基于UPLC-MSE 的白術(shù)化學(xué)成分分析及產(chǎn)地差異研究

楊 亮，于 洋，康舒宇，閆廣利，孫 暉，王喜軍

黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，經(jīng)方與現(xiàn)代中藥融合創(chuàng)新全國重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)方證代謝組學(xué)研究中心，黑龍江哈爾濱 150040

白 術(shù) 為菊 科 植物白 術(shù)Atractylodes macrocephalaKoidz.的干燥根莖，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，具有補氣健脾、固表止汗、燥濕利水、安胎之功效，多用于脾虛食少、腹脹泄瀉、痰飲眩悸、水腫、自汗、胎動不安等癥[1]。白術(shù)中主要含有倍半萜類、三萜類、聚乙炔類、香豆素類、苯丙烷類、黃酮類、苯醌和多糖類等化學(xué)成分[2]。現(xiàn)代研究表明，白術(shù)具有抗炎、抗腫瘤、抗凝血、抗抑郁、神經(jīng)保護(hù)、調(diào)節(jié)免疫、調(diào)節(jié)胃腸運動和調(diào)節(jié)子宮平滑肌等多種藥理作用[3-5]。

白術(shù)作為常用的大宗藥材，其藥用價值廣泛，素有“北參南術(shù)”之稱，在國家中醫(yī)藥管理局公布的首批百首經(jīng)典名方中含有白術(shù)的方劑多達(dá)13 首[6]。白術(shù)主產(chǎn)于我國的浙江、湖南、安徽及河北等地，自古以浙江為道地產(chǎn)區(qū)，享有“浙八味”“磐五味”之一的美譽。但近年來浙白術(shù)產(chǎn)量已大幅度萎縮，目前以安徽、河北和湖南等產(chǎn)地為主[7]。但“土地所出，真?zhèn)侮愋?，并各有法”，受生長環(huán)境，土質(zhì)以及氣候的影響，不同產(chǎn)地的藥材質(zhì)量差異往往較大，其藥材的質(zhì)量直接影響到方劑的質(zhì)量與療效，因此評價不同產(chǎn)地白術(shù)藥材的質(zhì)量，優(yōu)選產(chǎn)地是保證白術(shù)相關(guān)經(jīng)方制劑質(zhì)量的重要手段之一[8]。目前的研究多采用UPLC 指紋圖譜[9]、三維[10]及多維熒光技術(shù)[11]、元素指紋分析技術(shù)[12]、GC-MS 指紋圖譜[13]、近紅外漫反射光譜技術(shù)[14]等對白術(shù)進(jìn)行質(zhì)量評價與產(chǎn)地鑒別研究，但這些分析方法尚不能全面、系統(tǒng)地表征不同產(chǎn)地白術(shù)藥材的質(zhì)量差異。

液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)是一種集高效分離、高靈敏度與高選擇性檢測于一體的現(xiàn)代分離分析技術(shù)，可同時測定數(shù)十個甚至上百個成分，廣泛用于中藥材不同產(chǎn)地、不同品種、不同藥用部位中次生代謝物或化合物差異性的鑒別分析[15-16]。本研究運用UPLCMSE技術(shù)全面分析白術(shù)藥材的化學(xué)成分，通過多元統(tǒng)計分析出河北、安徽、浙江產(chǎn)區(qū)白術(shù)的差異化學(xué)成分及其變化規(guī)律，為白術(shù)的產(chǎn)地鑒別及質(zhì)量評價提供參考，為篩選符合經(jīng)方制劑開發(fā)要求的優(yōu)質(zhì)白術(shù)藥材奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters AcquityTMUPLC 液相色譜儀（Waters 公司，美國）；SynaptTMG2-Si 質(zhì)譜分析系統(tǒng)（Waters公司，美國）；Waters AcquityTMUPLC HSS T3 色譜柱（Waters 公司，美國）；MassLynx V4.2 工作站（Waters 公司，美國）；超聲波清洗器KQ-500DB（昆山市超聲儀器有限公司）；低溫超高速離心機(jī)ThermoSorvall ST16R（Thermo 公司，美國）；電子分析天平（上海蒲春計量儀器有限公司）；Progenesis QI V3.0（Waters 公司，美國）；SIMCA14.1 軟件（Umetrics，瑞典）。

