基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接技術(shù)探討仙靈骨葆膠囊治療骨質(zhì)疏松癥的潛在機制※

趙燦斌,郭超,李曉陽,閆小龍,管東輝

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué),山東 濟南 250014;2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,山東 濟南 250000)

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)是一種以骨小梁減少、骨量降低、骨皮質(zhì)變薄為主要特征,易致骨脆性增加的全身性代謝性骨病[1]。隨著社會經(jīng)濟的不斷發(fā)展,我國OP患者的數(shù)量逐漸上升,該人群因骨密度下降、骨強度降低,更易在損傷中發(fā)生骨折。西醫(yī)治療OP包括降鈣素、甲狀旁腺素、維生素D等藥物[2]。然而對于特定西藥治療OP的實驗結(jié)論的普適性有待商榷。相比西藥,中藥尤其是中藥復(fù)方有多層次、寬領(lǐng)域的治療及調(diào)節(jié)作用,在防治OP的過程中具有較大的優(yōu)勢。

OP在中醫(yī)中歸屬“骨痿”(《素問·痿論》)、“骨枯”(《素問·玉機真臟論》)、“骨痹”(《素問·長刺節(jié)論》)之類。中醫(yī)認為,五臟中的腎與骨的生長發(fā)育及生理功能密切相關(guān)。腎藏精,精生髓,髓實則骨壯,故腎中精氣的盛衰在骨骼生長發(fā)育過程中起到重要的作用。OP患者的骨代謝指標(biāo)與脾腎陽虛證、腎陽虛證等中醫(yī)證候密切相關(guān)[3]。傳統(tǒng)中醫(yī)理論與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論相結(jié)合,對“補腎壯骨”“補益肝腎”“調(diào)補脾腎”等中醫(yī)理論指導(dǎo)下的中藥防治OP的研究提供新的思路[4]。仙靈骨葆膠囊成分包括淫羊藿、續(xù)斷、丹參、知母、補骨脂、地黃,治療OP療效較好。臨床試驗證明,仙靈骨葆膠囊對原發(fā)性O(shè)P、絕經(jīng)后女性O(shè)P等有安全且全面的作用,可有效改善L2～4、股骨頸及股骨粗隆等部位的骨密度[5-6]。本文運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接技術(shù),通過探究仙靈骨葆膠囊的藥物成分及核心蛋白、靶點、信號通路等,進一步揭示仙靈骨葆膠囊治療OP的機制。

1 資料與方法

1.1 藥物化合物、作用靶點及靶點基因的篩選 仙靈骨葆膠囊由淫羊藿、續(xù)斷、丹參、知母、補骨脂、地黃組成。本文藥物化合物通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(http://tcmsp-e.com)及TCMID數(shù)據(jù)庫(http://47.100.169. 139:8000/tcmid)獲取。將獲得的化合物導(dǎo)入PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)中獲取其2D結(jié)構(gòu)的SDF文件。將收集好的化合物SDF文件導(dǎo)入SwissTargetADME(http://www.swissadme.ch/)進行藥物代謝動力學(xué)篩選,以胃腸道吸收率(GI absorption)為高(high),且藥物類似性(Druglikeness)中Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge 5個指標(biāo)中“yes”的數(shù)量≥2為篩選標(biāo)準(zhǔn)。將符合篩選標(biāo)準(zhǔn)的化合物SDF文件導(dǎo)入SwissTargetPrediction(www. swisstargetprediction.ch)中進行靶點預(yù)測,以Probability≥0.4為篩選條件獲得符合條件的靶點信息,然后將所得靶點輸入Uniprot(https://www.uniprot. org)數(shù)據(jù)庫,選擇人類(Homo sapiens)為物種獲取靶點對應(yīng)的基因。經(jīng)過篩選獲得淫羊藿、續(xù)斷、丹參、知母、補骨脂、地黃的有效化合物、作用靶點及靶點基因,并記錄該數(shù)據(jù)信息。

