檉柳離體無性繁殖研究

李雪晗 陸玉建，2，3

（1濱州學(xué)院生物與環(huán)境工程學(xué)院，山東 濱州 256603；2山東省黃河三角洲野生植物資源開發(fā)利用工程技術(shù)研究中心，山東 濱州 256603；3山東省黃河三角洲生態(tài)脆弱帶工程技術(shù)研究中心，山東 濱州 256603）

檉柳為檉柳科檉柳屬灌木或小喬木，藥用價(jià)值較高[1]。檉柳多分布于東部至西南部地區(qū)，不僅可以生長在嚴(yán)寒、干旱和多風(fēng)沙等環(huán)境中，還極耐鹽堿，是典型的鹽生植物[2-3]。檉柳根部有根癌菌，不僅能夠優(yōu)化土壤結(jié)構(gòu)，還可以增加土壤中的有機(jī)質(zhì)[4-5]。合理種植檉柳既能有效提升鹽堿地區(qū)的土地利用率，又能擴(kuò)大荒漠化地區(qū)的綠化覆蓋范圍，對生態(tài)環(huán)境的改善具有重要作用[6-7]。傳統(tǒng)的檉柳繁殖方式是扦插和播種，實(shí)踐中檉柳生長速度慢，培養(yǎng)周期長，成苗率低，且易受地理環(huán)境和季節(jié)的限制，難以滿足市場需求[8-10]。

植物組織培養(yǎng)技術(shù)以檉柳作為材料進(jìn)行離體無性繁殖，觀察和分析不同植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對檉柳不定芽和生根誘導(dǎo)的影響，篩選檉柳不定芽誘導(dǎo)和生根培養(yǎng)的最優(yōu)條件，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步進(jìn)行轉(zhuǎn)基因或者誘變，實(shí)現(xiàn)生物性狀的改良[11-12]，可促進(jìn)檉柳快速繁殖。該技術(shù)不僅能夠大幅度縮短培養(yǎng)周期，而且不受時(shí)空限制，彌補(bǔ)了檉柳傳統(tǒng)繁殖方式的不足[13-14]。近年來，檉柳的組織培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)在快速繁殖、短周期育種等方面取得了較大的進(jìn)步，在嚴(yán)寒、干旱、多風(fēng)沙和重鹽堿等地區(qū)檉柳繁殖發(fā)揮了重要作用。目前檉柳的組織培養(yǎng)技術(shù)仍處于發(fā)展階段，還具有較大的發(fā)展空間。本研究以檉柳嫩莖為材料，分析了不同植物激素對檉柳不定芽誘導(dǎo)以及生根的影響，以建立檉柳高頻離體無性繁殖體系，為檉柳的規(guī)?；N植以及優(yōu)良品種的選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取春季和夏季生長優(yōu)良的檉柳幼嫩莖段為材料。所有試驗(yàn)材料均取自濱州學(xué)院黃河三角洲生態(tài)研究中心植物園。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制根據(jù)前期預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果，設(shè)計(jì)9 種檉柳不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，分別為C1，MS+1.00 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA；C2，MS+1.00 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA；C3，MS+1.00 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA；C4，MS+0.50 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA；C5，MS+0.50 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA；C6，MS+0.50 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA；C7，MS+1.00 mg/L 6-BA+0.10 mg/L IBA；C8，MS+1.00 mg/L 6-BA+0.50 mg/L IBA；C9，MS+1.50 mg/L 6-BA+0.50 mg/L IBA。設(shè)計(jì)9種檉柳生根培養(yǎng)基，分別為R1，MS；R2，MS+0.10 mg/L NAA；R3，MS+0.20 mg/L NAA；R4，MS+0.01 mg/L NAA；R5，MS+0.50 mg/L NAA；R6，1/2 MS；R7，1/2 MS+0.10 mg/L NAA；R8，1/2 MS+0.20 mg/L NAA；R9，1/2 MS+0.01 mg/L NAA。