1.2 試藥

對照品腺苷（批號110879-202204）、白術(shù)內(nèi)酯I（批號111975-201501）、白術(shù)內(nèi)酯II（批號111976-201501）、白術(shù)內(nèi)酯III（批號111978-201501）均購于中國食品藥品檢定研究院；所有對照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%；質(zhì)譜純乙腈（Thermo Fisher 公司，美國）；色譜純甲酸（賽默飛世爾科技有限公司）；亮氨酸腦啡肽（Sigma 公司，美國）；水為超純水；其余試劑均為分析純。

白術(shù)藥材樣品采自河北、安徽、浙江3 個產(chǎn)區(qū)，均由神威藥業(yè)有限公司提供，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院吳修紅教授鑒定為菊科植物白術(shù)A.macrocephalaKoidz.的干燥根莖。樣品詳細(xì)采集信息見表1。

表1 白術(shù)樣品信息Table 1 Sample information of A. macrocephala

2 方法

2.1 供試品溶液制備

取白術(shù)藥材粉末（過四號篩）1 g，精密稱定，置于50 mL 具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取1 h（250 W、40 kHz），取出放冷稱定質(zhì)量，以75%甲醇補足減失質(zhì)量，搖勻，12 000 r/min 離心10 min，取上清液過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。另等量吸取各供試品溶液400 μL，混勻，制成質(zhì)量控制（quality control，QC）樣品，用于監(jiān)測分析系統(tǒng)和方法的穩(wěn)定性。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取腺苷、白術(shù)內(nèi)酯I、白術(shù)內(nèi)酯II、白術(shù)內(nèi)酯III 對照品適量，分別置于10 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度分別為20.012、20.008、20.017、20.011 μg/mL 的對照品溶液。

2.3 色譜條件

Waters AcquityTMUPLC HSS T3 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），流動相為0.1%甲酸乙腈溶液（A）-0.1%甲酸水溶液（B）；梯度洗脫：0～7 min，1%～40% A；7～12 min，40%～70% A；12～16 min，70%～100% A；16～18 min，100% A；18～19 min，100%～1% A；19～21 min，1% A；柱溫40 ℃；樣品管理器溫度10 ℃；體積流量0.4 mL/min；進(jìn)樣量3 μL。

2.4 質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源（ESI），正、負(fù)離子模式檢測，離子源溫度110 ℃，脫溶劑氣溫度350 ℃，脫溶劑氣流量700 L/h，錐孔氣流量50 L/h，提取錐孔電壓4.0 V，樣品錐孔電壓為35 V，正、負(fù)離子模式毛細(xì)管電壓分別為2.8、3.0 kV。采用亮氨酸-腦啡肽溶液（Leucine Enkephalin，[M ＋H]+556.277 1、[M-H]-554.261 5）為質(zhì)量鎖定溶液。采用MSE模式采集數(shù)據(jù)，掃描時間為0.2 s，掃描范圍為m/z50～1 200，質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集的碰撞能為10～35 V。

2.5 數(shù)據(jù)采集與分析

數(shù)據(jù)采集由MassLynx V4.2 工作站完成。應(yīng)用Progenesis QI 分析軟件對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，正離子模式下，化合物準(zhǔn)分子離子以[M＋H]+、[M＋Na]+、[2M＋H]+的形式被檢測；負(fù)離子模式下，準(zhǔn)分子離子以[M-H]-、[M＋COO]-、[2M-H]-的形式被檢測。通過分析各成分的保留時間、一級、二級質(zhì)譜信息結(jié)合文獻(xiàn)中報道的化合物裂解規(guī)律、同條件下對照品的裂解規(guī)律，并與構(gòu)建的白術(shù)化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫、MassBank、PubChem 等在線數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對比分析，完成化合物的識別鑒定。

多元統(tǒng)計分析：通過Progenesis QI 軟件對質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，將處理后的數(shù)據(jù)導(dǎo)出到MetaboAnalyst 5.0 網(wǎng)站進(jìn)行無監(jiān)督的主成分分析（ principal component analysis ， PCA ）， 再用SIMCA14.1 軟件進(jìn)行有監(jiān)督的正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA），依據(jù)OPLS-DA 中的變量重要性投影值（variable importance in projection，VIP）＞3，結(jié)合單因素方差分析（P＜0.05）篩選不同產(chǎn)地白術(shù)藥材間具有顯著性差異的化學(xué)成分。

