一例混合感染奶牛乳房炎病例病原菌分離鑒定及藥敏試驗

曹 芳，魏 勇，吳 憂，王晨豫，趙鵬飛，李智星， 任靜靜，齊亞銀

1 石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆石河子 832003

2 新疆天潤科技股份有限公司，新疆烏魯木齊 830063

0 引言

乳房炎是奶牛最重要且常見的疾病之一，會導(dǎo)致奶牛產(chǎn)奶量和牛奶品質(zhì)下降，亦可導(dǎo)致機體免疫力下降。奶牛乳房炎主要癥狀為乳房實質(zhì)、間質(zhì)的炎癥，表現(xiàn)為紅、腫、熱、痛等。根據(jù)有無臨床癥狀，將奶牛乳房炎分為臨床型乳房炎和隱性乳房炎[1]。研究發(fā)現(xiàn)，已有超過180 種病原菌會引起奶牛乳房炎[2，3]。奶牛乳房炎主要是由于鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和支原體所致，此外，環(huán)境性鏈球菌、腸球菌、沙門氏菌、綠膿桿菌等也可引起乳房炎[4，5]。

目前，抗生素治療乳房炎仍是最常見的手段，但廣泛長期使用致使很多病原菌產(chǎn)生耐藥性，有的甚至出現(xiàn)多重耐藥現(xiàn)象，不但對奶牛造成不可挽回的傷害，并且嚴重危及養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展。

近年來，隨著新疆奶牛養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展，乳房炎發(fā)病率逐年升高，規(guī)模化牧場奶牛乳房炎發(fā)病情況更突出，因此，針對典型臨床型奶牛乳房炎病例無菌采集奶樣，進行實驗室分離鑒定及藥敏試驗，為該牧場的奶牛乳房炎防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 病例來源及試驗地點

本研究樣品于2023年7月份取自新疆某規(guī)模化牧場典型患乳房炎奶牛奶樣，臨床診斷均在牧場進行，后期的實驗室檢測于石河子大學(xué)動物科技學(xué)院反芻動物重要疫病防控研究室進行。

1.2 試驗儀器設(shè)備

光學(xué)顯微鏡（光學(xué)顯微鏡）、恒溫培養(yǎng)箱（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）、電泳儀（北京市六一儀器廠）、PCR擴增儀（Techne公司）、凝膠成像系統(tǒng)（Biorad公司）。

1.3 主要試劑

腦心浸出液肉湯（BHI）液體培養(yǎng)基，麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基，沙門、志賀菌屬瓊脂培養(yǎng)基（ss）瓊脂培養(yǎng)基，梭菌鑒別瓊脂培養(yǎng)基，厭氧培養(yǎng)基，甘露醇鹽瓊脂培養(yǎng)基，Baird-Parker瓊脂培養(yǎng)基，均購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。藥敏紙片，購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.4 臨床診斷與采樣

對體細胞數(shù)超過50 萬個/mL的奶牛乳房組織進行視診及觸診，針對最典型癥狀的臨床型乳房炎奶牛，對乳頭消毒處理后，棄去采樣乳區(qū)的前3 把乳樣[6]，無菌采集7 mL左右奶牛乳液至15 mL無菌離心管中，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 病原菌分離純化

將奶樣無菌接種于BHI液體培養(yǎng)基，置于37 ℃搖床過夜培養(yǎng)。涂片固定后進行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察，初步確定相關(guān)病原菌。

將觀察到的相關(guān)菌液分別無菌劃線接種于伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基、ss瓊脂培養(yǎng)基、甘露醇鹽瓊脂培養(yǎng)基、梭菌鑒別瓊脂培養(yǎng)基，置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h。挑取各鑒別平板上的典型單菌落接種于BHI液體培養(yǎng)基、厭氧培養(yǎng)基，置于37 ℃搖床過夜培養(yǎng)。分別將劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、Baird-Parker瓊脂培養(yǎng)基、梭菌鑒別瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24～48 h。繼續(xù)挑取典型單菌落接種于BHI液體培養(yǎng)基（梭菌鑒別平板上的菌落接種于厭氧培養(yǎng)基），置于37 ℃全自動震蕩培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，分別鏡檢，觀察。

1.6 PCR鑒定

按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書步驟，提取細菌總DNA，-80 ℃儲存?zhèn)溆?。根?jù)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、梭菌[7]特異性引物進行PCR擴增，引物序列見表1，反應(yīng)體系是25 μL：2×Taq Plus Master mix Ⅱ為10 μL，上下游引物各為0.5 μL，ddH2O為 12 μL，cDNA模板為2 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性，2 min；95 ℃變性，30 s，55 ℃退火 ，30 s，72 ℃延伸，50 s，30個循環(huán)；72 ℃終延伸，10 min。

表1 引物

PCR擴增反應(yīng)完成后，進行凝膠電泳試驗，在凝膠成像系統(tǒng)儀下觀察，若出現(xiàn)與引物相應(yīng)大小條帶則為目的條帶。

1.7 藥敏試驗

取營養(yǎng)肉湯增菌培養(yǎng)后的菌液，用移液槍吸取100 μL均勻涂抹到整個營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基[8]，貼藥敏紙片，37 ℃倒置培養(yǎng)24～48 h，判定結(jié)果參照美國臨床實驗室國家標準化管理委員會標準（CLSI2008）[9]。

