黃芩、貓眼草、連翹單味中藥體外抗HIV-1病毒活性的研究*

李承乘,張清燕,劉 真,鄧博文,楊瑤瑤,沈俊嶺,李 強(qiáng)

(河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院艾滋病臨床研究中心,河南 鄭州 450000)

全球人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染人數(shù)已超過(guò)6 000萬(wàn),約3 000萬(wàn)感染者死于艾滋病(acquired immune deficiency syndrome,AIDS),使得目前AIDS的防治任務(wù)依然十分艱巨[1-2]。AIDS的治療主要采取兩種方案,即高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(highly active antiretroviral therapy,HAART)和中醫(yī)藥治療。HAART療法臨床效果顯著,但有毒副作用大、耐藥率高等缺陷。中藥在傳統(tǒng)理論研究與應(yīng)用方面有著堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ),研究[3-4]證明中藥能有效降低HIV病毒載量,減緩AIDS病情。部分中醫(yī)藥復(fù)方也具有抗病毒作用[5-8]。因此篩選出更多有效的抗HIV中藥具有重要意義。祛毒顆粒是臨床治療HIV的常用中藥復(fù)方,由黃芩、連翹、貓眼草、紅辣蓼、生甘草等組成,有解毒散結(jié)之功效,臨床效果較好,毒副反應(yīng)小。方中黃芩清熱燥濕,瀉火解毒,為君藥;連翹清熱解毒,散熱消癰,為臣藥;貓眼草祛痰散結(jié),拔毒殺蟲(chóng),為佐藥。本研究從體外實(shí)驗(yàn)角度探索組方中黃芩、貓眼草、連翹單味中藥的抗病毒效果,選用重組質(zhì)粒PLAI(含HIV包膜蛋白基因)和JRFC(含HIV骨架基因)制備假病毒,建立抗HIV-1藥物篩選平臺(tái),觀察黃芩、貓眼草、連翹單味中藥對(duì)HIV假病毒感染MAGI-CCR5細(xì)胞系的影響,評(píng)價(jià)其抗病毒作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

293T細(xì)胞,來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù),批號(hào)GNHu17;DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞, 來(lái)源于生工生物工程(上海)股份有限公司,批號(hào)B528413;MAGI-CCR5細(xì)胞,重組質(zhì)粒PLAI、JRFC,由中國(guó)科學(xué)院上海巴斯德研究所贈(zèng)送。

1.2 藥品、試劑與儀器

黃芩、連翹和貓眼草水煎劑由河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部制備。分別取黃芩、連翹和貓眼草各50 g,加入500 mL純水,使用加熱回流系統(tǒng)水煎3次,每次1 h。濃縮藥液,最終制得35 mL浸膏。取500 μL 浸膏,加入2 mL DMEM培養(yǎng)基,混勻后過(guò)濾備用。培養(yǎng)基DMEM,美國(guó)?？寺」井a(chǎn)品,批號(hào)SH30022.01;質(zhì)粒提取試劑盒,德國(guó)Macherey-Nagel公司產(chǎn)品,批號(hào)740410.50;脂質(zhì)體2 000轉(zhuǎn)染試劑盒,美國(guó)英杰公司產(chǎn)品,批號(hào)11668019;熒光素酶檢測(cè)試劑盒, 普洛麥格生物技術(shù)公司產(chǎn)品,批號(hào)E1501。NanoVue Plus型核酸蛋白定量測(cè)定儀,美國(guó)通用電氣公司產(chǎn)品;E1501型熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng),普洛麥格生物技術(shù)公司產(chǎn)品。

1.3 重組質(zhì)粒的保存與鑒定

取制備好的大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞懸液100 μL,加入30 μL質(zhì)?；靹?置于冰水混合物中45 min,43 ℃水浴中90 s,再轉(zhuǎn)移至冰浴中冷卻15 min;管內(nèi)加800 μL無(wú)抗性LB培養(yǎng)基混勻,置于搖床上以振幅40 mm、轉(zhuǎn)速150 r/min、37 ℃下培養(yǎng)1 h;轉(zhuǎn)移感受態(tài)細(xì)胞至氨芐抗性的LB瓊脂培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜;挑取轉(zhuǎn)染成功的大腸桿菌菌株大量擴(kuò)增,提取質(zhì)粒,進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定及熒光素酶報(bào)告基因測(cè)序;凍存轉(zhuǎn)化成功的菌落。

1.4 假病毒篩選平臺(tái)的構(gòu)建

將293T細(xì)胞傳代至密度為80%左右;按照 3∶1比例加入質(zhì)粒PLAI和JRFC共 8 μg,脂質(zhì)體 2 000 轉(zhuǎn)染試劑 8 μL,共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)50 mL /L CO2培養(yǎng)箱中;6 h后更換為含血清的完全培養(yǎng)基繼續(xù)孵育48 h;收集病毒上清液,稀釋為不同濃度梯度,感染MAGI-CCR5細(xì)胞。將空白細(xì)胞設(shè)為對(duì)照組;將空白細(xì)胞加不同濃度病毒上清液設(shè)為實(shí)驗(yàn)組,設(shè)5個(gè)梯度(1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16),每個(gè)梯度4個(gè)復(fù)孔。采用熒光素酶檢測(cè)試劑,在化學(xué)發(fā)光儀上測(cè)定每孔的相對(duì)熒光單位(relative light unit, RLU)以測(cè)定假病毒活性滴度,判斷假病毒篩選平臺(tái)是否構(gòu)建成功。進(jìn)行半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(tissue culture infective dose 50%,TCID50)測(cè)定,選取100TCID50病毒量用于藥物抑制試驗(yàn)。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1 對(duì)MAGI-CCR5細(xì)胞無(wú)毒性的單味中藥溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)篩選