3 結(jié)果與分析

3.1 白術(shù)藥材化學(xué)成分的鑒定

按“2.3”和“2.4”項下方法進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各產(chǎn)地白術(shù)樣品的基峰強度色譜圖（base peak intensity，BPI）大致輪廓較為相似，但色譜峰高度有所差異，提示各產(chǎn)地白術(shù)間化學(xué)成分的含量存在差異。按“2.5”項下方法分析，最終從白術(shù)藥材中鑒定出53 個化學(xué)成分，代表性BPI 譜圖見圖1。

圖1 正、負(fù)離子模式下白術(shù)藥材的基峰強度色譜圖Fig. 1 Basic peak intensity chromatogram of A. macrocephala in positive and negative ion modes

以白術(shù)內(nèi)酯III 為例闡釋化學(xué)成分裂解途徑及規(guī)律的鑒定過程。首先，Progenesis QI 軟件在9.95 min 時匹配到m/z249.153 4 [M＋H]+的離子峰，其脫水形成m/z231.138 4 的碎片離子，碎片離子m/z231.138 4 丟失-CO、-C3H6、-C5H8形成203.142 4、189.088 4、163.076 8 的碎片離子，碎片離子m/z189.088 4 丟失-CH2形成碎片離子m/z175.075 5；碎片離子163.076 8 丟失-CO2形成m/z119.087 9 的碎片離子，再丟失-CH2形成m/z105.070 0 或丟失-C2H4形成m/z91.056 3，裂解過程與文獻(xiàn)報道一致[17]，二級質(zhì)譜圖及具體裂解途徑如圖2 所示。通過與白術(shù)內(nèi)酯III 對照品比對，鑒定該化合物為白術(shù)內(nèi)酯III。其他化合物采用相同方法鑒定，具體化合物詳細(xì)信息見表2。

圖2 白術(shù)內(nèi)酯III 的二級質(zhì)譜圖及裂解途徑Fig. 2 MS2 spectrum and fragmentation pathway of atractylenolide III

3.2 不同產(chǎn)地白術(shù)差異成分分析

3.2.1 PCA 主成分分析是一種無監(jiān)督學(xué)習(xí)方法，它通過提取最重要的分析信息來降低數(shù)據(jù)集的維度[18]。運用PCA 的方法對不同數(shù)據(jù)組（包括質(zhì)控樣本）之間的關(guān)系進(jìn)行評價，所有組的PCA得分圖見圖3。結(jié)果顯示，QC 樣品緊密聚集在一起，說明儀器穩(wěn)定性良好，數(shù)據(jù)質(zhì)量良好。3 個產(chǎn)地的白術(shù)樣品均分別明顯呈現(xiàn)出組內(nèi)聚類，組間分離的趨勢，表明不同產(chǎn)地白術(shù)樣品化學(xué)成分間存在明顯差異。

圖3 正、負(fù)離子模式下不同產(chǎn)地白術(shù)藥材的PCA 得分圖Fig. 3 PCA scores plots of A. macrocephala from different origins in positive and negative ion modes

3.2.2 OPLS-DA OPLS-DA 可將組間差異最大化，在海量數(shù)據(jù)集中尋找存在于不同組別間的差異性成分，廣泛用于不同產(chǎn)地藥材之間的差異性研究[19-20]。在PCA 的基礎(chǔ)上，本研究對每個產(chǎn)地與其他2 個產(chǎn)地的樣品分別進(jìn)行OPLS-DA，結(jié)果表明每個產(chǎn)地與其他2 個產(chǎn)地之間均表現(xiàn)出較明顯的分離趨勢，與PCA 結(jié)果一致，且組別間分離效果更加顯著，見圖4-A。在OPLS-DA 模型中，各模型組R2X（cum）、R2Y（cum）和Q2值均大于0.5，表明模型構(gòu)建良好，預(yù)測性可靠。對OPLS-DA 進(jìn)行驗證，設(shè)定隨機(jī)排列檢驗次數(shù)為200 次，見圖4-B。結(jié)果顯示，各組模型驗證中原始R2和Q2均大于Y置換后相應(yīng)的值，且Q2點的回歸線在Y軸的截距小于0，說明模型預(yù)測能力好，不存在過擬合現(xiàn)象，可用于區(qū)分不同產(chǎn)地白術(shù)藥材，模型具體相關(guān)參數(shù)見表3。散點得分圖（S-plot）可以表示組間的差異成分，數(shù)據(jù)點離原點越遠(yuǎn)，則該變量對樣本分組差異的貢獻(xiàn)越大，利用S-plot 圖可篩選出存在顯著性差異（VIP＞3）的化學(xué)成分，見圖4-C。

