蛛絲絲素蛋白膜的制備及其釋藥性能評價

劉欣欣,曾惠娜,紀晨然,高鵬飛,趙昱,張成桂*

（1.大理大學(xué) 云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點實驗室暨藥學(xué)院，大理 671000；2.大理大學(xué) 藥用特種昆蟲開發(fā)國家地方聯(lián)合工程研究中心，大理 671000；3.大理大學(xué) 中國西南藥用昆蟲及蛛形類資源開發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心，大理 671000）

蜘蛛絲是由位于蜘蛛腹部后端的不同絲腺產(chǎn)生的多種絲的復(fù)合體，主要由蛋白質(zhì)構(gòu)成[1]。蛛絲的應(yīng)用涉及一維縫合線、二維薄膜、三維多孔支架、水凝膠等劑型，用作傷口敷料、支持組織再生、周圍神經(jīng)再生等用途，同時蛛絲涂層可增加細胞黏附率，發(fā)揮生物相容性優(yōu)勢減輕機體炎癥反應(yīng)[2]。天然蛛絲是自然界已知的強度最高的天然蛋白纖維[3]，其特殊的蛋白質(zhì)鏈結(jié)構(gòu)、聚集態(tài)結(jié)構(gòu)及其獨特的自組裝性能使蛛絲纖維具有包裹藥物的天然優(yōu)勢[4]。同時天然蛛絲材料獨有的力學(xué)性能、降解性能、高度的人體生物相容性顯現(xiàn)出廣闊的發(fā)展前景[5-6]。蛛絲醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域涉及心臟支架、血管支架、醫(yī)美線雕[7-9]等。

絲素蛋白具有良好的生物相容性，在生物組織工程支架、藥物輸送領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，近年來研究者們多以蠶絲[10-12]或合成蛛絲[13-14]為對象進行絲素蛋白纖維的研究?；诮z素蛋白的敷料具有抗炎、促血管生成特性，有顯著加速皮膚傷口愈合的功效[15]，蜘蛛絲在特定條件下自主卷曲并裝配成生物骨架，其形成的蛛絲絲素蛋白膜又能順利載進藥物分子，且能夠維持藥物分子穩(wěn)定釋放屬于業(yè)內(nèi)尚未解決的技術(shù)難題。使用蛛絲絲素蛋白液制膜并解釋其復(fù)雜的藥物釋放行為，研發(fā)難度大，然而其表現(xiàn)出的優(yōu)異的生物相容性、潛在的緩釋性能也正激勵著當代醫(yī)藥工作者在蛛絲研發(fā)上前仆后繼。

本文以天然蛛絲為原料，通過對其成膜參數(shù)進行優(yōu)化，探索蛛絲絲素蛋白膜作為膜劑載體的醫(yī)用價值。

1 實驗材料及方法

1.1 原材料

六氟異丙醇(HFIP)(工業(yè)級，上海鈺康生物科技有限公司)；敬釗纓毛蛛蛛絲(海南蛛王生物科技有限公司)；甲酸(色譜級，江蘇強盛功能化學(xué)股份有限公司)；三氟乙酸(色譜級)、甲醇(色譜級)，美國天地有限公司；羅丹明B (RhB，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；小鼠胚胎成骨細胞MC3 T3-E1 (中國中科院上海細胞庫)；MEM-α培養(yǎng)基(Minimum essential medium α，武漢普諾賽生物科技有限公司)；二甲基亞砜、噻唑藍(北京Solarbio公司)。

1.2 蛛絲絲素蛋白膜的制備

1.2.1 溶解溶劑的選擇

稱取3份等質(zhì)量同批次的潔凈蛛絲，分別剪碎后各自置于西林瓶中，設(shè)置1∶1 (mg∶mL)料液質(zhì)量體積比，向西林瓶中分別加入甲酸、三氟乙酸(Trifluoroacetic acid，TFA)、HFIP溶劑，室溫條件下磁力攪拌溶解，每隔2 h觀察1次，直至所有溶液無明顯變化。溶液經(jīng)干燥至恒重的38 μm金屬濾網(wǎng)過濾后，濾網(wǎng)及濾渣于通風(fēng)櫥中揮干至恒重，妥善保存濾液。稱量濾網(wǎng)濾渣總重并按下式計算蛛絲在各溶劑中的溶解率：