通過(guò)中藥水煎液體外對(duì)MAGI-CCR5細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn)確定藥物的相對(duì)安全劑量,采用MTT法檢測(cè)單味中藥對(duì)MAGI-CCR5細(xì)胞增殖情況的影響。將MAGI-CCR5細(xì)胞接種于96孔板中,在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)50 mL /L CO2條件下培養(yǎng)過(guò)夜;棄上清液,重新加入完全培養(yǎng)基DMEM。將空白細(xì)胞設(shè)為對(duì)照組,加入100 μL完全培養(yǎng)基;將空白細(xì)胞加中藥設(shè)為實(shí)驗(yàn)組。以制備好的中藥水煎劑為初始濃度,10倍比稀釋加入培養(yǎng)板中,每孔100 μL,設(shè)置6個(gè)梯度(1∶1、1∶10、1∶100、1∶1 000、1∶10 000、1∶100 000),每梯度4個(gè)復(fù)孔;96孔板置于37 ℃、50 mL /L CO2條件下培養(yǎng)48 h;計(jì)數(shù)檢測(cè)MAGI-CCR5細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài),篩選出對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性的最合適質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.5.2 單味中藥體外假病毒感染MAGI-CCR5細(xì)胞抑制實(shí)驗(yàn)

將96孔板中MAGI-CCR5細(xì)胞培養(yǎng)基上清液棄去,設(shè)置對(duì)照組1為空白細(xì)胞,對(duì)照組2為空白細(xì)胞加病毒,實(shí)驗(yàn)組為空白細(xì)胞加病毒加中藥;各組別藥物以上述毒性實(shí)驗(yàn)篩選出的最合適質(zhì)量分?jǐn)?shù)為初始質(zhì)量分?jǐn)?shù),2倍等比稀釋,設(shè)置8個(gè)稀釋梯度(1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128);除對(duì)照組1外,每孔加入50 μL病毒(100TCID50),在37 ℃、50 mL/L CO2下培養(yǎng)6 h后,將對(duì)照組2更換為完全培養(yǎng)基,將實(shí)驗(yàn)組更換為不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的中藥煎液;48 h后,熒光素酶檢測(cè)試劑盒測(cè)定每孔R(shí)LU。計(jì)算藥物對(duì)假病毒的抑制率。抑制率=[1-(實(shí)驗(yàn)組發(fā)光值-對(duì)照組1發(fā)光值)/(對(duì)照組2發(fā)光值-對(duì)照組1發(fā)光值)]×100%

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 假病毒篩選平臺(tái)構(gòu)建結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組不同濃度梯度的相對(duì)熒光單位均高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表1。結(jié)果表明,假病毒篩選藥物平臺(tái)構(gòu)建成功。

表1 不同濃度梯度病毒上清液感染MAGI-CCR5細(xì)胞的熒光素酶值對(duì)比

2.2 3種單味中藥對(duì)MAGI-CCR5細(xì)胞的無(wú)毒質(zhì)量分?jǐn)?shù)篩選結(jié)果

黃芩、貓眼草、連翹單味中藥對(duì)MAGI-CCR5細(xì)胞的毒性較小,高劑量有毒性作用,低劑量無(wú)毒作用(P<0.05),甚至部分藥物的最低劑量對(duì)細(xì)胞有促進(jìn)增殖作用(P>0.05)。藥物對(duì)細(xì)胞的抑制增殖作用呈現(xiàn)出劑量依賴性趨勢(shì)。黃芩、貓眼草、連翹均在藥物稀釋比例為1∶100 000時(shí)對(duì)細(xì)胞的增殖不再具有抑制作用,因此選擇2.17 mg/L黃芩、3.45 mg/L貓眼草、2.50 mg/L連翹作為其抗病毒研究起始劑量。見(jiàn)表2。

表2 黃芩、貓眼草、連翹對(duì)MAGI-CCR5細(xì)胞的無(wú)毒質(zhì)量分?jǐn)?shù)篩選結(jié)果

2.3 3種單味中藥體外對(duì)假病毒感染MAGI-CCR5的抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果

黃芩、貓眼草、連翹單味中藥均有體外抗HIV假病毒作用,且與質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈正相關(guān)趨勢(shì),分別黃芩2.17 mg/L、貓眼草3.45 mg/L、連翹2.50 mg/L時(shí)表現(xiàn)出最高抑制率,依次是41.87%、37.38%、14.12%。見(jiàn)表3。

表3 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)黃芩、貓眼草、連翹對(duì)HIV假病毒的抑制率對(duì)比