圖4 正、負(fù)離子模式下不同產(chǎn)地白術(shù)藥材的OPLS-DA 得分圖、置換檢驗圖及S-plot 圖Fig. 4 OPLS-DA scores plot, permutation test polt and S-plot of A. macrocephala from different origins in positive and negative ion modes

表3 OPLS-DA 模型參數(shù)Table 3 Model parameters of OPLS-DA

根據(jù)OPLS-DA 結(jié)果，以VIP 值＞3，單因素方差分析P＜0.05 為篩選標(biāo)準(zhǔn)，共表征出21 個差異化學(xué)成分，具體分為各產(chǎn)地的特有成分3 個及共有成分18 個，包括尿苷、腺苷、L-異亮氨酸、新綠原酸、L-纈氨酸、7-羥基香豆素、綠原酸、咖啡酸、8,9-epoxy atracolactone、4,6-二羥基-3,3a-二氫白術(shù)內(nèi)酯III、6,9-二羥基-3,3a-二氫白術(shù)內(nèi)酯III、furan sesquiterpene、9,10-環(huán)氧-12（Z）-十八碳烯酸、白術(shù)內(nèi)酯III、白術(shù)內(nèi)酰胺、白術(shù)內(nèi)酯I、白術(shù)內(nèi)酯II、芹子二烯酮、3β-乙酰氧基蒼術(shù)酮、雙白術(shù)內(nèi)酯、棕櫚酸等，各成分的量以各樣品相對應(yīng)的峰面積表示，見圖5。其中河北安國產(chǎn)地具有1 個特有成分，為9,10-環(huán)氧-12（Z）-十八碳烯酸，且腺苷、6,9-二羥基-3,3a-二氫白術(shù)內(nèi)酯III、furan sesquiterpene、白術(shù)內(nèi)酯I、白術(shù)內(nèi)酯II、雙白術(shù)內(nèi)酯的含量最高。安徽亳州產(chǎn)地具有1 個特有成分，為L-異亮氨酸，且新綠原酸、7-羥基香豆素、綠原酸、咖啡酸的含量最高。浙江磐安產(chǎn)地具有1 個特有成分，為白術(shù)內(nèi)酰胺，且尿苷、L-纈氨酸、8,9-epoxy atracolactone、4,6-二羥基-3,3a-二氫白術(shù)內(nèi)酯III、白術(shù)內(nèi)酯III、芹子二烯酮、3β-乙酰氧基蒼術(shù)酮、棕櫚酸含量最高。這些差異成分均可作為區(qū)分不同產(chǎn)地白術(shù)的特征成分。

圖5 不同產(chǎn)地白術(shù)藥材差異化合物對比分析Fig. 5 Analysis of differential compounds in A. macrocephala from different origins

