氣相色譜-質(zhì)譜法測定中棉所49 棉籽仁中的植物甾醇組成

方丹，楊瑞楠，徐雙嬌，田新權(quán)，馬磊*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/ 棉花生物育種與綜合利用全國重點實驗室，河南安陽 455000；2.河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，鄭州 450000）

棉籽是棉花加工的副產(chǎn)品， 含油量為15%～25%，是最早用于制作食用油的植物油料之一。 棉籽中含有豐富的不飽和脂肪酸、氨基酸、維生素E、甾醇等成分。棉籽油曾是棉花主產(chǎn)區(qū)居民的主要食用油。 然而，棉籽中含有棉酚和少量的環(huán)丙烯脂肪酸，限制了棉籽油在食品工業(yè)中的應(yīng)用[1]。 作為棉籽中的重要脂溶性營養(yǎng)成分，植物甾醇具有重要的營養(yǎng)價值。 由于人體不能合成植物甾醇，只能通過飲食攝取，因此，植物甾醇也是植物油中必需的一種營養(yǎng)成分。 植物甾醇不僅可以調(diào)節(jié)機體代謝[2]，抑制膽固醇的吸收，降低血脂[3-4]，還具有抗炎、抗衰老、抗腫瘤、抗癌等生理功能[5-8]，是一種對人體非常有益的次生代謝產(chǎn)物。 此外，甾醇也是天然抗氧化劑，已被許多國家用于食品、保健品等領(lǐng)域，以滿足人體對微量營養(yǎng)元素的需求，對改善人體健康具有積極的作用。 因此，甾醇的提取和應(yīng)用是當(dāng)前的研究熱點。 目前，國內(nèi)主要研究植物甾醇的提取和檢測，原料主要是棉籽油加工過程中產(chǎn)生的脫臭餾出物， 從棉籽中直接提取植物甾醇的研究尚未見報道，且植物甾醇在工業(yè)中應(yīng)用的報道也較少。

本研究采用氣相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS）對中棉所49[9]棉籽仁中的植物甾醇組成進(jìn)行了分析，并對不同植物甾醇的含量進(jìn)行了測定，旨在為鑒定棉籽產(chǎn)地來源提供方法參考，并為高甾醇棉籽和棉籽油的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試材料為早中熟陸地棉品種中棉所49[9]，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所選育并提供。

所用標(biāo)準(zhǔn)品包括膽固醇（純度≥99.0%）、菜油甾醇（純度≥99.0%）、β- 谷甾醇（純度≥95.0%）、豆甾醇（純度≥95.0%）、5α- 膽甾烷-3β- 醇（純度≥98.0%）， 均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。 其他試劑：氫氧化鉀，由美國Sigma 公司生產(chǎn)；乙醇、正己烷（均為色譜純）、N- 甲基-N-（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺［N-Methyl-N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide,MSTFA］，均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

包括：8890-7000D 氣相色譜-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國安捷倫科技公司）；XS105DU 電子天平［梅特勒托利多（上海）有限公司］；5417R 小型臺式高速冷凍離心機（德國Eppendorf 公司）；VORTEX 2 S025 渦旋混勻器（德國IKA 公司）；干浴器（德國IKA 公司）；水浴氮吹儀（上海安譜實驗科技股份有限公司）；超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.3 樣品前處理

為檢測中棉所49 光籽的植物甾醇含量， 根據(jù)參考文獻(xiàn)[10-11]，優(yōu)化測定方法如下：首先準(zhǔn)確稱取200 mg 棉籽仁樣品磨碎后加入10 mL 聚四氟乙烯管中， 再加入100 μg·mL-1的5α- 膽甾烷-3β-醇內(nèi)標(biāo)溶液200 μL 和2 mol·L-1的氫氧化鉀乙醇溶液（所用體積分?jǐn)?shù)為90%的乙醇由90 mL 乙醇與10 mL 去離子水配制）2 mL，渦旋震蕩1 min，再進(jìn)行30 min 超聲處理；將樣品放入75 ℃干浴器進(jìn)行皂化處理1 h；之后冷卻至室溫并加入1 mL 正己烷 和2 mL 超 純 水 混 合 均 勻，5 000 r·min-1離 心10 min 后取上清液于10 mL 試管中， 再加入正己烷和超純水共進(jìn)行3 次提取，合并上清液后，置于水浴氮吹儀上氮吹至近干。 向殘留的甾醇中加入100 μL 衍生劑MSTFA， 在80 ℃烘箱內(nèi)衍生處理30 min， 最后用正己烷定容至500 μL 以備氣相色譜-質(zhì)譜分析。

1.4 氣相色譜-質(zhì)譜分析

同一樣品取3 份，對植物甾醇進(jìn)行提取、測定，并計算甾醇含量的平均值。

氣相色譜：使用毛細(xì)管柱HP-5MS（色譜柱長度30 m，內(nèi)徑0.25 mm，膜厚0.25 μm），進(jìn)樣口溫度為290 ℃，分流比為10∶1，進(jìn)樣量為1 μL，流速為1.0 mL·min-1，升溫程序如下：初始溫度為100 ℃，保持1 min， 之后以40 ℃·min-1的速率升至290 ℃，并保持15 min。

質(zhì)譜檢測：采用電子電離（electron ionization,EI）方式，電離電壓為70 eV，離子源溫度為250 ℃，傳輸線溫度為280 ℃，掃描質(zhì)量范圍為35～550 u。通過將保留時間與標(biāo)準(zhǔn)品比對，最終確定各植物甾醇的結(jié)構(gòu)和含量。