1.2 OP相關(guān)疾病的靶點及靶點基因的篩選 在DrugBank數(shù)據(jù)庫(https://go.drugbank.com)、DisGeNET數(shù)據(jù)庫(https://www.disgenet.org)以“osteoporosis”為關(guān)鍵詞進行檢索,記錄其靶點的名稱,并將所得靶點導(dǎo)入Uniprot數(shù)據(jù)庫,選擇人類(Homo sapiens)為物種獲取靶點基因。

1.3 藥物靶點與OP靶點的Venn分析 將仙靈骨葆膠囊藥物化合物的作用靶點與OP的疾病基因靶點導(dǎo)入DrawVennDiagram(bioinformatics.psb.ugent.be/ webtools/Venn/)進行Venn分析,得到兩者共有的靶點,即為仙靈骨葆膠囊治療OP的有效靶點。

1.4 構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)(PPI) 將上述1.3步驟中得到的交集靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(https://www.string-db.org),構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),將其結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.7.0進行拓撲計算,根據(jù)節(jié)點度值分布(node degreedistribution)、介度中心度(betweenness centrality)和接近中心度(closeness centrality)3個參數(shù)進行遴選,選取三者同時在中位數(shù)之上的靶點作為仙靈骨葆膠囊治療OP的關(guān)鍵核心靶點,導(dǎo)出計算后數(shù)據(jù)進行蛋白質(zhì)篩選,得到核心蛋白,并再次構(gòu)建核心蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.5 獲取核心有效化合物 通過1.4中得到的核心靶點,篩選出核心靶點所對應(yīng)的化合物為核心有效化合物,剔除與核心靶點不對應(yīng)的化合物。通過對比1.1中所記錄的數(shù)據(jù)信息,得到與核心靶點對應(yīng)的核心有效化合物,得到其對應(yīng)的核心靶點數(shù)目的排名。

1.6 GO功能富集及KEGG通路富集分析 將1.4所得到的核心靶點信息導(dǎo)入OmicShare Tools分析工具,選擇GO功能富集及KEGG通路富集分析,得到結(jié)果圖像并將其導(dǎo)出。

1.7 分子對接驗證 選取1.5中所對應(yīng)的核心靶點數(shù)目排名前4位的化合物,從TCMSP及TCMID數(shù)據(jù)庫中取得化合物的分子結(jié)構(gòu),并導(dǎo)入PubChem中獲得化合物的SDF文件,通過Open Babel3.1.1轉(zhuǎn)化為mol2格式。從核心靶點PPI網(wǎng)絡(luò)中篩選Degree值排名前3位的靶點,由PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org)獲取化合物的3D蛋白結(jié)構(gòu)的pdb格式文件,上述兩者的分子結(jié)構(gòu)文件使用Auto Dock Tools 1.5.6軟件轉(zhuǎn)換為pdbqt格式文件,利用Auto Dock 4.2.6軟件進行分子對接。通過Pymol 2.4.0 軟件將分子對接最穩(wěn)定的化合物與基因靶點蛋白進行可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 仙靈骨葆膠囊化合物成分的篩選 在TCMSP數(shù)據(jù)庫與TCMID中獲得的化合物通過SwissTargetADME篩選,共得到127種化合物成分,其中藥物獨有的成分如下:補骨脂27種、丹參57種、地黃5種、續(xù)斷5種、淫羊藿18種、知母9種;藥物共有的成分如下:丹參與淫羊藿共有2種,知母與淫羊藿共有2種,續(xù)斷、淫羊藿、地黃共有1種,知母與地黃共有1種。根據(jù)127種化合物成分的SDF文件導(dǎo)入SwissTargetPrediction進行靶點預(yù)測,找到其對應(yīng)的作用靶點蛋白并與Uniprot數(shù)據(jù)庫選擇人類(Homo sapiens)進行基因靶點對比,剔除重復(fù)、無效的靶點,共得到360個靶點。

2.2 疾病靶點獲取結(jié)果 通過DrugBank及DisGeNET數(shù)據(jù)庫中檢索到與OP相關(guān)的基因靶點分別為340、1 098個,通過相關(guān)性評價得分遴選,剔除重復(fù)疾病基因靶點,共得到1 234個OP相關(guān)基因靶點。