配制方法：稱取適量的MS或1/2 MS固體粉末，加蒸餾水充分?jǐn)嚢?，分別加入3%蔗糖和相應(yīng)的植物生長調(diào)節(jié)劑。定容后調(diào)節(jié)溶液的pH 值至5.8，添加1%瓊脂，分裝，121 ℃高壓滅菌20 min后冷卻備用。

1.2.2 外植體的消毒選取生長優(yōu)良且健康無病害的檉柳枝條作為外植體，將其切成適宜長度的莖段，放入燒杯中。先用流水沖洗30 min，洗衣粉浸泡1 h，再用流水沖洗干凈。隨后轉(zhuǎn)入超凈工作臺(tái)中，使用70%乙醇消毒30 s，10%次氯酸鈉處理10 min，消毒期間須輕輕搖晃燒杯，以達(dá)到最佳的消毒效果。消毒完成后依次棄去乙醇和次氯酸鈉，使用無菌水反復(fù)沖洗5～6次，將外植體上殘留的乙醇和次氯酸鈉沖洗干凈后即完成整個(gè)外植體的消毒。

1.2.3 不定芽的誘導(dǎo)在超凈工作臺(tái)中，將消毒后的檉柳外植體切去兩端，去掉發(fā)黃的葉片和枝條。將莖段切為約5 cm 小段，豎直接種到上述9 種不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每瓶接種5～7個(gè)外植體，接種完成后灼燒瓶口，蓋上封口膜，放入恒溫培養(yǎng)箱中25 ℃光照培養(yǎng)，連續(xù)觀察外植體的生長狀態(tài)，30 d后進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，計(jì)算外植體不定芽誘導(dǎo)率，公式如下。

1.2.4 檉柳的生根培養(yǎng)將誘導(dǎo)產(chǎn)生的檉柳不定芽反復(fù)繼代培養(yǎng)，待不定芽生長至5 cm 左右時(shí)，選取生長良好的不定芽分別接種到上述9種生根培養(yǎng)基中，放入恒溫培養(yǎng)箱中25 ℃光照培養(yǎng)，連續(xù)觀察不定芽誘導(dǎo)產(chǎn)生不定根的情況，30 d 后統(tǒng)計(jì)生根數(shù)并計(jì)算生根率，公式如下。

2 結(jié)果與分析

2.1 不定芽誘導(dǎo)

將檉柳外植體分別接種到C1—C9不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，接種30 d后，統(tǒng)計(jì)和記錄培養(yǎng)基中不定芽生長情況（表1）。試驗(yàn)結(jié)果表明，在C1培養(yǎng)基中，檉柳不定芽誘導(dǎo)率為86.15%，不定芽生長優(yōu)良且數(shù)量繁多；在C2培養(yǎng)基中，檉柳不定芽誘導(dǎo)率為76.06%，不定芽生長較旺盛；在C3培養(yǎng)基中，檉柳不定芽誘導(dǎo)率為75.66%，雖生長情況較好，但芽量稍少；在C4培養(yǎng)基中，檉柳不定芽誘導(dǎo)率為79.71%，不定芽數(shù)目較多，但部分枝條枯萎；在C5培養(yǎng)基中，檉柳不定芽誘導(dǎo)率為75.70%，叢生芽和單芽混生，枯枝較多；在C6培養(yǎng)基中，檉柳不定芽誘導(dǎo)率約為80.50%，不定芽數(shù)目較多，但偏黃；在C7培養(yǎng)基中，檉柳不定芽誘導(dǎo)率為50.00%，不定芽生長稀疏，數(shù)量較少，且較為細(xì)弱；在C8培養(yǎng)基中，檉柳不定芽誘導(dǎo)率為66.67%，不定芽生長一般，同樣較為細(xì)弱；在C9培養(yǎng)基中，檉柳不定芽誘導(dǎo)率為43.30%，不定芽生長稀疏，芽量也較少。在這9 種檉柳不定芽培養(yǎng)基中，C1培養(yǎng)基不定芽誘導(dǎo)率最高且誘導(dǎo)出的不定芽生長優(yōu)良，較為健壯。因此，C1培養(yǎng)基可作為檉柳不定芽誘導(dǎo)最適培養(yǎng)基，用于后續(xù)檉柳不定芽的大量誘導(dǎo)和擴(kuò)繁。