其中：S為蛛絲在溶劑中的溶解率；M1為稱取的蛛絲原料實際質(zhì)量；M2為潔凈金屬濾網(wǎng)質(zhì)量；M3為過濾并風(fēng)干后濾渣濾網(wǎng)總重。

1.2.2 成膜方法的選擇

溶劑澆鑄法：將1.2.1項下制備得到的3種天然蛛絲絲素蛋白濾液，分別倒入形制相同的玻璃模具中，于通風(fēng)櫥中的圓周型搖床(SK-O330-Pro，大龍興創(chuàng)儀器有限公司)上以100 r/min的轉(zhuǎn)速揮干溶劑，觀察其成膜情況。

靜電紡絲法：將1.2.1項下得到的3種天然蛛絲絲素蛋白濾液，分別注入玻璃注射針筒內(nèi)，通過微量注射泵以60 μL/min的速率擠出，針頭內(nèi)徑選用0.8 mm的不銹鋼針頭。電紡過程中電壓控制在16 kV，針頭至接收器的接收距離為10 cm，下方用錫箔紙接收紡絲液經(jīng)擠壓后形成的“泰勒錐”，觀察納米纖維形成情況。

1.2.3 正交試驗確定蛛絲最佳溶解條件

前期預(yù)試驗結(jié)果表明，在同一溶解溶劑下影響蛛絲溶解率的主要因素有溶解時間、蛛絲與溶劑的料液質(zhì)量體積比及溶解溫度，每個因素下分別設(shè)定3個水平，選用正交試驗設(shè)計表，篩選最佳溶解條件(表1)。

表1 蛛絲絲素蛋白膜正交試驗因素水平表Table 1 Level of factors in orthogonal test of silk fibroin protein membrane

1.2.4 空白蛛絲絲素蛋白膜的制備

根據(jù)1.2.3項下篩選得到的成膜參數(shù)對蛛絲進行溶解，溶解后的蛛絲絲素蛋白液傾倒于平底玻璃容器中，于通風(fēng)櫥中的搖床上以100 r/min的轉(zhuǎn)速揮干溶劑成膜，膜劑回軟后揭膜。

1.2.5 載藥蛛絲絲素蛋白膜的制備

前期預(yù)試驗發(fā)現(xiàn)對制得的蛛絲絲素蛋白液進行不同程度的濃縮，膜劑表現(xiàn)為不同的外觀形態(tài)，同時膜劑厚度及光滑度亦不同，由此猜測不同濃度蛛絲絲素蛋白液成膜對膜劑的釋藥性能可能產(chǎn)生影響。根據(jù)1.2.3項下篩選得到的成膜參數(shù)進行5份等質(zhì)量蛛絲的溶解，冷凝回流濃縮獲得2、6、10、15、20 mg/mL的蛛絲絲素蛋白液，每個濃度下的蛋白液均分3組，分別倒入形制相同的平底玻璃模具中；因RhB具有紅色熒光，便于觀察，因此在載藥量范圍內(nèi)精密稱取15份RhB各5 mg加入上述溶液中，使用超聲波清洗器(SK8200 HP，上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)超聲5 min完全溶解混勻，在通風(fēng)櫥中于圓周型搖床上以100 r/min的轉(zhuǎn)速揮干溶劑成膜。

1.3 蛛絲絲素蛋白膜相關(guān)表征

1.3.1 宏觀觀察及微觀形貌觀察

宏觀觀察：選取不同成膜濃度下的蛛絲絲素蛋白膜，按從左到右的順序依次排列并拍照。

微觀形貌觀察：取小塊膜劑直接粘在導(dǎo)電膠上噴金后觀察表面，取另一塊膜劑液氮淬斷并噴金后觀察截面，上述膜劑均使用掃描電鏡(TESCAN MIRA LMS，泰斯肯掃描電鏡)拍攝樣品形貌。