2.3 藥物與疾病靶點的Venn圖建立 將2.1及2.2得到的1 234個疾病相關(guān)的基因靶點與360個有效藥物的作用靶點導(dǎo)入DrawVennDiagram進行Venn分析,共得到仙靈骨葆膠囊潛在作用于OP的118個靶點。見圖1(掃描題目右側(cè)二維碼查看)。

2.4 PPI的構(gòu)建 將2.3得到的藥物與疾病的交集靶點基因?qū)隨tring數(shù)據(jù)庫,物種設(shè)置為人類(Homo sapiens),運行后得到PPI網(wǎng)絡(luò),并隱藏3個未參與蛋白相互作用的靶點,共有115個靶點蛋白參與PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。見圖2(掃描題目右側(cè)二維碼查看)。

2.5 核心靶點篩選 從String數(shù)據(jù)庫平臺下載PPI網(wǎng)絡(luò)文件,經(jīng)Cytoscape 3.7.0軟件渲染后,導(dǎo)出經(jīng)過網(wǎng)絡(luò)拓撲屬性分析計算后的Excel文件,利用Excel函數(shù)公式篩選仙靈骨葆膠囊的核心靶點。計算后可知115個靶點度值中位數(shù)為28,介度中心度的中位數(shù)為2.569×10-3,接近中心度的中位數(shù)約為0.558。經(jīng)過篩選,3個數(shù)值在中位數(shù)以上的靶點共有47個,度值較高的前6位分別為TP53(83)、TNF(83)、AKT1(80)、IL6(79)、HIF1A(72),JUN(72),這些靶點在PPI網(wǎng)絡(luò)中處于關(guān)鍵位置,可能在仙靈骨葆膠囊治療OP的過程中起到關(guān)鍵作用,將此47個靶點同上操作,導(dǎo)入String數(shù)據(jù)平臺構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),見圖3(掃描題目右側(cè)二維碼查看)。在2.1記錄的信息文件中尋找將47個核心靶點及所映射的化合物及中藥數(shù)據(jù),通過數(shù)據(jù)對比得到與核心靶點對應(yīng)的化合物。其中對應(yīng)靶點數(shù)目排名前4位的是木犀草素(luteolin)、山柰酚(kaempferol)、槲皮素(quercetin)和脫水淫羊藿素(anhydroicaritin),這4種化合物對應(yīng)的靶點數(shù)目從高到低依次是26、24、14、6。

2.6 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析 將仙靈骨葆膠囊治療OP的47個核心靶點導(dǎo)入g:Profiler(https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost),將靶點基因ID轉(zhuǎn)化為ENSG ID,然后將轉(zhuǎn)換好ID的靶點導(dǎo)入OmicShare Tools進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析,經(jīng)過校正P值,P<0.05后,得到10個分子功能類別,其中包括核受體活性(nuclear receptor activity)、雙鏈DNA結(jié)合(double-stranded DNAbinding)等;得到10個生物學(xué)過程,其中包括對含氧化物的反應(yīng)(responseto oxygen-containing compound)、對細胞因子的反應(yīng)(response to cytokine)、細胞增殖調(diào)控(regulationof cell proliferation)等;得到10個細胞成分,其中包括膜筏(membrane raft)、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物(transcription factor complex)等。P值越小代表富集程度越高,遴選出每個類別富集程度最高的10個結(jié)果,使用OmicShare Tools工具建立氣泡圖,見圖4-1、4-2、4-3(掃描題目右側(cè)二維碼查看)。KEGG通路富集分析得到127條信號通路,其中根據(jù)閾值P<0.01進行篩選,取排名前20位的通路,包括腫瘤壞死因子信號通路(TNF signaling pathway)、IL-17信號通路(IL-17 signaling pathway)等,建立氣泡圖,見圖5(掃描題目右側(cè)二維碼查看)。

