨機選出24 只分為模型組(n= 6)、豐富環(huán)境組(n= 6)、頭穴叢刺組(n= 6)和豐富環(huán)境結(jié)合頭穴叢刺組(n= 6)。對照組母鼠產(chǎn)下雄性后代即為正常大鼠，隨機選出6只作為對照組。

1.3 主要儀器和試劑

行為學(xué)檢測系統(tǒng)：Smart 3.0 行為學(xué)分析軟件。行為學(xué)檢測箱：哈爾濱道外區(qū)宏大有機玻璃經(jīng)銷部。豐富環(huán)境訓(xùn)練箱：哈爾濱振發(fā)有機玻璃廠。生物顯微鏡：日本NIKON 公司。臺式高速冷凍離心機：長沙英泰儀器有限公司。一次性無菌針灸針：直徑0.25 mm，長13 mm，蘇州華佗醫(yī)療器械有限公司。VPA： 美 國SIGMA-ALDRICH 生 物 公 司。 IL-6、IL-1β ELISA 試劑盒：北京誠林生物公司(批號E-30644；E-30418)。

1.4 干預(yù)方法

對照組和模型組不進行任何干預(yù)，給予同等條件活動。其他3 組在生后第21 天開始干預(yù)。每天1 次，每周6 d，共4周。

豐富環(huán)境組置于豐富環(huán)境訓(xùn)練籠中1 h。參照Nithianantharajah 等[10]將豐富環(huán)境訓(xùn)練籠設(shè)置為70 cm×60 cm×50 cm 的透明有機玻璃箱，內(nèi)部放置刺激運動、氣味、觸覺和聽覺的物品，如彩色小球、檸檬、音響等，同時融合6只陌生正常同齡雌鼠。

頭穴叢刺組參照《實驗針灸學(xué)》選取百會穴及其左右兩側(cè)旁開5 mm 處，從頭后向前額進行叢刺，深5～10 mm，快速捻轉(zhuǎn)20 s后留針1 h。

豐富環(huán)境結(jié)合頭穴叢刺組：給予大鼠頭穴叢刺長留針的同時，將其置于豐富環(huán)境訓(xùn)練籠中干預(yù)1 h。

1.5 動物行為學(xué)檢測

在生后第42天對各組進行行為學(xué)測試。

1.5.1 社交能力指數(shù)和社交偏好指數(shù)

三箱實驗[11]是評估大鼠社交行為的常用方法。

測試箱采用70 cm×60 cm×50 cm 的頂部開口長方體亞克力箱，兩塊中下部開口(允許動物在箱內(nèi)自由活動)的透明亞克力板將箱內(nèi)空間均分為3份，箱內(nèi)兩側(cè)箱格對角放置直徑5 cm、高20 cm 的金屬籠，用來放置陌生鼠。攝像頭置于箱體上方全程采集視頻。實驗前7 d 對待測鼠進行適應(yīng)性訓(xùn)練，第8 天正式開始實驗。

實驗分為兩個階段。第一個階段為社交能力測試，陌生鼠1 放入右側(cè)箱格金屬籠中，左側(cè)箱格放入空籠，將測試鼠放入中間箱格，測試10 min；結(jié)束后立即進行第二階段測試，即社交偏好測試，陌生鼠1不取出，陌生鼠2 放在空籠中，隨即調(diào)換兩個金屬籠的位置，再將被測鼠放入中間箱格測試10 min。采用Smart 3.0 行為學(xué)分析軟件記錄和分析測試鼠在3 個箱格中的活動時間、sniff 時間和活動軌跡等信息。為避免干擾，在每只鼠測試后都用75%酒精棉擦拭箱體，晾干后再進行下一只鼠的測試。