3 討 論

研究表明,HIV-1假病毒與活病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的很多環(huán)節(jié)相同,因此在抗HIV-1藥物的篩選、藥物抗病毒效果評(píng)價(jià)等研究中,HIV假病毒檢測(cè)系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用[9]。多項(xiàng)研究利用HIV-1假病毒在細(xì)胞水平進(jìn)行抗HIV-1藥物的篩選、對(duì)患者體內(nèi)HIV-1毒株進(jìn)行耐藥性分析,取得較好效果[10-12]。本研究基于重組質(zhì)粒PLAI和重組質(zhì)粒JRFC共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,成功包裝出假病毒,建立抗HIV-1假病毒篩選平臺(tái),與活病毒相比具有較高的生物安全性,適用于普通實(shí)驗(yàn)室對(duì)抗HIV-1藥物篩選的需求。在此模型中,不同稀釋度的假病毒感染MAGI-CCR5細(xì)胞后,熒光素酶的表達(dá)水平與病毒稀釋度呈明顯的劑量依賴效應(yīng),較靈敏地體現(xiàn)了HIV-1的復(fù)制水平,其特點(diǎn)符合藥理篩選模型的要求。

病毒復(fù)制的晚期步驟發(fā)生在報(bào)告基因表達(dá)之后,故檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)不能反映藥物對(duì)病毒復(fù)制晚期的抑制情況,該方法不適用于蛋白酶等晚期過(guò)程抑制劑的活性篩選[13-14]。由于課題組所聯(lián)系HIV/AIDS患者均為河南地區(qū)人員,大部分為HIV-1 B’型病毒感染,因此研究中只采用了含B亞型ENV基因的質(zhì)粒制備假病毒毒株,所建立的假病毒篩選體系符合此型HIV/AIDS治療的中藥及臨床中藥復(fù)方的抗病毒篩選需求,后期可制備多種類型假病毒毒株以對(duì)藥物進(jìn)行更全面篩選,進(jìn)一步優(yōu)化和完善篩選平臺(tái)。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示,黃芩的主要有效成分是黃酮類成分,其中黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素在抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒及免疫調(diào)節(jié)等方面具有較好效果[15-16]。連翹的主要成分為連翹苷和連翹酯苷,具有抗炎、抑菌、抗病毒、抗氧化、保肝、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等活性,主治熱病初起、風(fēng)熱感冒、發(fā)熱、心煩、咽喉腫痛等[17-18]。貓眼草中含有萜類、黃酮類、甾醇、揮發(fā)油和酚類等多種化學(xué)成分,具有祛寒、鎮(zhèn)咳、平喘、拔毒止癢、利尿消腫之功。貓眼草內(nèi)服有抗菌抗病毒作用,可用于治療呼吸系統(tǒng)疾病,還可抗腫瘤;外用可治療淋巴結(jié)結(jié)核、皮癬等疾病[19-20]。多種清熱解毒中藥如紫花地丁[21]、夏枯草[22-23]、穿心蓮[24-25]、黃芩[30]、魚(yú)腥草[26]、金銀花[27-28]等對(duì)HIV病毒的增殖具有抑制作用。紫花地丁的二甲基亞砜、夏枯草的含硫多糖、穿心蓮的內(nèi)酯具有抗HIV病毒作用的成分。通過(guò)對(duì)中藥有效成分的藥理分析,發(fā)現(xiàn)了諸多抗HIV活性物。如：栝樓中分離出的天花粉蛋白目前已被用于AIDS的臨床治療[29]。又如：黃芩苷能夠抑制HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的活性,且對(duì)酶活性的抑制作用有濃度依賴關(guān)系;其對(duì)HIV-1假病毒的抑制作用隨著給藥濃度的增高而增大,100 μmol/L黃芩苷的抑制率為60%左右[30]。

近年來(lái),中醫(yī)藥防治AIDS在中藥復(fù)方的研發(fā)方面取得了較好的成果[31]。益艾康膠囊[32-33]、唐草片[34-35]、復(fù)方三黃散[36-37]、艾寧顆粒[38-39]等中藥復(fù)方制劑在臨床上應(yīng)用較為廣泛且臨床效果確切。同時(shí)實(shí)驗(yàn)研究證明這些中藥復(fù)方具有較好的抗病毒作用,使CD4淋巴細(xì)胞的比例升高、患者的機(jī)體免疫能力明顯改善[40]。本研究前期建立合理的假病毒平臺(tái),利用此平臺(tái)對(duì)不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的黃芩、貓眼草、連翹單味中藥進(jìn)行篩選,通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)檢測(cè),觀察藥物對(duì)HIV假病毒影響,體外篩選其抗病毒作用。結(jié)果顯示：?jiǎn)挝吨兴廃S芩、貓眼草具有較好的體外抗HIV病毒的作用,且抗病毒作用與藥物質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系;連翹的抗HIV病毒作用相對(duì)較弱。此結(jié)果對(duì)中藥的有效成分研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù),為開(kāi)發(fā)我國(guó)自主產(chǎn)權(quán)的抗AIDS天然藥物提供了數(shù)據(jù)支撐。