椎間盤丸治療腰椎間盤退變的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)研究

陳璐璐,李 洋,呂文娟,張 迪

(河南省洛陽正骨醫(yī)院 河南省骨科醫(yī)院脊柱外三科,鄭州 450000)

下腰痛(low back pain, LBP)是脊柱外科最常見的疾病之一,在成年人群中,LBP的發(fā)病率為10%～30%,65%～80%的人在一生中曾受到LBP的困擾[1]。LBP嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量,降低患者的勞動(dòng)能力,給家庭和社會(huì)造成巨大的負(fù)擔(dān)。引起LBP的原因有很多,其中腰椎間盤退變是最常見原因之一[2]。大部分腰椎間盤源性LBP經(jīng)6～12周的保守治療可以取得滿意的效果[3-4]。椎間盤源性LBP的保守治療方法包括臥床休息[5]、藥物治療[6]、運(yùn)動(dòng)療法[7]、硬膜外注射[8]、腰椎牽引[9]、手法治療[10]等。但是經(jīng)保守治療后臨床癥狀的復(fù)發(fā)率仍高達(dá)25%[3]。此外,治療椎間盤源性LBP的藥物多為對(duì)癥治療,且長(zhǎng)時(shí)間使用均存在或多或少的不良反應(yīng)。中藥在臨床上被廣泛應(yīng)用于腰椎間盤退變性疾病地治療,并取得了不錯(cuò)的臨床效果[11-12]。椎間盤丸(zhuijianpan pill,ZJPW)是河南省洛陽正骨醫(yī)院治療腰椎間盤退變的協(xié)定處方,該方由當(dāng)歸、桂枝、細(xì)辛、黃芪、白芍、延胡索、威靈仙、五加皮、牛膝、甘草等藥物組成,具有溫通經(jīng)脈、養(yǎng)血散寒、理氣止痛之功效。ZJPW在臨床應(yīng)用中取得了良好的療效,但是其抑制腰椎間盤退變的分子機(jī)制尚未完全闡明。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是近年來發(fā)展起來的新興學(xué)科,其以系統(tǒng)生物學(xué)為基礎(chǔ),整合了系統(tǒng)生物學(xué)、多向藥理學(xué)、生物信息學(xué)和計(jì)算機(jī)科學(xué),為尋找藥物分子和疾病的相互關(guān)系提供了新的手段[13]。中醫(yī)理論注重整體觀念,而單一的藥物成分研究不能充分揭示中藥的作用機(jī)制,因此運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)挖掘復(fù)方中藥治療疾病的分子機(jī)制逐漸受到廣大臨床醫(yī)生的關(guān)注。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法篩選ZJPW治療腰椎間盤退變的主要成分和作用靶點(diǎn),并利用分子對(duì)接技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。最后使用CIBERSORT工具計(jì)算免疫細(xì)胞與致病基因的相關(guān)性,從免疫浸潤(rùn)角度探討藥物作用的分子機(jī)制。為ZJPW用于腰椎間盤退變的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 ZJPW有效活性成分的確定 按照既往文獻(xiàn)的方法[14],使用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)篩選ZJPW組方中10味中藥當(dāng)歸、桂枝、細(xì)辛、黃芪、白芍、延胡索、威靈仙、五加皮、牛膝、甘草的有效成分。以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)>30%,類藥性(drug-likeness,DL)>0.18為標(biāo)準(zhǔn)篩選出該組方中可能有效的化學(xué)成分。在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)和drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)(https://go.drugbank.com/)中檢索這些活性成分對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)。最后利用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)UniProt(https://www.uniprot.org/)將蛋白靶點(diǎn)轉(zhuǎn)換成對(duì)應(yīng)的基因名稱,得到ZJPW中各藥物成分的靶點(diǎn)基因。