2.7 藥物化合物與核心靶點的分子對接 核心靶點數(shù)目排名前4位的化合物是木犀草素、山柰酚、槲皮素和脫水淫羊藿素,核心靶點PPI網(wǎng)絡(luò)中度值前3位的靶點分別是TP53、TNF、AKT1,見表1。核心靶點的蛋白運用PDB數(shù)據(jù)庫(https://www1.rcsb.org/)獲得PDB文件,Pymol 2.4.0 軟件打開,進行脫水等一系列處理;化合物從TCMSP與TCMID數(shù)據(jù)庫中找到對應(yīng)的PubChem ID,并導(dǎo)入PubChem數(shù)據(jù)庫獲得SDF文件,使用Open Babel 3.1.1軟件將文件從SDF格式轉(zhuǎn)化為mol2格式,并用 Auto Dock 4.2.6 軟件打開處理后的化合物及蛋白質(zhì)文件,并進行進一步處理,處理完成后將化合物與蛋白質(zhì)兩兩進行分子對接處理。就分子對接而言,結(jié)合能(bindingenergy,kcal/mol)越小,表明化合物與蛋白質(zhì)之間結(jié)合得越牢固,其數(shù)值小于-4.25 kcal/mol時,表示化合物與蛋白質(zhì)之間有一定結(jié)合活性。由表1可知,所有對接能都小于-4.25 kcal/mol,說明化合物與靶蛋白之間均有結(jié)合活性[7]。通過Pymol 2.4.0 軟件對上述化合物與蛋白質(zhì)進行分子對接可視化分析,見圖6-1～圖6-12(掃描題目右側(cè)二維碼查看)。通過分子對接發(fā)現(xiàn),脫水淫羊藿素與活性位點附近的GLU-40、LYS-39、LEU-52這3個氨基酸形成氫鍵結(jié)合到AKT1,與活性位點附近的ALA-134、ILE-136、ASN-46這3個氨基酸形成氫鍵結(jié)合到TNF,與活性位點附近的LSY-132、GLU-271、ARG-248、GLN-165這4個氨基酸形成氫鍵結(jié)合到TP53。山柰酚與活性位點附近的GLN-47、GLU-40、LYS-39這3個氨基酸形成氫鍵結(jié)合到AKT1,與活性位點附近的TRP-28、ASN-46、ALA-134、ILE-136這4個氨基酸形成氫鍵結(jié)合到TNF,與活性位點附近的GLN-144、CYS-229、GLU-224、PRO-222、GLU-198這5個氨基酸形成氫鍵結(jié)合到TP53。木犀草素與活性位點附近的LEU-78、GLN-61、ARG-76這3個氨基酸形成氫鍵結(jié)合到AKT1,與活性位點附近的ASN-34、PHE-144、GLN-149、VAL-150這4個氨基酸形成氫鍵結(jié)合到TNF,與活性位點附近的GLU-285、ARG-248、GLN-165、LYS-132這4個氨基酸形成氫鍵結(jié)合到TP53。槲皮素與活性位點附近的LYS-8、GLU-98、GLU-9這3個氨基酸形成氫鍵結(jié)合到AKT1,與活性位點附近的ALA-33、PHE-144、GLN-149、VAL-150這4個氨基酸形成氫鍵結(jié)合到TNF,與活性位點附近的ARG-248、LYS-132、GLU-285、ARG-273、GLN-165這5個氨基酸形成氫鍵結(jié)合到TP53。

表1 仙靈骨葆膠囊藥物化合物與核心靶點的分子對接表(kcal/mol)