1.3.2 載RhB蛛絲絲素蛋白膜厚度測量

按照國標GB/T 21389-2008《游標、帶表和數(shù)顯卡尺》[16]，將1.2.5項下制得的不同膜劑分別隨機選取9個間隔均勻的不同位置用數(shù)顯測厚規(guī)(awt-chy01，商丘埃維特工具有限公司)進行測量，記錄膜厚并計算平均值，測量位置如圖1所示，膜劑外環(huán)、中環(huán)、內(nèi)環(huán)均隨機均勻選取3個點測量。

圖1 厚度測量位置示意圖Fig.1 Schematic diagram of thickness measurement position

1.3.3 結(jié)晶度分析

將20 mg/mL載RhB蛛絲絲素蛋白膜裁剪成合適大小，用導(dǎo)電膠粘于玻璃樣品支架上，使用X-射線衍射儀(Rigaku SmartLab SE，日本理學(xué)(Rigaku)公司)進行檢測；設(shè)置實驗參數(shù)：銅離子陽極靶、掃描速度為5°/min、掃描范圍2θ=5°～60°。

1.3.4 拉力測試

分別將1.2.5項下制備的載RhB蛛絲絲素蛋白膜裁剪出大小相同的長條狀，固定于拉力強度試驗機(TM2101-T7-01，東莞市匯泰機械有限公司)上測拉伸強度及斷裂伸長率。

1.4 以RhB為模型藥物的載藥蛛絲絲素蛋白膜體外釋藥性能分析

1.4.1 RhB測定系統(tǒng)性試驗及載RhB蛛絲絲素蛋白膜釋藥含量測定

1.4.1.1 標準溶液的配制

精密稱取2.5 mg RhB標準品于燒杯中用少量去離子水溶解后，置于25 mL容量瓶中定容，獲得100 μg/mL的標準品母液，分別量取母液8 mL、5 mL、1 mL、0.8 mL、0.5 mL、0.1 mL、0.08 mL、0.05 mL、0.01 mL于10 mL容量瓶中，去離子水定容，配制一系列濃度梯度的標準品溶液并用紫外分光光度儀(UV-6000 PC，上海元析儀器有限公司)于550 nm[17]波長處進行檢測。

1.4.1.2 RhB-HFIP共存13 h的藥物穩(wěn)定性考察

試驗驗證HFIP為最佳溶解溶劑，并對RhB在HFIP中的穩(wěn)定性進行考察：將RhB在HFIP中分別放置0、1、3、5、7、9、11、13 h，到達取樣時間點時取樣并迅速于5 min內(nèi)揮干溶劑，用等量去離子水進行復(fù)溶。使用硅膠G色譜板，正丁醇∶無水乙醇∶1%氨水=6∶2∶2為展開劑的薄層色譜法進行穩(wěn)定性考察。

1.4.1.3 重復(fù)性、精密度和回收率考察

精密稱取2.5 mg RhB標準品于燒杯中用少量去離子水溶解后，置于25 mL容量瓶中定容，配制成RhB標準品溶液，重復(fù)此操作，平行配制6組標準溶液。使用紫外-可見分光光度計于550 nm波長處分別測定各組RhB標準品的吸光度值，驗證檢測方法重復(fù)性；

將配制好的RhB標準品溶液分別取40 μg/mL、4 μg/mL、0.4 μg/mL共3個濃度，連續(xù)3日，每日于550 nm紫外波長下各重復(fù)檢測3次，測試日內(nèi)精密度及日間精密度，并計算相對標準偏差(RSD)值。

分別精密稱取已知含量的RhB樣品9份，分為3組，分別按樣品中成分含量的80%、100%和120%加入RhB標準品，控制加樣前后濃度均在線性范圍內(nèi)，于550 nm波長處進行紫外檢測，并按以下公式計算加樣回收率p：