4 討論

目前，《中國藥典》2020 年版對白術(shù)的質(zhì)量控制方法主要為定性鑒別，包括感官評價、顯微鑒定與理化鑒別，無客觀準(zhǔn)確的量化指標(biāo)，具有一定的局限性。目前的研究多以一種或幾種白術(shù)內(nèi)酯類成分的含量作為判斷不同產(chǎn)地白術(shù)藥材間質(zhì)量差異的指標(biāo)，而中藥為復(fù)雜的化學(xué)體系，僅靠幾個指標(biāo)性成分不能全面體現(xiàn)其品質(zhì)差異[21-[2]]。本研究采用UPLC-MSE技術(shù)準(zhǔn)確快速地對河北、安徽、浙江產(chǎn)區(qū)白術(shù)藥材進(jìn)行分析，鑒定出53 個化學(xué)成分并通過多元統(tǒng)計分析方法表征出21 個差異性成分，包括18 個共有差異成分及3 個特有成分。在河北安國產(chǎn)地中腺苷、6,9-二羥基-3,3a-二氫白術(shù)內(nèi)酯III、furan sesquiterpene、白術(shù)內(nèi)酯I、白術(shù)內(nèi)酯II、雙白術(shù)內(nèi)酯的含量最高。安徽亳州產(chǎn)地中新綠原酸、7-羥基香豆素、綠原酸、咖啡酸的含量最高。浙江磐安產(chǎn)地中尿苷、L-纈氨酸、8,9-epoxy atracolactone、4,6-二羥基-3,3a-二氫白術(shù)內(nèi)酯III、白術(shù)內(nèi)酯III、芹子二烯酮、3β-乙酰氧基蒼術(shù)酮、棕櫚酸含量最高。黃小方等[24]采用UPLC-MS 技術(shù)對不同產(chǎn)地白術(shù)藥材進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)各產(chǎn)地藥材的差異主要體現(xiàn)在白術(shù)內(nèi)酯類成分上。已有的對白術(shù)中化學(xué)成分含量檢測的研究顯示，不同產(chǎn)地白術(shù)在白術(shù)內(nèi)酯類及有機(jī)酸類成分含量上存在一定差別[25-[3]]。本研究采用UPLC-MSE整體化學(xué)成分分析所得到的差異化學(xué)成分與文獻(xiàn)報道一致性較高。此外，本研究還確定了9,10-環(huán)氧-12(Z)-十八碳烯酸為河北安國產(chǎn)地的特有成分，L-異亮氨酸為安徽亳州產(chǎn)地的特有成分，白術(shù)內(nèi)酰胺為浙江磐安產(chǎn)地的特有成分，這些特有成分可作為產(chǎn)地區(qū)分的依據(jù)。上述分析提示，不同產(chǎn)地白術(shù)藥材因所處的氣候、土壤、地勢地貌等環(huán)境不同，在化學(xué)成分的種類及含量上產(chǎn)生了很大變化，即生成了特有成分與共有成分，提示白術(shù)的質(zhì)量與其產(chǎn)地密切相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)浙江、河北產(chǎn)白術(shù)的白術(shù)內(nèi)酯類成分含量明顯高于安徽產(chǎn)地。研究表明，倍半萜類化合物是白術(shù)中含量最豐富的生物活性成分之一，其中白術(shù)內(nèi)酯類成分已被證明具有顯著的抗腫瘤、抗菌、抗炎、調(diào)節(jié)免疫、調(diào)節(jié)胃腸道功能和神經(jīng)保護(hù)作用[28]；雙白術(shù)內(nèi)酯可通過抑制活性氧生成來減少損傷細(xì)胞的死亡，從而發(fā)揮抗阿爾茨海默病的作用[29-30]；芹子二烯酮、3β-乙酰氧基蒼術(shù)酮具有抗炎作用[31]。而安徽產(chǎn)地的有機(jī)酸類化合物如綠原酸、新綠原酸等的含量高于其他兩產(chǎn)地，上述成分具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、調(diào)血脂、降血糖和免疫調(diào)節(jié)等多方面的藥理作用[32-33]。以上分析提示不同產(chǎn)地白術(shù)藥材間的差異化學(xué)成分可能對其生物活性產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響其功效及配伍情況下的療效，后續(xù)可結(jié)合不同層次的藥效學(xué)實驗進(jìn)行闡釋與驗證，為臨床依據(jù)不同病癥、不同產(chǎn)地藥材合理的調(diào)整用藥提供更好的指導(dǎo)。

本實驗基于河北、安徽、浙江3 個產(chǎn)區(qū)的白術(shù)藥材展開研究，對不同產(chǎn)地白術(shù)藥材的差異性進(jìn)行分析，找出其特有成分及共有差異成分，為白術(shù)的產(chǎn)地鑒別及質(zhì)量評價提供了重要參考，也為后續(xù)含白術(shù)的經(jīng)典名方開發(fā)、中藥質(zhì)量標(biāo)志物研究及藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供科學(xué)依據(jù)和理論支撐。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突