1.2 獲取腰椎間盤退變的相關(guān)基因 在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.Genecards.org)、靶向治療數(shù)據(jù)庫(kù)(therapeutic target Database,TTD)(http://db.idrblab.net/ttd/)和藥物基因組學(xué)知識(shí)庫(kù)(pharmacogenomics knowledgebase,PharmGKB)(https://www.pharmgkb.org/)中檢索腰椎間盤退變的致病基因,合并并刪除重復(fù)基因。以nucleus pulposus[All Fields] AND “Homo sapiens”[porgn] AND “Expression profiling by array”[Filter]為檢索式在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)進(jìn)行檢索,選擇GSE15227作為研究對(duì)象,提取椎間盤Ⅱ級(jí)退變樣本5個(gè),Ⅳ級(jí)退變樣本3個(gè),以P<0.05和log|FC|>1為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)基因。將篩選出的差異表達(dá)基因與之前獲得的致病基因取交集,得到腰椎間盤退變的致病基因。再將藥物靶點(diǎn)基因和致病基因取交集,最終得到ZJPW有效成分的作用靶點(diǎn)。

1.3 構(gòu)建“藥物-成分-作用靶點(diǎn)”關(guān)系網(wǎng)絡(luò) 將藥物、活性成分和作用靶點(diǎn)之間的關(guān)系導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1 軟件,構(gòu)建“藥物-成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò),用“節(jié)點(diǎn)”表示藥物、活性成分和作用靶點(diǎn),用“邊”表示節(jié)點(diǎn)之間的相互作用,節(jié)點(diǎn)大小和邊的粗細(xì)表示度值的大小。

1.4 基因本體論(gene ontology,GO)功能和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopediaof genesand genome,KEGG)富集分析 使用R 軟件的“clusterProfiler”包和“pathview”包對(duì)ZJPW治療腰椎退變的靶點(diǎn)基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析。其中GO分析包括生物過程(biological process,BP)、細(xì)胞組分(cellular component,CC) 和分子功能(molecular function,MF)3部分。以FDR<0.05作為GO和KEGG富集分析的篩選條件,取排名靠前的10個(gè)條目分別繪制氣泡圖。對(duì)GSE15227的全部基因進(jìn)行差異分析后,以“c2.cp.v7.2.symbols.gmt”為參考基因集,以FDR<0.25且p.adjust<0.05為條件進(jìn)行GSEA富集分析。

1.5 構(gòu)建蛋白質(zhì)- 蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò) 在STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)中,以置信度分?jǐn)?shù)(Score)> 0.9 為篩選條件,構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。將得到的tsv文件導(dǎo)入Cytoscape3.9.1 軟件,分別使用CytoNCA插件(以度值進(jìn)行排序,取度值>10的基因)和MCODE插件(以節(jié)點(diǎn)評(píng)分cut-off值=0.2、K-Core值=2、度值cut-off =2為默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行聚類關(guān)聯(lián)分析,取得分最高的聚類)篩選ZJPW治療腰椎間盤退變的關(guān)鍵基因。將兩種方法篩選得到的關(guān)鍵基因取交集,最終得到的交集基因被認(rèn)為是ZJPW治療腰椎間盤退變的Hub基因。

1.6 分子對(duì)接驗(yàn)證 選取“藥物-成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中連接度值排名前10 位的活性成分分別與Hub基因進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。在PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載前10位活性成分的2D 結(jié)構(gòu)并進(jìn)行3D轉(zhuǎn)換。在PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.rcsb.org/)下載Hub基因?qū)?yīng)蛋白的3D 結(jié)構(gòu),利用Pymol 軟件和AutodockTools-1.5.6軟件處理后保存為pdbqt 格式。在AutodockTools-1.5.6 軟件中設(shè)置蛋白受體的口袋參數(shù),通過AutodockVina進(jìn)行分子對(duì)接,在分子對(duì)接過程中結(jié)合能越低代表受體與配體的親和力越好。將分子對(duì)接的結(jié)合能進(jìn)行評(píng)分并繪制熱圖。

1.7 免疫浸潤(rùn)分析 將從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)上傳到CIBERSORT網(wǎng)站,得到免疫細(xì)胞浸潤(rùn)矩陣。使用“ggplot2”包繪制Ⅱ級(jí)退變組和Ⅳ級(jí)退變組免疫細(xì)胞浸潤(rùn)差異的小提琴圖。再以Hub基因的表達(dá)中位數(shù)將全部樣本分為Hub基因高表達(dá)組和Hub基因低表達(dá)組,同樣的方法繪制Hub基因高低表達(dá)組免疫細(xì)胞浸潤(rùn)差異的小提琴圖。最后分析Hub基因和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性,并使用“ggpubr”包繪制棒棒糖圖。