其中：T1為測得藥品量；T2為已知藥品量；T3為加入藥品量。

1.4.2 載RhB蛛絲絲素蛋白膜的釋藥性檢測

取1.2.5項下制備膜劑各30 mg，照2020版《中華人民共和國藥典》四部《0931溶出度與釋放度測定法》[18]指導(dǎo)原則中的小杯法于溶出試驗儀(RC806D，天津市天大天發(fā)科技有限公司)中進行體外釋藥試驗，設(shè)置溫度(37±0.5)℃，攪拌速度50 r/min。設(shè)置取樣時間點0 h、0.25 h、0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h、36 h到達取樣時間點取樣4 mL并加入同溫同體積釋放介質(zhì)。釋藥液于550 nm波長處進行紫外檢測，計算累計釋藥率如下：

其中：Q為累計釋藥率；K1為釋出藥物總量；K為30 mg各膜劑中所含總藥量。

1.5 空白蛛絲絲素蛋白膜毒性檢測

通過體外細胞毒性試驗檢測膜劑毒性。選用小鼠胚胎成骨細胞MC3 T3-E1，培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%雙抗(青霉素、鏈霉素)的MEM-α完全培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。參照ISO-10993-12-2021[19]及GB/T 16886.5-2017[20]選用噻唑藍(MTT)法對空白蛛絲絲素蛋白膜進行毒性檢測。按6 cm2∶1 mL的浸提比例，裁取面積60 cm2的空白蛛絲絲素蛋白膜加入10 mL MEMα完全培養(yǎng)基，于37℃無菌培養(yǎng)箱中浸提24 h。將空白蛛絲絲素蛋白膜浸提液稀釋成100%、75%、50%、25%的終濃度作實驗組，另設(shè)高密度聚乙烯(High density polyethylene，HDPE) 100%浸提液陰性對照組、含10%二甲基亞砜(Dimethylsulfoxide，DMSO)陽性對照組、僅加培養(yǎng)基空白對照組。將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的細胞按1×104個細胞/孔在96孔板中加100 μL細胞懸液；培養(yǎng)24 h后去除培養(yǎng)基加入100 μL蛛絲絲素蛋白膜浸提液；細胞與浸提液共培養(yǎng)24 h后加入20 μL MTT，于培養(yǎng)箱中孵育4 h后加入100 μL DMSO，用多功能酶標儀(SpectraMax M2，美谷分子儀器(上海)有限公司)在490 nm波長處測試OD值，按下式計算細胞存活率r：

其中：OD1為實驗樣品組光密度平均值；OD2為空白對照組光密度平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 蛛絲絲素蛋白膜的制備

2.1.1 溶劑及成膜方法的選定

表2為天然蛛絲在不同溶劑中的溶解率。蛛絲在不同溶劑中的溶解率為TFA＞HFIP＞＞甲酸。溶劑澆鑄法制膜中：以甲酸為成膜溶劑揮干速度最慢，12 h后仍以溶液形式存在，無法成膜，TFA和HFIP溶液易揮干，制劑易成膜，膜劑可完整剝離、取出。但以TFA為蛛絲溶解溶劑制備得到的蛛絲絲素蛋白膜中間與邊緣顏色差別大，外觀均一度差。因此選用HFIP作蛛絲溶解及成膜溶劑。

表2 天然蛛絲在不同溶劑中的溶解率Table 2 Solubility of natural spider silk in different solvents

靜電紡絲法制膜：TFA及甲酸作為紡絲液無法形成“泰勒錐”，僅以HFIP溶液中溶解蛛絲可形成完整“泰勒錐”，存在后續(xù)形成膜劑實體的潛力。綜上，選用HFIP作為蛛絲溶解溶劑，溶劑澆鑄法作為成膜方法。