半定量分析方法：以5α-膽甾烷-3β-醇為內(nèi)標(biāo)物，以豆甾醇為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：y＝0.727 2x＋0.003 68［其中，峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比為x，標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度（μg·mL-1）與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度（μg·mL-1）之比為y，R2＝0.999 0］，其他各種植物甾醇的含量（mg·hg-1）均根據(jù)豆甾醇的質(zhì)量濃度、棉籽仁樣品質(zhì)量及樣品溶液體積計算，總甾醇含量為各種甾醇含量之和。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉籽仁中植物甾醇種類的鑒定

經(jīng)過MSTFA 硅烷化后， 中棉所49 棉籽仁中的植物甾醇經(jīng)氣相色譜能夠很好地分離，總離子流色譜圖見圖1。 通過標(biāo)準(zhǔn)品保留時間和GC-MS 中的離子碎片對主要甾醇進(jìn)行定性分析[12-14]，解譜后可以鑒定出中棉所49 棉籽仁中含有9 種甾醇（表1）。

表1 中棉所49 棉籽仁中甾醇類化合物的組成及其含量

圖1 中棉所49 棉籽仁中甾醇衍生物GC-MS 總離子流色譜圖

中棉所49 棉籽仁中所含甾醇按照其出峰順序依次是膽固醇、菜油甾醇、豆甾醇、β- 谷甾醇、Δ5-燕麥甾醇、 羽扇豆醇、Δ7- 燕麥甾醇、24- 亞甲基環(huán)木菠蘿烷醇和高根二醇，它們經(jīng)過硅烷化后的結(jié)構(gòu)式和質(zhì)譜圖見圖2。 通過對比標(biāo)準(zhǔn)品保留時間的方法確定總離子流色譜圖（圖1）中的各種組分，確定的甾醇種類有膽固醇、菜油甾醇、豆甾醇和β- 谷甾醇。 另外，在保留時間為15.049 min、15.840 min、16.161 min、17.129 min 和18.052 min 的 未知組分中，通過與標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜譜庫（National Institute of Standards and Technology 17,NIST 17）中的質(zhì)譜圖進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)檢索結(jié)果的匹配度均大于70%，試驗所得質(zhì)譜圖（圖2）中特征離子峰以及譜峰的相對豐度與NIST 17 譜庫中的質(zhì)譜圖具有良好的一致性，最終確定保留時間為15.049 min、15.840 min、16.161 min 和17.129 min 的未知組分依次是Δ5-燕麥甾醇、羽扇豆醇、Δ7-燕麥甾醇和24-亞甲基環(huán)木菠蘿烷醇。保留時間為18.052 min 的組分可能是高根二醇或熊果醇，通過對比二者的質(zhì)譜圖中質(zhì)荷比（m/z）為203 和216 的2 個質(zhì)譜峰的相對豐度特征，最終確定該組分是高根二醇。

圖2 中棉所49 棉籽仁中甾醇類化合物及內(nèi)標(biāo)5α-膽甾烷-3β-醇的質(zhì)譜圖

2.2 棉籽仁中植物甾醇含量

中棉所49 棉籽仁中含有9 種甾醇類化合物，每100 g 棉籽仁中甾醇總含量為124.870 mg。 其中：含量最高的是β- 谷甾醇，每100 g 棉籽仁中的含量為99.483 mg，占甾醇總含量的79.669%；其次是菜油甾醇，每100 g 棉籽仁中的含量為13.295 mg，占甾醇總含量的10.647%（表1）。 這2 種甾醇含量占甾醇總量的90.316%。 另外，Δ5-燕麥甾醇、高根二醇、羽扇豆醇和豆甾醇的含量分別占甾醇總量的4.238%、1.966%、1.808%和0.796%，合計占8.808%。雖然高根二醇的含量僅占甾醇總量的1.966%，但它是棉籽仁中的特征甾醇組分。 每100 g 棉籽仁中膽固醇的含量為0.324 mg，其含量占甾醇總含量的0.259%。

3 討論與結(jié)論

植物甾醇主要存在于植物油、 堅果和種子中。不同植物中的甾醇含量各不相同， 如每100 g 大豆、油菜、花生、棉花和玉米種子中的總甾醇含量分別為3～450 mg、7～1 130 mg、2～290 mg、2.8～640.0 mg 和700～2 210 mg[15-16]，其甾醇組成特征也不同。因此，植物甾醇是區(qū)分油料及植物油種類、品質(zhì)的一類重要化合物。

植物甾醇包括游離甾醇、甾醇酯、甾醇糖苷、酰基甾醇糖苷等。 本研究通過皂化提取、有機溶劑萃取、硅烷化衍生、GC-MS 方法，測定了中棉所49 棉籽仁中總甾醇的組成及其含量。 結(jié)果顯示，中棉所49 棉籽仁中含有9 種植物甾醇，每100 g 棉籽仁中總甾醇含量為124.870 mg，其中β- 谷甾醇、菜油甾醇、Δ5- 燕麥甾醇是主要成分， 分別占總甾醇含量的79.669%、10.647%和4.238%，β- 谷甾醇是棉籽中含量最豐富的甾醇；含量僅占總甾醇含量1.966%的高根二醇， 則是中棉所49 棉籽仁甾醇的特征成分。 普遍認(rèn)為植物油中不含膽固醇，而本研究在中棉所49 棉籽仁中檢測到少量膽固醇。 上述棉籽仁植物甾醇成分分析為研究棉籽及棉籽油的營養(yǎng)功效奠定了基礎(chǔ)。此外，通過植物甾醇成分分析，可以鑒別不同種類的植物油或區(qū)分高低檔油。但對于棉籽中游離甾醇、甾醇酯、甾醇糖苷、酰基甾醇糖苷等的測定和植物甾醇生理活性的分析， 還有待進(jìn)一步的探究。