2 結(jié)果

2.1 ZJPW活性成分及靶基因 共篩選得到“白芍”活性成分13個(gè)、“五加皮”活性成分16個(gè)、“當(dāng)歸”活性成分2個(gè)、“甘草”活性成分92個(gè)、“桂枝”活性成分7個(gè)、“黃芪”活性成分19個(gè)、“牛膝”活性成分20個(gè)、“威靈仙”活性成分7個(gè)、“細(xì)辛”活性成分8個(gè)、“延胡索”活性成分49個(gè)(見表1)。在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)和drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)中得到“白芍”作用靶點(diǎn)990個(gè)、“五加皮”作用靶點(diǎn)17個(gè)、“當(dāng)歸”作用靶點(diǎn)864個(gè)、“甘草”作用靶點(diǎn)2 507個(gè)、“桂枝”作用靶點(diǎn)2 402個(gè)、“黃芪”作用靶點(diǎn)953個(gè)、“牛膝”作用靶點(diǎn)1 034個(gè)、“威靈仙”作用靶點(diǎn)310個(gè)、“細(xì)辛”作用靶點(diǎn)1 668個(gè)、“延胡索”作用靶點(diǎn)1 549個(gè)。利用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)將靶點(diǎn)轉(zhuǎn)換成對(duì)應(yīng)的基因名稱,去除重復(fù)基因后,共得到ZJPW活性成分的靶基因共1 283個(gè)。

表1 ZJPW的藥物組成及活性成分

2.2 ZJPW治療腰椎間盤退變的潛在作用靶點(diǎn) 在GeneCards、OMIM和PharmGKB數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索得到腰椎間盤退變的靶點(diǎn)基因2 458個(gè)。在GSE15227數(shù)據(jù)集中得到腰椎間盤Ⅱ度退變和Ⅳ度退變樣本的差異表達(dá)基因1 104個(gè),選取表達(dá)譜中表達(dá)上調(diào)和下調(diào)排名前20基因繪制熱圖(見圖1A)。將上述基因取交集,共得到271個(gè)腰椎間盤退變相關(guān)的疾病靶點(diǎn)基因(見圖1B)。再將ZJPW活性成分的靶基因與腰椎間盤退變的致病基因取交集,共得到23個(gè)基因,這23個(gè)基因即為ZJPW治療腰椎間盤退變的潛在作用靶點(diǎn)(見圖1C)。

注：A:GSE15227數(shù)據(jù)集中椎間盤Ⅱ度退變和Ⅳ度退變樣本的差異表達(dá)基因;B:GeneCards、OMIM 和PharmGKB數(shù)據(jù)庫(kù)中的致病基因與GSE15227數(shù)據(jù)集中的差異基因取交集;C:藥物作用靶點(diǎn)與致病基因取交集;D:“藥物-活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。

2.3 “藥物-活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將藥物、活性成分和作用靶點(diǎn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件,繪制“藥物-活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖,共得到170個(gè)節(jié)點(diǎn),384條邊(圖1D)。根據(jù)連接度值大小排序,排在前10位的化合物是槲皮素、漢黃芩素、β-谷甾醇、黃芩黃素、山柰酚、甘草查爾酮A、芝麻素、尼森香豌豆紫檀酚、7-O-甲基-異微凸劍葉莎醇和隱品堿。這些成分主要來源于牛膝、細(xì)辛、白芍等藥物。見表2。

表2 排名前10位的活性成分及來源藥物

2.4 GO、KEGG和GSEA富集分析 對(duì)腰椎間盤退變的23個(gè)潛在治療靶點(diǎn)基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析,篩選條件為FDR<0.05。在BP方面,靶點(diǎn)基因主要富集在泌乳(lactation)、蛋白質(zhì)磷酸化的調(diào)節(jié)(regulation of protein phosphorylation)、對(duì)外來生物刺激的反應(yīng)(response to xenobiotic stimulus)和血管生成(angiogenesis);在CC方面,靶點(diǎn)基因主要富集在細(xì)胞外空間(extracellular space)、細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔(endoplasmic reticulum lumen)和細(xì)胞外區(qū)域(extracellular region);在MF方面,靶點(diǎn)基因主要富集在酶結(jié)合(enzyme binding)、相同的蛋白結(jié)合(identical protein binding)、蛋白結(jié)合(protein binding)和蛋白酶結(jié)合(protease binding)(見圖2A)。從KEGG 通路富集分析中可以看出,這些基因主要富集在糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications),蛋白聚糖在癌癥(proteoglycans in cancer),PI3K-Akt 信號(hào)通路以及人乳頭瘤病毒感染(見圖2B)。GSEA富集分析共得到83個(gè)符合條件的數(shù)據(jù)集,這些基因主要富集在固有免疫、VEGFR2信號(hào)通路、感染性疾病、選擇性自噬和膠原蛋白相關(guān)信號(hào)通路(見圖2C)。