2 結(jié)果

2.1 臨床診斷結(jié)果

視診觀察發(fā)現(xiàn)患乳房炎奶牛乳房明顯紅腫；觸診發(fā)現(xiàn)乳房硬脹，并且發(fā)熱（圖1）。

圖1 患乳房炎奶牛乳房局部照片

2.2 病原菌分離純化結(jié)果

通過革蘭氏染色鏡檢，初步觀察到3 類病原菌：①革蘭氏陰性短桿狀，單個或成對病原菌。②革蘭氏陽性粗大且兩端鈍圓的桿菌。③革蘭氏陽性呈葡萄狀的球菌（圖2a、2b）。

圖2 初步鏡檢結(jié)果

將觀察到的病原菌接種于鑒別培養(yǎng)基后，麥康凱瓊脂培養(yǎng)基長出圓形、金屬紅色光澤菌落（圖3a）；伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基長出紫黑色，并帶有綠色金屬光澤菌落（圖3b）；甘露醇鹽瓊脂培養(yǎng)基長出黃色菌落且菌落周圍也為黃色（圖3c）；Baird-Parker瓊脂培養(yǎng)基長出黑色菌落（圖3d）；梭菌鑒別瓊脂培養(yǎng)基長出黑色菌落（圖3e）。

圖3 接種于鑒別培養(yǎng)基后的鏡檢結(jié)果

鑒定后判定上述革蘭氏陰性桿菌為大腸桿菌，革蘭氏陽性球菌為金黃色葡萄球菌，革蘭氏陽性桿菌為梭菌，見圖4a、4b、4c。

圖4 病原菌鑒定后的鏡檢結(jié)果

2.3 PCR鑒定結(jié)果

PCR擴增結(jié)果如圖5a、5b、5c所示，可分別觀察到287 bp（大腸桿菌）、196 bp（金黃色葡萄球菌）、478 bp（梭菌）條帶，大小與預(yù)期符合。

圖5 PCR鑒定結(jié)果

2.4 藥敏試驗結(jié)果

由表2可知，大腸桿菌對復(fù)方新諾明、卡那霉素、恩諾沙星、環(huán)丙沙星高度敏感，其中環(huán)丙沙星極度敏感；金黃色葡萄球菌對復(fù)方新諾明、卡那霉素、恩諾沙星、氯霉素極度敏感；梭菌對氯霉素、頭孢曲松、氨芐西林高度敏感。分離得到3 種細菌均出現(xiàn)多重耐藥現(xiàn)象。

表2 藥敏試驗結(jié)果

3 討論

對該規(guī)模化牧場典型乳房炎病例進行采樣鑒定后，發(fā)現(xiàn)奶牛乳房炎多由于大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、梭菌感染所致。與新疆地區(qū)常見奶牛乳房炎分離到的病原類型一致[10，11]，并且不同細菌呈現(xiàn)不同耐藥情況，建議該牧場對患病牛采取隔離措施，并配合使用替米考星、頭孢噻呋鈉、及梭菌疫苗進行聯(lián)合用藥治療。

乳房炎為奶牛養(yǎng)殖業(yè)臨床常見疾病，主要由于病原體感染所致。新疆地區(qū)長期干燥，晝夜溫差較大，奶牛更易發(fā)生乳房炎。因此，該地區(qū)通常采取“預(yù)防為主，治療為輔”的防治措施。在預(yù)防方面，定期檢測乳房健康狀況，保持圈舍環(huán)境衛(wèi)生及奶牛體表清潔，保證擠奶衛(wèi)生，堅持乳頭藥浴，還應(yīng)加強干奶期隱性乳房炎防治，對于已患乳房炎奶牛，應(yīng)根據(jù)不同病因采取措施，合理用藥。

在治療方面，雖然抗生素對奶牛乳房炎治療至關(guān)重要，但隨著大量長期不合理的使用，出現(xiàn)大量耐藥菌株，且耐藥性越來越高，這提示養(yǎng)殖戶應(yīng)合理使用抗生素，平時在奶牛及牛舍消毒衛(wèi)生管理方面多下功夫，以達到良好預(yù)防疾病效果。

4 結(jié)論

本研究通過對該牧場乳房炎奶樣進行病原菌分離鑒定發(fā)現(xiàn)，該牧場奶牛乳房炎是由大腸桿菌、金黃色葡萄球菌以及梭菌混合感染所致。藥敏試驗顯示，3 種菌對多種抗生素產(chǎn)生了不同的耐藥效果，其中大腸桿菌及金黃色葡萄球菌對復(fù)方新諾明、恩諾沙星、氯霉素相對敏感。建議該牧場對患病牛采取隔離措施，并配合使用替米考星、頭孢噻呋鈉、及梭菌疫苗進行聯(lián)合用藥治療，以期達到良好的治療效果。