白及葉斑病病原菌的鑒定與室內(nèi)殺菌劑篩選

侯秀明，林思雨，王晗怡，郭靜怡，劉 澤，廖宏澤，周 浩,2**

(1.廣西民族大學(xué) 廣西多糖材料與改性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530007；2.廣西民族大學(xué) 海洋生物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530007)

白及[Bletillastriata（Thunb）Reichb.f.（Orchidaceae）]又名地螺絲、良姜、紫蘭，是蘭科白及屬多年生藥用植物.白及塊莖味苦、澀，性偏涼，化學(xué)成分主要有聯(lián)芐類、菲類化合物和多糖，具有消腫、生肌、斂瘡、止血的功效，被美容行業(yè)廣泛使用[1].此外，白及可治癰疽腫毒，肺傷咳血，灼傷潰瘍，肛裂，乳頭裂和手足皸裂，對腸道疾病胃潰瘍、結(jié)腸炎也具有療效[2].

野生白及產(chǎn)于貴州、四川、云南、廣西、湖南、湖北、浙江、江西等?。ㄗ灾螀^(qū)），生長于山谷潮濕處[3].由于白及具有重要藥用價(jià)值，近年來市場需求急劇增長，野生資源挖掘殆盡，導(dǎo)致物種瀕臨滅絕，目前已被《中國植物紅皮書——稀有瀕危植物》第一冊收錄[4].為滿足市場需求，人工種植產(chǎn)業(yè)興起，而病害問題已成為影響白及產(chǎn)量的重要因素，制約白及種植業(yè)發(fā)展.白及病害的發(fā)生集中于雨季前，據(jù)研究報(bào)道，Phytophthoranicotianae[5]和RhizoctoniasolaniAG-2-2 IIIB[6]引起白及葉枯病，F(xiàn)usariumfujikuroi[7]引起白及黑腐病、F.asiaticum[8]、F.solani[9]和Epicoccumsorghinum[10]能引起白及葉斑病.這些病害后期可導(dǎo)致葉片掉落，植株死亡，嚴(yán)重影響產(chǎn)量.本研究在廣西南寧市白及種植基地發(fā)現(xiàn)一種白及葉斑病.為了鑒定該病的病原菌種類，篩選出高效的防治藥劑，通過采集白及發(fā)病葉片，從病害組織中分離純化病原菌，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征與多基因系統(tǒng)發(fā)育分析，明確病害病原種類，并在室內(nèi)開展該病原的防治藥劑篩選.研究結(jié)果可為白及葉斑病的病原真菌鑒定以及防治提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試植株供試植物來自廣西南寧市白及種植基地.病癥植株置于無菌袋中保存并編號；健康植株移栽到溫室培養(yǎng).

1.2 供試培養(yǎng)基及試劑馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、水1 L.燕麥培養(yǎng)基（OA）：燕麥片30 g、瓊脂20 g、水1 L.麥芽汁培養(yǎng)基（MEA）：麥芽浸提物34 g、瓊脂20 g、水1 L.水瓊脂培養(yǎng)基（WA）：15 g，水1 L.

主要試劑有EasyTaq?DNA 聚合酶、10× EasyTaq?Buffer、dNTP、氯仿、異丙醇、1% CTAB、15 mg/mL 氯霉素.

1.3 田間病害觀察與樣品采集2020 年5 月在廣西南寧市白及種植基地觀察并采集患病植株，拍照記錄發(fā)病情況后將患病植株帶回實(shí)驗(yàn)室.

1.4 病原菌分離、純化及保存采取組織分離法[11]與單孢純化法[12]分離病原菌.剪取0.5 cm×0.5 cm病健交界處的植物組織，放入0.1% HgCl2溶液浸泡1 min，無菌水沖洗3 次后放入PDA 培養(yǎng)基，28 ℃恒溫倒置培養(yǎng).從新長出的菌落邊緣挑取菌絲塊，置于PDA 平板上，依據(jù)菌落形態(tài)和顯微特征進(jìn)行初步分類.待菌落長滿平板，制備分生孢子懸浮液（106個(gè)/ mL），利用平板稀釋畫線法純化病原菌.純培養(yǎng)物用PDA 斜面保存于4 ℃冰箱.