注：A:藥物靶點(diǎn)基因的GO分析;B:藥物作用靶點(diǎn)的KEGG分析;C:GSE15227數(shù)據(jù)集中差異表達(dá)基因的GSEA分析。

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 在STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得藥物靶點(diǎn)基因的PPI網(wǎng)絡(luò),將得到的結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件進(jìn)行可視化和聚類篩選(見圖3A)。利用Cytoscape中的“Network analyzer”工具計(jì)算無方向PPI網(wǎng)絡(luò)中每個(gè)節(jié)點(diǎn)的評(píng)分,得到每個(gè)節(jié)點(diǎn)的度值。用節(jié)點(diǎn)的大小表示度值,用邊的寬度表示這條邊的綜合得分值,篩選出度值≥15的節(jié)點(diǎn),共24個(gè)節(jié)點(diǎn),166條邊(見圖3B)。隨后分別使用MCODE插件和CytoNCA分別篩選Hub基因,在MCODE插件中得分最高的是聚類包含9個(gè)節(jié)點(diǎn)(見圖3C)。在CytoNCA分析中,度值>10的基因共有5個(gè)(見圖3D)。將使用MCODE插件分析得到的結(jié)果和使用CytoNCA插件分析得到的結(jié)果取交集,共得到PTGS2、HIF1A、VEGFA、FN1和CAV1共5個(gè)Hub基因。這5個(gè)Hub基因可能是ZJPW治療腰椎間盤退變的關(guān)鍵位點(diǎn)。

注：A:藥物靶點(diǎn)基因的PPI網(wǎng)絡(luò);B:按度值≥15篩選并排序;C:CytoNCA法篩選出的Hub基因;D:MCODE法篩選出的Hub基因。

2.6 分子對(duì)接驗(yàn)證 取度值排名前10位的活性成分分別與篩選出的5個(gè)Hub基因進(jìn)行分子對(duì)接。在分子對(duì)接過程中,受體和配體的結(jié)合能越小表明結(jié)合活性越好。結(jié)果顯示,與PTGS2結(jié)合能最小的活性成分是槲皮素、漢黃芩素和山柰酚;與HIF1A結(jié)合能最小的活性成分是槲皮素、山柰酚和甘草查爾酮A;與VEGFA、CAV1和FN1結(jié)合能最小的活性成分均為槲皮素、山柰酚和黃芩黃素。見表3、圖4。

注：A-C:CAV1分別與槲皮素、黃芩黃素和山柰酚對(duì)接;D-F:FN1分別與槲皮素、黃芩黃素和山柰酚對(duì)接;G-I:HIF1A分別與槲皮素、山柰酚和甘草查爾酮A對(duì)接;K-M:PTGS2分別與槲皮素、山柰酚和漢黃芩素;N-P:VEGFA分別與槲皮素、黃芩黃素和山柰酚對(duì)接。

表3 排名前10位的活性成分與靶點(diǎn)基因?qū)咏Y(jié)合能

2.7 免疫浸潤(rùn)分析 CIBERSORT免疫浸潤(rùn)分析顯示,一共有22種免疫細(xì)胞在受測(cè)樣本中表達(dá),從免疫細(xì)胞浸潤(rùn)差異的小提琴圖可以看出,Ⅱ級(jí)退變組和Ⅳ級(jí)退變組免疫細(xì)胞浸潤(rùn)無明顯差異(見圖5A)。按照HIF1A的高低表達(dá)分組后我們發(fā)現(xiàn),在HIF1A高表達(dá)組中,激活的NK細(xì)胞顯著升高(見圖5B)。免疫細(xì)胞與HIF1A的相關(guān)性分析也發(fā)現(xiàn),激活的NK細(xì)胞與HIF1A呈顯著的正相關(guān)(見圖5C)。