2.1.2 影響天然蛛絲溶解條件考察

表3展示了天然蛛絲溶解條件正交設(shè)計試驗結(jié)果，分析可知，第4組試驗的蛛絲溶解率最高，為進一步確定各因素對蛛絲溶解率的影響，對正交試驗結(jié)果進行方差分析，由表4中概率P值可以看出，各因素對試驗結(jié)果的影響大小順序為A＞C＞B，即溶解時間＞溶解溫度＞料液質(zhì)量體積比。溶解時間對蛛絲溶解率有顯著影響(P值＜0.05)，溶解溫度及料液質(zhì)量體積比對蛛絲溶解率影響不顯著。因此在實驗合理范圍內(nèi)，優(yōu)化蛛絲溶解條件為A3B2C3，即以1 : 1 (mg : mL)的料液質(zhì)量體積比進行投料，在60℃條件下溶解8 h為最優(yōu)，蛛絲溶解率為74.85%。本文蛛絲絲素蛋白膜均在此條件下制備。

表4 正交實驗方差分析Table 4 Orthogonal experimental analysis of variance

2.2 蛛絲絲素蛋白膜相關(guān)表征

2.2.1 不同成膜濃度下載RhB蛛絲絲素蛋白膜的宏觀及微觀形貌

圖2和圖3分別為蛛絲絲素蛋白膜宏觀圖和SEM圖像。如圖2所示，可以觀察到隨著蛛絲絲素蛋白液成膜濃度的升高，膜劑完整度及光滑度依次提高。如圖3所示，不同成膜濃度下制備得到的蛛絲絲素蛋白膜，其微觀結(jié)構(gòu)大有不同。隨著蛛絲絲素蛋白液成膜濃度的升高，膜劑表面孔隙由稀疏逐漸變得緊實，當蛛絲絲素蛋白液濃度達到20 mg/mL時，表面近乎平整，孔洞微小，同時結(jié)合截面圖可以發(fā)現(xiàn)其截面結(jié)構(gòu)的變化與表面結(jié)構(gòu)變化趨勢一致。值得一提的是在蛛絲絲素蛋白液濃度為10 mg/mL的蛋白膜截面結(jié)構(gòu)中，觀察到一側(cè)稀疏、一側(cè)緊實的結(jié)構(gòu)，表面宏觀觀察其一面光滑、一面粗糙，由此推測此濃度的蛛絲絲素蛋白液恰好介于形成表面光滑膜劑的臨界范圍。

圖2 蛛絲絲素蛋白膜宏觀圖：(a) 2 mg/mL；(b) 6 mg/mL；(c) 10 mg/mL；(d) 15 mg/mL；(e) 20 mg/mLFig.2 Macroscopic plots of drug-loaded silk protein membrane: (a) 2 mg/mL; (b) 6 mg/mL; (c) 10 mg/mL; (d) 15 mg/mL; (e) 20 mg/mL

圖3 載羅丹明B (RhB)蛛絲絲素蛋白膜表面((a)～(e))及截面((a1)～(e1))的SEM圖像：((a),(a1)) 2 mg/mL；((b),(b1)) 6 mg/mL；((c),(c1)) 10 mg/mL；((d),(d1)) 15 mg/mL；((e),(e1)) 20 mg/mLFig.3 SEM images of surface ((a)-(e)) and cross-section ((a1)-(e1)) for rhodamine B (RhB) loaded silk protein membrane: ((a),(a1)) 2 mg/mL;((b),(b1)) 6 mg/mL; ((c),(c1)) 10 mg/mL; ((d),(d1)) 15 mg/mL; ((e),(e1)) 20 mg/mL

2.2.2 載藥蛛絲絲素蛋白膜的厚度

不同濃度的蛛絲絲素蛋白液，通過溶劑澆鑄法在通風(fēng)櫥中完全干燥后得到厚度不同的蛛絲絲素蛋白膜，使用數(shù)顯測厚規(guī)測試得到不同膜厚。由表5及圖4可知，在總蛛絲量相同條件下，隨著蛛絲絲素蛋白液濃度的不斷升高，膜劑厚度呈下降趨勢。

圖4 成膜蛛絲絲素蛋白液濃度與膜厚關(guān)系Fig.4 Relation between filamentin protein solution concentration and membrane thickness