1.5 致病性測定采用分離菌株的PDA 菌餅和孢子懸浮液測定致病性.將純化的菌株接種于含有氯霉素（25 μg/mL）的PDA 平板上，28 ℃培養(yǎng)7 d，制備0.5 cm×0.5 cm 菌餅，挑選生長狀態(tài)一致的健康白及葉片，用無菌水清洗晾干，針頭刺傷后接種菌餅，無菌水浸潤棉花保濕，以刺傷的白及葉片作為空白對照[13].在刺傷的活體植株葉片上滴加孢子懸液，無菌水做空白對照.實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，所有處理植株在室溫下培養(yǎng)6 d，定期記錄發(fā)病情況，待植株發(fā)病后，依據(jù)柯赫氏法則驗(yàn)證病原.

1.6 形態(tài)學(xué)觀察把純化的分離菌株分別接種于PDA、MEA 和OA 平板，28 ℃培養(yǎng)，待菌絲長滿后，記錄菌株菌落形態(tài).在PDA 平板上接種直徑為5 cm的菌餅，利用十字交叉法間隔12 h 測量菌落直徑，統(tǒng)計(jì)菌株平均生長速度.將菌株接種于WA 培養(yǎng)基，待菌絲長滿后，顯微鏡下觀察并拍照，利用ImageJ[14]測量分生孢子大小.

1.7 分子生物學(xué)鑒定接種純培養(yǎng)物于PDA 上，菌絲長滿后，挑取菌絲，使用CTAB 法[15]提取真菌基因組DNA.用引物（表1）分別擴(kuò)增核糖體DNA（nrDNA）內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）、28S nrDNA（LSU）、18S nrDNA（SSU）、轉(zhuǎn)錄延伸因子基因（TEF1）、編碼RNA 聚合酶Ⅱ的基因（RPB2）、甘油-3-磷酸脫氫酶基因（GAPDH）的序列，引物均由武漢奧科鼎盛生物科技有限公司合成.25 μL PCR 反應(yīng)體系：DNA 模板1 μL，10×EasyTaq?buffer 2.5 μL，dNTP與上下游引物各0.5 μL，DNA 聚合酶 0.1 μL，無菌去離子水20.9 μL.擴(kuò)增程序設(shè)置為：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性45 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循環(huán)35 次，72 ℃延伸10 min，4 ℃保溫.

表1 PCR 擴(kuò)增所用引物Tab.1 Primers for PCR amplification

選取預(yù)期大小的DNA 片段在武漢奧科鼎盛生物科技有限公司測序，使用Vector NTI 對測序結(jié)果進(jìn)行檢查校準(zhǔn)，在NCBI 中進(jìn)行同源性分析，并將序列上傳至NCBI 數(shù)據(jù)庫獲得序列登錄號（表2）.依據(jù)Woudenberg 等[16]的方法選取29 株近緣菌株，以A.alternantherea作為外類群，下載相應(yīng)ITS、LSU、SSU、TEF1、RPB2、GAPDH序列（表2），使用Phylosuite1.2.2 進(jìn)行多重序列比對，串聯(lián)序列，以最大似然法（ML）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，設(shè)置自檢值為20 000.

表2 系統(tǒng)發(fā)育分析所用鏈格孢屬菌株相關(guān)信息和GeneBank 登錄號Tab.2 Collection details and GeneBank accession numbers of the Alternaria used in phylogenetic analysis

1.8 不同殺菌劑的室內(nèi)毒力測定采用菌絲生長速率法測定殺菌劑對致病菌的毒力，依據(jù)張曉勇等[24]、李文等[25]的文獻(xiàn)，選取10 種殺菌劑進(jìn)行測定，供試殺菌劑種類及質(zhì)量濃度見表3.以無菌水作為空白對照，每個(gè)處理重復(fù)2 次，72 h 后采用十字交叉法統(tǒng)計(jì)不同處理的菌落直徑，計(jì)算抑制率.