1.5.2 重復(fù)刻板行為

埋珠實驗[12]主要用于測試大鼠的刻板行為。

提前1 h 把大鼠送入測試箱以適應(yīng)環(huán)境。用75%酒精和水擦拭標(biāo)準(zhǔn)鼠箱，并用紙巾擦干，底部墊料厚5 cm，墊料表面按4×5 的方式均勻擺放20 個大理石球(直徑1 cm)，放入待測鼠，蓋上蓋子，30 min 后將其取出，統(tǒng)計暴露體積大于1/2 的大理石球的個數(shù)，以及被埋大理石球的個數(shù)。為避免干擾，每只鼠測試后對箱體及墊料進行酒精消毒去味，待酒精揮發(fā)后進行下一只鼠的測試。

1.6 血清炎性因子IL-6和IL-1β水平測定

各組大鼠全部完成行為學(xué)測試后，腹腔注射10%水合氯醛350～400 mg/kg 麻醉大鼠，取眼球血約3～4 mL，室溫下靜置2 h，4 ℃、3 000 r/min 離心15 min，取離心后的淡黃色上清液，1.5 mL 離心管分裝，采用ELISA 法測定血清IL-1β 和IL-6 水平。實驗步驟按試劑盒說明書操作。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 27.0 進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料符合正態(tài)分布，以(±s)表示。組間均數(shù)比較采用ANOVA 方差分析，進一步兩兩比較采用LSD 檢驗。顯著性水平α= 0.05。

2 結(jié)果

2.1 動物行為學(xué)檢測

2.1.1 社交能力指數(shù)和社交偏好指數(shù)

與對照組比較，模型組社交能力指數(shù)和社交偏好指數(shù)均降低(P＜ 0.05)。與模型組比較，豐富環(huán)境組、頭穴叢刺組和豐富環(huán)境結(jié)合頭穴叢刺組社交能力指數(shù)和社交偏好指數(shù)均提高(P＜ 0.05)，豐富環(huán)境結(jié)合頭穴叢刺組優(yōu)于頭穴叢刺組和豐富環(huán)境組(P＜ 0.05)。見表1、圖1和圖2。

圖1 各組三箱實驗社交能力結(jié)果Figure 1 Sociability results of three-chamber text in each group

2.1.2 重復(fù)刻板行為

與對照組比較，模型組挖掘掩埋動作頻繁，埋珠數(shù)量多(P＜ 0.05)。與模型組比較，豐富環(huán)境組、頭穴叢刺組和豐富環(huán)境結(jié)合頭穴叢刺組埋珠數(shù)量減少(P＜0.05)，與豐富環(huán)境組、頭穴叢刺組相比，豐富環(huán)境結(jié)合頭穴叢刺組埋珠數(shù)量下降(P＜ 0.05)。見表2。

表2 各組埋珠實驗結(jié)果Table 2 Comparision of marble burying results among groups

2.2 血清炎性因子IL-6、IL-1β水平

與對照組比較，模型組外周血清炎性因子IL-6 和IL-1β 水平升高(P＜ 0.05)；與模型組比較，豐富環(huán)境組、頭穴叢刺組和豐富環(huán)境結(jié)合頭穴叢刺組外周血清炎性因子IL-6 和IL-1β 水平下降(P＜ 0.05)，豐富環(huán)境結(jié)合頭穴叢刺組IL-6 和IL-1β 水平低于豐富環(huán)境組和頭穴叢刺組(P＜ 0.05)。見表3。

表3 各組血清炎性因子IL-6、IL-1β水平Table 3 Comparision of serum levels of inflammatory factors IL-6 and IL-1β among groups單位：ng/L

3 討論

VPA 建立ASD 模型已被眾多研究證實在解剖學(xué)、病理學(xué)、病因?qū)W方面與人類數(shù)據(jù)有顯著的相似之處[13]。2005 年，Schneider 等[9]首次從行為學(xué)角度證實VPA 建立孤獨癥模型的有效性。Schneider 團隊發(fā)現(xiàn)VPA建立的ASD大鼠模型生長發(fā)育較遲緩，對疼痛的敏感度降低，社交行為數(shù)量減少，運動和重復(fù)/刻板行為以及焦慮增加，這種行為改變與人類ASD行為障礙的特征有顯著相似之處。后續(xù)許多研究采用不同的行為測量工具，如三箱實驗檢測ASD大鼠社交能力，埋珠實驗檢測其重復(fù)刻板行為，曠場實驗檢測其焦慮情緒，均得到與Schneider 等相同的結(jié)論[14-15]。目前該模型的行為學(xué)表現(xiàn)已作為評估手段廣泛應(yīng)用于ASD的行為學(xué)研究中。