表5 不同成膜濃度載藥蛛絲絲素蛋白膜厚度Table 5 Membrane thickness of silk protein protein loaded at different membrane-forming concentrations

2.2.3 蛛絲絲素蛋白膜的物相結(jié)構(gòu)和結(jié)晶度

XRD衍射峰的位置和強弱可反映蛋白膜的物相結(jié)構(gòu)和結(jié)晶度。結(jié)果如圖5所示，蛛絲絲素蛋白膜(Blank)的主衍射峰在2θ=10.6°、21.5°附近，其衍射峰寬而平，表明絲蛋白主要以無定形聚合物形式存在；模型藥RhB粉末在9°～35°之間有較尖銳的衍射特征峰；載RhB蛛絲絲素蛋白膜(Blank-RhB)衍射峰與未載藥蛛絲絲素蛋白膜(Blank)峰形一致，整體看峰形相差不大，這表明模型藥物可以較均勻地包裹在蛛絲絲素蛋白膜中，引入模型藥物后，膜劑骨架基本沒有受到干擾。

圖5 RhB及其載藥蛛絲絲素蛋白膜的XRD圖譜Fig.5 XRD patterns of RhB and its loaded spider filament protein membrane

2.2.4 蛛絲絲素蛋白膜的拉力性能

對1.2.5項下制備的2、6、10、15、20 mg/mL的蛛絲絲素蛋白液干燥膜劑進行拉伸強度和斷裂伸長率測試，結(jié)果如圖6所示。隨著蛛絲絲素蛋白液濃度的增加，所制備膜劑拉伸強度表現(xiàn)為上升趨勢，斷裂伸長率表現(xiàn)為先上升后下降趨勢，這可能與其內(nèi)部孔隙在受到拉伸時產(chǎn)生的形變有關(guān)。當?shù)蜐舛鹊闹虢z絲素蛋白液成膜時，內(nèi)部疏松部分孔隙產(chǎn)生拉伸形變使斷裂伸長率迅速上升，當高濃度蛛絲絲素蛋白液成膜時內(nèi)部孔隙收縮緊實，在外力作用下僅產(chǎn)生微小形變而斷裂。有研究認為，由于隨著蛛絲絲素蛋白液濃度的升高，蛋白分子間距離減小，碰撞幾率增大，分子間作用力增加，從而誘導(dǎo)了蛋白分子間的積聚[21]，由此也可以解釋成膜濃度越高膜劑厚度越低的現(xiàn)象。高濃度下蛛絲絲素蛋白分子間距離的減小會誘導(dǎo)其分子重排，從而增加蛋白分子向β折疊構(gòu)象的轉(zhuǎn)變，這也為其體外釋藥時間的延長、力學(xué)性能強度的增加提供了理論依據(jù)[22]。

圖6 蛛絲絲素蛋白膜拉伸強度及斷裂伸長率Fig.6 Tensile strength and elongation at break of silk protein membrane

2.3 不同密度載RhB蛛絲絲素蛋白膜釋藥規(guī)律分析

2.3.1 藥物-溶劑共存13 h的穩(wěn)定性考察

圖7為藥物在HFIP中不同時間段的穩(wěn)定性薄層色譜圖。由圖可知，與HFIP共存13 h內(nèi)的RhB薄層色譜斑點清晰，結(jié)果穩(wěn)定。

圖7 藥物在HFIP中不同時間段的穩(wěn)定性薄層色譜圖Fig.7 Thin-layer chromatogram of drug stability in HFIP for differenttime periods

2.3.2 線性關(guān)系、精密度及回收率試驗

以峰面積為縱坐標、濃度(μg/mL)為橫坐標得到RhB在純水中的線性范圍為0.1～100 μg/mL，線性方程：y=0.0139x+0.0379，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9998。