表3 供試殺菌劑名稱及用量Tab.3 Names and dosages of test agents.

抑制率=（空白對照菌落純生長量-處理菌落純生長量）/空白對照純生長量×100%,

純生長量=菌落平均直徑-菌餅直徑.

利用Excel 2010 計(jì)算不同質(zhì)量濃度殺菌劑對病原菌生長的抑制率，采用GraphPad Prism 8.0 繪制殺菌劑抑制效果曲線圖，以殺菌劑質(zhì)量濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，抑制率作為縱坐標(biāo)，計(jì)半數(shù)有效質(zhì)量濃度（EC50），判斷不同殺菌劑的藥效.

2 結(jié)果

2.1 白及葉斑病田間癥狀本研究在廣西南寧種植基地的白及葉片上觀察到一種葉斑病，呈黑色不規(guī)則狀.隨著病害的發(fā)展，葉面斑點(diǎn)不斷增多，密集覆蓋整個(gè)葉片或者植株（圖1），危害面積約0.2 hm2(3 畝).田間五點(diǎn)取樣法隨機(jī)統(tǒng)計(jì)200 株，發(fā)病率約15%.在其中3 個(gè)取樣點(diǎn)選取了3 株患病植株（每個(gè)取樣點(diǎn)選取了1 株），病斑邊緣剪下18 塊植物葉片（～5 mm2）組織用于病原分離.在PDA 上一共分離到了15 株真菌，11 株形態(tài)一致，都能在植物葉片上引起病斑.其余4 株菌落形態(tài)差別很大，且不能在植物上引起病害.ITS 序列分析表明，11 株菌都屬于鏈格孢屬（Alternaria），隨機(jī)挑選了其中3 個(gè)菌株BJ19.4.1、BJ19.4.2、BJ106.4 進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn).

圖1 白及田間病害癥狀Fig.1 Symptoms of leaf spot on Bletilla striata

2.2 病原菌致病性測定將菌株BJ19.4.1、BJ19.4.2、BJ106.4 的PDA 菌餅接種于健康白及葉片，3 d 后葉片出現(xiàn)黑色斑點(diǎn)，3 株菌在白及上產(chǎn)生的病斑形狀一致，發(fā)病時(shí)間無差異（圖2B～D）.用孢子懸液（106個(gè)/ mL）接種活體植株，植株6 d 后出現(xiàn)黑色病斑（圖2E～G），滴加蒸餾水的對照組不發(fā)病.2種接種方式中，用菌餅接種的葉片發(fā)病更明顯，病斑出現(xiàn)時(shí)間較早.從葉片的病健交接處都再次分離到與接種菌株一致的病原菌.依據(jù)柯赫式法則，確定病原菌BJ19.4.1、BJ19.4.2、BJ106.4 為白及葉斑病致病菌株.

圖2 白及葉斑病病原菌致病性測定Fig.2 Pathogenicity test of the isolates on Bletilla striata plants

2.3 病原菌形態(tài)學(xué)特征在PDA 平板上28 ℃培養(yǎng)，6 d 菌落長滿直徑9 cm 培養(yǎng)基，菌株BJ19.4.1與BJ19.4.2 的平均生長速度為0.44 cm/d，BJ106.4的平均生長速度為0.43 cm/d.菌落正面為白色，細(xì)絨毛狀，菌落厚，邊緣整齊，后期呈現(xiàn)褐色，邊緣為灰白色，氣生菌絲豐富，菌落背面呈現(xiàn)深褐色，出現(xiàn)同心輪紋，邊緣灰白色.在OA 培養(yǎng)基上，菌落由白色變?yōu)榛揖G色，菌絲比PDA 平板上少，菌落背面呈現(xiàn)灰綠色，未見同心輪紋.在MEA 培養(yǎng)基中，菌落由白色變?yōu)樽厣浔趁娉尸F(xiàn)棕褐色，有明顯的同心輪，邊緣淺黃色（圖3A～C）.