表1 檉柳的不定芽誘導(dǎo)情況

續(xù)表1 檉柳的不定芽誘導(dǎo)情況

2.2 生根培養(yǎng)

選取較綠的檉柳嫩芽接種到R1—R9培養(yǎng)基中進(jìn)行生根誘導(dǎo)，30 d 后觀察和統(tǒng)計(jì)生根數(shù)目并計(jì)算生根率（表2）。試驗(yàn)結(jié)果顯示，在R1培養(yǎng)基中，檉柳不定芽的生根率為72.23%，但誘導(dǎo)產(chǎn)生的根較為細(xì)長且數(shù)量較少；在R2培養(yǎng)基中，檉柳不定芽的生根率為54.29%，誘導(dǎo)產(chǎn)生根的數(shù)量極少，長度也較短，部分苗存在干枯現(xiàn)象；在R3培養(yǎng)基中，檉柳不定芽的生根率約為63.33%，誘導(dǎo)產(chǎn)生根的數(shù)量相對較少，根的長度也較短，且幼苗生長比較緩慢；在R4培養(yǎng)基中，檉柳不定芽的生根率達(dá)到76.10%，培養(yǎng)基中生根情況與R1相似，誘導(dǎo)產(chǎn)生的不定根較為細(xì)長且數(shù)量不多；在R5培養(yǎng)基中，檉柳不定芽的生根率為69.28%，誘導(dǎo)產(chǎn)生不定根的數(shù)量相對較少，根的長度也較短且生長比較緩慢；在R6培養(yǎng)基中，檉柳不定芽的生根率達(dá)到97.22%，誘導(dǎo)產(chǎn)生的不定根數(shù)量較多，根系較發(fā)達(dá)，幼苗生長旺盛；在R7培養(yǎng)基中，檉柳不定芽的生根率為52.91%，誘導(dǎo)產(chǎn)生的根數(shù)量極少，長度極短，且幼苗的生長緩慢；在R8培養(yǎng)基中，檉柳不定芽的生根率和R7接近，不定根的誘導(dǎo)情況也較相似，誘導(dǎo)產(chǎn)生的根數(shù)量少，長度短，幼苗的生長情況不佳；在R9培養(yǎng)基中，檉柳不定芽的生根率為95.84%，和R6培養(yǎng)基中不定根的誘導(dǎo)率較接近，誘導(dǎo)產(chǎn)生的根數(shù)量多，生長迅速，幼苗的生長狀況良好。由上可得，在這9種生根培養(yǎng)基中，R6培養(yǎng)基可作為最適宜的檉柳生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基，用于檉柳不定芽的生根誘導(dǎo)，經(jīng)30 d生根誘導(dǎo)，可獲得大量的試管苗。