ASD 患兒的行為學(xué)癥狀與大腦神經(jīng)生物學(xué)改變和外部環(huán)境刺激有關(guān)。豐富環(huán)境訓(xùn)練通過感覺、觸覺、視覺、聽覺、運動、空間以及同伴等豐富的刺激，有利于改善ASD 大鼠的社交能力[5]。通過調(diào)節(jié)基底神經(jīng)節(jié)選擇核中的神經(jīng)元代謝活性，增加樹突棘密度，或者增加神經(jīng)營養(yǎng)因子或突觸蛋白表達來改善神經(jīng)可塑性和神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)，減少炎癥和氧化應(yīng)激，從而改善小鼠重復(fù)刻板行為、社交功能缺陷以及認(rèn)知功能障礙等癥狀[16-18]。一項為期17 周的BTBRT+Itpr3tf/J 小鼠豐富環(huán)境訓(xùn)練研究顯示，三箱實驗中豐富環(huán)境組雄鼠社交偏好和社交能力較模型組有顯著提升[19]。

頭穴叢刺直接作用于大腦體表投影區(qū)，可以改善局部血供，調(diào)節(jié)大腦氧和葡萄糖代謝，增強神經(jīng)興奮性，減少炎癥反應(yīng)，留針達到一定刺激量時可以促進神經(jīng)功能重組，改善相應(yīng)的異常行為，在腦部發(fā)育關(guān)鍵時期效果尤甚[20-23]。此外，頭穴叢刺通過上調(diào)海馬中神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1 和表皮生長因子4 受體表達、調(diào)節(jié)額葉皮質(zhì)相關(guān)激素水平，如催產(chǎn)素、5-羥色胺來改善ASD 大鼠的行為學(xué)癥狀[24-25]。一項關(guān)于頭穴叢刺治療ASD 的Meta 分析顯示，頭穴叢刺是減輕ASD 嚴(yán)重程度、改善ASD 行為癥狀的有效治療方法[26]。本研究顯示，干預(yù)后各組社交能力指數(shù)和社交偏好指數(shù)改善，重復(fù)刻板行為減少，豐富環(huán)境訓(xùn)練結(jié)合頭穴叢刺效果更好。

ASD 是一組異質(zhì)性神經(jīng)發(fā)育綜合征，與免疫系統(tǒng)失調(diào)和炎癥反應(yīng)異常密切相關(guān)[27]。IL-6 是參與腦發(fā)育的重要免疫因子，外周血液IL-6 的升高可以通過神經(jīng)解剖結(jié)構(gòu)和神經(jīng)可塑性的損傷介導(dǎo)孤獨癥樣行為[28]。IL-1β 通過淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞激活觸發(fā)炎癥反應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)，ASD 患兒單核細(xì)胞損傷并導(dǎo)致體內(nèi)免疫反應(yīng)發(fā)生改變，使促炎因子IL-1β 和IL-6 異常增多，與抑炎因子IL-10 處于不平衡狀態(tài)，進而促使ASD 患兒異常行為的出現(xiàn)[29]。本研究顯示，豐富環(huán)境訓(xùn)練結(jié)合頭穴叢刺能夠下調(diào)孤獨癥大鼠血清中促炎因子IL-6和IL-1β 的表達，減輕外周炎性狀態(tài)。這與趙曉倩等[30]的研究結(jié)果一致。

4 結(jié)論

豐富環(huán)境訓(xùn)練結(jié)合頭穴叢刺能夠改善孤獨癥大鼠行為學(xué)癥狀，降低周圍血清炎性因子表達，兩者聯(lián)合應(yīng)用效果更佳，但具體機制仍需進一步研究。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。