圖3 病原菌的形態(tài)特征Fig.3 Morphological characteristics of the pathogens

顯微觀測，分生孢子梗單生或簇生，直立或彎曲，分支少，具有一個(gè)或幾個(gè)頂端分生孢子位點(diǎn).分生孢子呈棕色或深褐色，形狀有棒狀、梨形、長橢球形，具有橫縱隔膜.分生孢子逐漸縮小為錐形，在分隔處縊縮，大小為（19～34）μm×（3.5～12.5）μm（圖3D～H）.依據(jù)Woudenberg 等[16]的報(bào)告，初步鑒定菌株為鏈格孢屬真菌.

2.4 系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析將所得的基因序列在NCBI 上進(jìn)行BLAST 比對，結(jié)果表明，以ITS 序列進(jìn)行比對，BJ19.4.1、BJ19.4.2 與AlternariaalternataCBS 918.96（登錄號：AF347032）的相似度為99.81%（530/531），BJ106.4 與A.alternataCBS 916.96（登錄號：AF347031）的相似度為99.81%（531/532）.以SSU 序列進(jìn)行比對，BJ19.4.1、BJ19.4.2 與A.alternataCBS 918.96（登錄號：KC584567）的相似度為100%（1 020/1 020），BJ106.4 與A.alternataCBS 916.96（登錄號：KC584507）的相似度為99.90%（1 019/1 020）.以LSU 序列進(jìn)行比對，BJ19.4.1、BJ19.4.2 與A.alternataCBS 918.96（登錄號：KC584311）的相似度為100%（849/849），BJ106.4 與A.alternataCBS 916.96（登錄號：DQ678082）的相似度為99.90%（1 019/1 020）.以RPB2序列進(jìn)行比對，BJ19.4.1、BJ19.4.2與A.alternataCBS 918.96（登錄號：KC584435）的相似度分別為100%（860/860）、99.88%（862/863），BJ106.4 與A.alternataCBS 916.96（登錄號：KC584375）的相似度為100%（865/865）.以GAPDH序列進(jìn)行比對，BJ19.4.1、BJ19.4.2 與A.alternataCBS 918.96（登錄號：AY278809）的相似度為100%（580/580），BJ106.4 與A.alternataCBS 916.96（登錄號：AY278808）的相似度為99.83%（579/580）.以TEF1序列進(jìn)行比對，BJ19.4.1、BJ19.4.2 與A.alternataCBS 918.96（登錄號：KC584693）的相似度為100%（240/240），BJ106.4 與A.alternataCBS 916.96（登錄號：KC584634）的相似度為100%（255/255）.

依據(jù)菌株基因測序結(jié)果，參考已報(bào)道的29 株菌，通過Phylosuite 構(gòu)建ML 系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）.結(jié)果顯示BJ19.4.1、BJ19.4.2、BJ106.4 與A.alternata聚為一類，自舉值為98，結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，將白及葉斑病病原菌鑒定為A.alternata.

圖4 基于ITS、LSU、SSU、TEF1、RPB2、GAPDH 序列構(gòu)建的ML 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 ML phylogenetic tree based on ITS、LSU、SSU、TEF1、RPB2、GAPDH gene sequences