表2 檉柳的生根培養(yǎng)情況

2.3 離體再生

采取生長優(yōu)良的檉柳枝條，用清水沖洗掉枝條表面的泥土，轉(zhuǎn)至超凈工作臺(tái)中，在無菌條件下用70%乙醇和0.1%次氯酸鈉進(jìn)行消毒處理，消毒完畢后用無菌水反復(fù)沖洗5～6 次，用鑷子和解剖刀將外植體切至5 cm 左右，接種到最適不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基C1中誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽，每瓶接種5～7 個(gè)外植體，放入恒溫培養(yǎng)箱中25 ℃光照培養(yǎng)。在最適培養(yǎng)基中，檉柳的莖段可誘導(dǎo)長出明顯的不定芽，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，不定芽數(shù)量逐漸增多。待培養(yǎng)約30 d 后，可觀察到誘導(dǎo)產(chǎn)生的嫩芽粗壯且較密集（圖1A）；選取嫩綠且生長良好的不定芽進(jìn)行繼代培養(yǎng)，不定芽繼續(xù)生長，持續(xù)培養(yǎng)14 d 后，不定芽的數(shù)量明顯增多。將不定芽轉(zhuǎn)接入新培養(yǎng)基繼續(xù)增殖培養(yǎng)，30 d 后可以看到明顯的叢生芽（圖1B）；將叢生芽進(jìn)行第一次叢生芽繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)14 d 后，叢生芽繼續(xù)增多，長勢較好；接著再選取生長粗壯健康的叢生芽進(jìn)行第二次繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)14 d 后，叢生芽生長旺盛。當(dāng)檉柳的不定芽生長至5 cm 左右時(shí)，將誘導(dǎo)產(chǎn)生的不定芽在無菌條件下接種到生根最適培養(yǎng)基R6中誘導(dǎo)生根，經(jīng)恒溫培養(yǎng)箱25 ℃光照培養(yǎng)約30 d 后，可看到在檉柳不定芽的基部生長出了數(shù)量較多、長度適中的不定根，根系較發(fā)達(dá)，幼苗生長旺盛（圖1C）。此后繼續(xù)進(jìn)行壯苗培養(yǎng)便可得到數(shù)目較多且生長良好的試管苗。

圖1 檉柳不定芽誘導(dǎo)和生根培養(yǎng)

3 結(jié)論與討論

本研究選用檉柳莖段為材料，對其進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)和離體再生培養(yǎng)，觀察和統(tǒng)計(jì)外植體不定芽和生根誘導(dǎo)情況。研究發(fā)現(xiàn)，在所設(shè)計(jì)的9 種檉柳不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，C1培養(yǎng)基不定芽誘導(dǎo)率最高，不定芽長勢好且數(shù)量多。C1、C2和C3培養(yǎng)基中植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)6-BA 的加入量為1.00 mg/L，NAA 的濃度分別為0.01、0.05 和0.10 mg/L；C4、C5和C6培養(yǎng)基中6-BA 濃度為0.50 mg/L；而在C7—C9培養(yǎng)基中則將植物調(diào)節(jié)生長物質(zhì)NAA 更換為IAB。6-BA 和NAA 是檉柳不定芽誘導(dǎo)比較適宜的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，這2 種植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)最適濃度分別為1.00和0.01 mg/L，在此比例下，檉柳不定芽的分化效果較好。在試驗(yàn)所設(shè)計(jì)的9 種檉柳生根培養(yǎng)基中，R1—R5培養(yǎng)基均使用MS 作為基本培養(yǎng)基，其中R1培養(yǎng)基中沒有添加生長素類植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，其他培養(yǎng)基均加入了一定量的NAA，濃度分別為0.10、0.20、0.01和0.50 mg/L；R6—R9培養(yǎng)基均使用1/2 MS作為基本培養(yǎng)基，其中R6培養(yǎng)基中沒有添加生長素類植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，其他培養(yǎng)基同樣添加了一定量的NAA，濃度分別為0.10、0.20和0.01 mg/L。結(jié)果表明，不定芽在R6和R9生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)產(chǎn)生不定根的效果較好，誘導(dǎo)產(chǎn)生的根健康粗壯，根系較發(fā)達(dá)，幼苗生長旺盛。由此可見，在檉柳不定芽生根過程中，適當(dāng)減少植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的加入量，對于不定芽的生根有明顯促進(jìn)作用。因此，宜使用1/2 MS作為檉柳不定芽誘導(dǎo)生根的基本培養(yǎng)基，若要加入植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，最適宜的方案是在1/2 MS的基礎(chǔ)上加入0.01 mg/L NAA。實(shí)踐中，NAA 對檉柳不定芽生根的影響不大，很可能是因?yàn)閮?nèi)源生長素的含量已滿足不定芽的生根需求。本研究通過分析影響檉柳不定芽誘導(dǎo)和生根培養(yǎng)的因素，建立了檉柳離體無性繁殖體系，為檉柳的規(guī)模化種植以及優(yōu)良品種的選育提供參考。