注：A:椎間盤Ⅱ級(jí)退變和Ⅳ級(jí)退變免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的差異,紅色表示Ⅱ級(jí)退變,藍(lán)色表示Ⅳ級(jí)退變;B:HIF1A高低表達(dá)組免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的差異,紅色表示HIF1A高表達(dá),藍(lán)色表示HIF1A低表達(dá);C:HIF1A和免疫細(xì)胞的相關(guān)性分析。

3 討論

腰椎間盤退變是引起LBP最常見的原因之一[15]。中藥是治療腰椎間盤退變的重要手段[11, 16]。中藥多取材于天然動(dòng)植物,其不良反應(yīng)較小,且可以在多個(gè)靶點(diǎn)起作用,從而達(dá)到整體施治的目的[17-19]。ZJPW雖然已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于臨床,并取得了令人滿意的臨床效果,但是其治療腰椎間盤退變的分子機(jī)制尚未完全闡明。

在本研究中,筆者通過數(shù)據(jù)庫(kù)分析,共得到ZJPW的有效活性成分139個(gè),其中最重要的成分是槲皮素、漢黃芩素、β-谷甾醇、黃芩黃素、山柰酚、甘草查爾酮A、芝麻素、尼森香豌豆紫檀酚、7-O-甲基-異微凸劍葉莎醇和隱品堿。這些活性成分主要來源于牛膝、細(xì)辛、白芍等藥物。槲皮素是一種重要的抗衰老藥物,可以通過SIRT1信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬或通過Nrf2/NF-κB信號(hào)軸抑制衰老相關(guān)的分泌表型(senescence associated secreted phenotype,SASP)因子的表達(dá),從而減緩腰椎間盤退變[20-21]。有研究[22]還發(fā)現(xiàn),抗衰老藥物達(dá)沙替尼和槲皮素長(zhǎng)期聯(lián)合使用可顯著改善小鼠年齡相關(guān)的椎間盤退變。黃芩黃素是黃芩中含量最高的黃酮類化合物之一,具有抗腫瘤和抗炎等多種作用,在多種腫瘤和炎癥性疾病的治療中起重要作用[23-25]。在體外實(shí)驗(yàn)中,黃芩黃素可抑制髓核細(xì)胞中由IL-1β誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng),從而延緩椎間盤的退變[26]。山奈酚也是一種黃酮類化合物,自然存在于茶以及許多常見的蔬菜和水果中,具有抗氧化、抗骨質(zhì)疏松、抗炎等多種功能,被廣泛用于治療許多急性和慢性炎癥引起的疾病,包括椎間盤退行性變和結(jié)腸炎以及絕經(jīng)后骨質(zhì)流失和急性肺損傷[27]。 體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),山奈酚可通過改善LPS誘導(dǎo)的BMSCs成骨/成脂失衡和炎癥反應(yīng)來減緩椎間盤退變[28]。漢黃芩素可通過介導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)通路和免疫應(yīng)答發(fā)揮抗癌、抗炎、治療細(xì)菌和病毒感染等多種生物學(xué)活性[29-31]。體外實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn),漢黃芩素可通過Nrf2/ARE和MAPK信號(hào)通路減輕椎間盤退變[32]。以上研究結(jié)果與本研究篩選出的ZJPW活性成分是一致的,這說明ZJPW可能是通過上述活性成分發(fā)揮治療椎間盤退變的作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),ZJPW的靶點(diǎn)基因主要富集在PI3K-Akt信號(hào)通路,有研究[24]也表明,黃芩黃素可以通過PI3K/Akt/NF-κB通路提高A549肺腺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。因此筆者推測(cè),ZJPW也可能通過PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)節(jié)椎間盤細(xì)胞的活性,從而延緩椎間盤退變的發(fā)生?；钚猿煞峙c信號(hào)通路的具體調(diào)控機(jī)制將在接下來的實(shí)驗(yàn)研究中進(jìn)一步闡明。