各濃度RhB標準品溶液日內(nèi)精密度及日間精密度RSD均在0.44%～2.56%之間，表明儀器及檢測方法的精密度良好。

不同濃度RhB標準品在樣品溶液中的平均加樣回收率分別為103.67%、98.6%、100.19%，此方法可作為定量檢測依據(jù)。

2.3.3 載RhB蛛絲絲素蛋白膜體外釋藥規(guī)律分析

由2、6、10、15、20 mg/mL的蛋白液制備的載RhB蛛絲絲素蛋白膜到達平臺階段時釋藥率分別為93.9%、92.1%、90.2%、87.3%、86.6%，結(jié)合圖8可知，載總蛛絲量及載藥量一定條件下，蛛絲絲素蛋白液濃度越高，對應(yīng)膜劑釋藥曲線越平緩。2 mg/mL、6 mg/mL蛋白液制備的載RhB蛛絲絲素蛋白膜突釋現(xiàn)象明顯，觀察其表面疏松多孔，藥物通過疏松的孔道快速釋放。隨著成膜蛋白液濃度的不斷升高，前30 min釋藥率逐漸降低，到達釋藥平臺期時間逐漸延長，以15 mg/mL、20 mg/mL蛋白液制備的載RhB蛛絲絲素蛋白膜緩釋效果較明顯，緩釋時間可達24～36 h。釋藥過程中，吸附在膜劑表面或填塞至與外界連接的孔洞中的藥物最先釋放，貢獻了最開始的快速釋藥部分；隨著膜劑在介質(zhì)中釋藥時間的增加，膜劑不斷溶脹，藥物在濃度差的推動下由內(nèi)向外溶出直至到達平臺階段，與課題組前期試驗結(jié)果一致[23]。對比上市藥物枸櫞酸芬太尼口腔黏膜貼片F(xiàn)entora釋藥5 min[24]、口腔貼劑意可貼釋藥2～3 h，及用于陰道給藥的復(fù)方炔諾酮膜每日用藥一片，本課題組制備的蛛絲絲素蛋白膜均可以通過調(diào)節(jié)成膜濃度達到相應(yīng)釋藥效果。

圖8 不同濃度蛛絲絲素蛋白液成膜釋藥曲線Fig.8 Membrane release curves of different concentrations of spider filamin protein solution

2.4 體外細胞毒性結(jié)果分析

圖9展示了空白蛛絲絲素蛋白膜浸提液細胞共培養(yǎng)24 h結(jié)果。由圖結(jié)果可知，陽性對照組細胞增殖率為11.7%，具有明顯細胞毒性；實驗組(蛛絲絲素蛋白膜組)樣品的100%浸提液細胞增殖率為75.4%，符合GB/T 16886.5-2017[20]規(guī)定的樣品浸提液最高濃度(100%浸提液)細胞相對活性大于空白組70%要求，認為該材料無細胞毒性。因此，本試驗方法制備出的蛛絲絲素蛋白膜對MC3 T3-E1細胞無顯著潛在細胞毒性。

圖9 空白蛛絲絲素蛋白膜浸提液細胞共培養(yǎng)24 h結(jié)果Fig.9 Results of cell co-culture of extracts for 24 h

3 結(jié) 論

(1) 本文以敬釗纓毛蛛蛛絲為原料，通過正交試驗法優(yōu)化制備工藝，采用溶劑澆鑄法成功制備出了載藥蛛絲絲素蛋白膜。提供了一種產(chǎn)率高、操作簡單的蛛絲絲素蛋白膜制備方法。

(2) 不同成膜濃度下的蛛絲絲素蛋白膜表現(xiàn)為不同的釋藥效果，可解決不同需求，應(yīng)用于不同領(lǐng)域，其中20 mg/mL的蛛絲絲素蛋白液制備的膜劑在體外釋藥中表現(xiàn)出長達24～36 h的緩釋效果。

(3) 在膜厚度與釋藥關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn)當蛛絲蛋白質(zhì)量相同時，蛛絲絲素蛋白液濃度越大，形成的膜劑厚度越小，釋藥越緩慢。

(4) 本文通過浸提法對蛛絲絲素蛋白膜進行毒性檢測，體外細胞試驗表明膜劑對小鼠胚胎成骨細胞MC3 T3-E1無顯著潛在細胞毒性。