3 討論

本研究結(jié)果顯示,仙靈骨葆膠囊發(fā)揮療效的主要化合物包括木犀草素、山柰酚、槲皮素和脫水淫羊藿素等。研究表明,RA NLRP3炎性小體過表達可被木犀草素潛在抑制,且后者可降低血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)等蛋白的表達,增強骨保護素(OPG)蛋白表達,進而對骨關(guān)節(jié)起到保護作用[8]。木犀草素可有效減輕氧化損傷,其作用機制可能與潛在保護MC3T3-E1類成骨細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)[9]。骨丟失過程可被糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo),山柰酚可以通過保護成骨細胞存活以抑制此過程的發(fā)生[10]。槲皮素能通過增加骨小梁的結(jié)構(gòu)和數(shù)量、增加骨密度以預(yù)防及治療失用性O(shè)P,其作用途徑可能與抑制ERK1/2、MAPK mRNA和蛋白的表達,進而抑制ERK1/2-MAPK信號通路有關(guān)[11]。此外,有實驗證明,槲皮素可通過升高BMP2和Smad4的表達水平,進而促進成骨細胞分化以緩解OP[12]。脫水淫羊藿素具有抗氧化活性的作用,研究表明,1×10-5mol-1濃度的脫水淫羊藿素能提高成骨細胞中堿性磷酸酶的活性,增強成骨細胞的生理功能,可以提高BMP-2、OSX和Runx-2等與成骨細胞成熟礦化相關(guān)因子的mRNA表達,進而增加能促進骨基質(zhì)礦化的鈣鹽[13-14]。綜上所述,仙靈骨葆膠囊中一些潛在分子活性成分通過抑制破骨細胞的生成、促進骨細胞成熟礦化作用等對OP起到預(yù)防及治療的作用。

然而當(dāng)前利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究中藥、中藥方劑的作用機制尚存在諸多不足。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基于現(xiàn)代生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng),適用于單一化學(xué)成分的預(yù)測,但不適合中藥復(fù)雜系統(tǒng)的研究,中藥不同于化學(xué)成分單一的化學(xué)藥,中藥方劑更不是化學(xué)成分的簡單加和[15]。在篩選所謂有效成分的參數(shù)設(shè)置中,除口服生物利用度(OB)和/或類藥性(DL)外,其他諸多性質(zhì)也會影響藥物活性,在確定有效成分時需全面考慮這些影響因素,而網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫基于吸收、分布、代謝、排泄(ADME)等數(shù)據(jù)處理方式的篩選,忽略了成分含量對藥效的影響,忽略了中藥成分間的相互作用,包括相互調(diào)節(jié)體內(nèi)吸收和體內(nèi)過程等作用,忽略了藥物成分可能通過調(diào)節(jié)腸道菌群而發(fā)揮間接治療作用,尤其體現(xiàn)于忽略了滋補類中藥的多糖類成分的菌群調(diào)節(jié)作用等?；谝陨喜蛔?導(dǎo)致網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)推測出的所謂活性成分與基礎(chǔ)研究已經(jīng)證實的重要活性成分有很大出入,導(dǎo)致所得結(jié)果與真實情況不符。仙靈骨葆膠囊由淫羊藿、續(xù)斷、丹參、知母、補骨脂、地黃組成。研究表明,0．10 μmol/L濃度的異補骨脂素可有效促進成骨細胞的增殖分化[16];中藥地黃中梓醇、桃葉珊瑚苷、毛蕊花糖苷可增強成骨細胞中堿性磷酸酶活性,在一定程度上可加速破骨細胞的凋亡[17];淫羊藿的活性成分淫羊藿總黃酮可促進骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化,提高骨修復(fù),促進骨形成[18]。此外,大鼠體外細胞實驗研究表明,續(xù)斷皂苷可促進骨鈣素升高,提高成骨細胞堿性磷酸酶活性[19];知母皂苷元能促進骨形成,抑制骨吸收,調(diào)節(jié)骨代謝[20];丹參素可以增加成骨細胞分化相關(guān)基因、堿性磷酸酶及骨鈣素的表達,阻止OP的發(fā)生[21]。以上藥物化合物都已經(jīng)被證實對OP的防治有明顯的作用。本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)推測出的有效成分主要是一些黃酮類成分,如槲皮素、山柰酚、木犀草素等,與已經(jīng)研究證實的藥物化合物相差甚遠。由此而見,依托于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)手段進行藥物的理論分析仍存在較大的局限性,更加精確的藥物作用機制還需進一步實驗證明。