2.5 不同殺菌劑的室內(nèi)毒力測定通過菌絲生長速率法測定了10 種殺菌劑對病原菌的抑制效果（圖5、6）.結(jié)果表明，在PDA 平板上，候選殺菌劑都不能完全抑制病原菌生長，但肟菌戊唑醇、苯醚甲環(huán)唑、代森錳鋅抑制效果較好.在殺菌劑質(zhì)量濃度為100 μg/mL 時(shí)，抑制率分別為83%、76%、85%，其中肟菌戊唑醇效果最好，EC50值為1.25 μg/mL，表明白及葉斑病病原菌對這種藥劑十分敏感.病原菌對代森錳鋅雖然敏感，但在低濃度時(shí)，未有明顯的抑制作用.其余7 種殺菌劑抑制率低于60%，對病原菌的防治沒有指導(dǎo)意義.綜上所述，在測試的候選藥劑中，肟菌戊唑醇對白及葉斑病病原的抑制效果最強(qiáng).

圖6 不同殺菌劑對白及葉斑病病原菌BJ19.4.1 的抑制效果曲線圖Fig.6 Graph of inhibitory effect of different fungicides on the pathogenic fungi BJ19.4.1

3 討論

Alternariaalternata屬于真菌界（Fungi），子囊菌門（Ascomycota），座囊菌綱（Dothideomycetes），格孢腔菌目（Pleosporales），格孢腔菌科（Pleosporaceae），鏈格孢屬（Alternaria），是常見的真菌之一.因鏈格孢屬種類繁多、適應(yīng)性強(qiáng)，廣泛分布在世界各地，給全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成重大損失.有相關(guān)研究表明，鏈格孢侵染植物引起病害與附著胞有關(guān)，也與其分泌的細(xì)胞壁降解酶有關(guān)[26].此外，鏈格孢產(chǎn)生的鏈格孢毒素也能干擾寄主的生理代謝功能，表現(xiàn)為葉片病斑、植株枯萎[27].鏈格孢引起植物病害主要與寄主類別、氣候、土壤有關(guān).近年來，有報(bào)道A.mycotoxins在田間能侵染小麥[28]，A.alternata能使洋蔥[29]、高粱[30]染病，A.aborescens能引起石榴果實(shí)心腐病[31]，在菊科觀賞植物中也發(fā)現(xiàn)不同類型鏈格孢寄生[32].本研究通過致病性實(shí)驗(yàn)，結(jié)合形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)研究，首次確定白及是A.alternata的新寄主.研究報(bào)道，鐮刀菌屬和莖點(diǎn)霉屬真菌也能引起白及葉斑病，然而它們與鏈格孢屬真菌引起的葉病斑有明顯差異.前兩種病原真菌前期在葉片上引起圓形或不規(guī)則的淺棕色斑點(diǎn)，隨機(jī)散布在葉片邊緣或表面，后期病斑擴(kuò)大融合形成更大的病斑，最終導(dǎo)致葉片脫落[7-10].鏈格孢屬真菌病斑呈現(xiàn)星點(diǎn)狀，近圓形或不規(guī)則，直徑一般小于10 mm，后期病斑無明顯擴(kuò)大趨勢，密集分布整張葉片.白及鏈格孢屬真菌葉斑病首次在南寧發(fā)現(xiàn)，在其他白及種植區(qū)是否有這類病害發(fā)生有待進(jìn)一步研究.

化學(xué)防治是白及田間病害防控的重要措施，殺菌劑室內(nèi)毒力測定實(shí)驗(yàn)表明，在測試的藥劑中，肟菌戊唑醇對病原的抑菌效果最好，在使用質(zhì)量濃度為100 μg/mL 時(shí)，在PDA 平板上抑制率高達(dá)83%，EC50為1.25 μg/mL.肟菌戊唑醇使用范圍廣泛，是肟菌酯和戊唑醇混合劑，通過抑制呼吸作用以及阻礙菌絲生長達(dá)到抑菌效果，預(yù)計(jì)在種植基地噴撒肟菌戊唑醇可以達(dá)到良好的防治效果.

本研究首次報(bào)道A.alternata能在中藥植物白及上引起葉斑病，并對其進(jìn)行了常用藥劑室內(nèi)篩選，為該病害的識別和防治提供理論基礎(chǔ).