本研究通過PPI網(wǎng)絡(luò)篩選出了ZJPW的主要作用靶點(diǎn)是PTGS2、HIF1A、VEGFA、FN1和CAV1。PTGS2是環(huán)氧合酶-2(Cyclooxygenase-2,Cox-2)的編碼基因,有研究[33-34]表明,COX-2在退變的髓核細(xì)胞中是表達(dá)上調(diào)的,而阿司匹林可以抑制COX-2的表達(dá),從而延緩椎間盤退變的發(fā)生。本研究通過分子對(duì)接技術(shù)發(fā)現(xiàn),與PTGS2結(jié)合能最小的ZJPW活性成分是槲皮素、漢黃芩素和山柰酚。有研究[35-37]表明,這些成分都具有下調(diào)COX-2的表達(dá)的作用。如前所述,COX-2的高表達(dá)是引起椎間盤退變的重要因素之一。因此筆者推測(cè),下調(diào)髓核細(xì)胞中COX-2的表達(dá)可能也是ZJPW治療腰椎間盤退變的分子機(jī)制之一。

HIF1A可激活多種基因的轉(zhuǎn)錄,是細(xì)胞和全身對(duì)缺氧的穩(wěn)態(tài)反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子,參與能量代謝、血管生成、細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的調(diào)控。在椎間盤退變過程中HIF1A是否起正面作用目前尚有爭(zhēng)議,但可以肯定的是HIF1A是準(zhǔn)確診斷和治療椎間盤退變不可缺少的參考指標(biāo)[38]。有研究[39-41]發(fā)現(xiàn),HIF1A通過上調(diào)自噬緩解壓應(yīng)力誘導(dǎo)的髓核來源干細(xì)胞凋亡[42]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),在分子對(duì)接過程中槲皮素、山柰酚和甘草查爾酮A與HIF1A的結(jié)合能最小。而實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)[39, 43],這些化合物均對(duì)HIF1A具有抑制作用。因此筆者認(rèn)為,HIF1A是椎間盤退變的危險(xiǎn)因素,而ZJPW可以通過下調(diào)HIF1A的表達(dá)發(fā)揮治療椎間盤退變的作用。值得一提的是,有研究[44]認(rèn)為,外周血中NK細(xì)胞數(shù)量增多可能加速腰椎間盤退變。也有研究[45]認(rèn)為,腰椎間盤突出患者的外周血NK細(xì)胞較正常對(duì)照組減少。而本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),HIF1A與活性NK細(xì)胞呈顯著的負(fù)相關(guān)。故筆者認(rèn)為,ZJPW可以下調(diào)HIF1A,進(jìn)而減少活性NK細(xì)胞的數(shù)量,從未抑制椎間盤退變。

VEGFA是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子家族的一員,它可促進(jìn)新生血管形成和使血管通透性增加。椎間盤是一個(gè)乏血供組織,其內(nèi)的髓核細(xì)胞靠軟骨終板的滲透作用提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和帶走代謝產(chǎn)物。因此,緊貼軟骨終板的椎體骨性終板的血供對(duì)椎間盤的退變起著至關(guān)重要的作用。血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡可導(dǎo)致終板微血管密度降低,進(jìn)而導(dǎo)致椎間盤退變[46]。在持續(xù)壓迫導(dǎo)致的椎間盤退變過程中,VEGFA起重要作用[47]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),與VEGFA結(jié)合的ZJPW活性成分主要是槲皮素、山柰酚和黃芩黃素。這些化合物可以上調(diào)VEGFA的表達(dá),促進(jìn)血管生成,但是有趣的是,在某些腫瘤中這些化合物下調(diào)VEGFA的表達(dá),從而起到抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用[48-50]。因此筆者認(rèn)為,ZJPW可能通過增加骨性終板VEGFA的表達(dá)促進(jìn)血管生成,或通過減少軟骨終板的血管化而達(dá)到治療椎間盤退變的作用。

綜上所述,本研究通過數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘確定了ZJPW的有效活性成分,進(jìn)一步使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)篩選出該藥物治療腰椎間盤退變的關(guān)鍵靶點(diǎn),并初步探討了藥物作用的分子機(jī)制,最后利用分子對(duì)接技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了初步驗(yàn)證,為ZJPW的深入研究、開發(fā)和應(yīng)用提供了參考。