忍冬VIGS 基因沉默體系構(gòu)建

褚洪月，劉振華, ，李 佳, ，張永清, ，蒲高斌, *

1. 山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355

2. 山東省中藥質(zhì)量控制與全產(chǎn)業(yè)鏈建設(shè)協(xié)同創(chuàng)新中心，山東 濟(jì)南 250355

金銀花為忍冬科忍冬屬植物忍冬Lonicera japonicaThunb.的干燥花蕾或帶少量初開(kāi)的花，始載于《名醫(yī)別錄》，是我國(guó)傳統(tǒng)中藥材，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱等功效[1]。金銀花市場(chǎng)需求巨大，據(jù)統(tǒng)計(jì)有500 多個(gè)臨床組方和200 多種中成藥中都含有金銀花。山東、河南、河北是金銀花的主產(chǎn)區(qū)[2]，目前栽培面積超過(guò)6.7萬(wàn)公頃，年產(chǎn)量3 000 余萬(wàn)千克。由于忍冬育種基礎(chǔ)薄弱，傳統(tǒng)育種方法周期長(zhǎng)、效率低，導(dǎo)致生產(chǎn)中缺乏良種，嚴(yán)重制約了金銀花產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

挖掘忍冬關(guān)鍵性狀的決定基因，將分子標(biāo)記輔助育種與傳統(tǒng)育種方式結(jié)合，是解決忍冬生產(chǎn)中良種缺乏的有效途徑。為此，本課題組前期從忍冬中克隆獲得了HQT[3]、C3’H[4]、MLO[5]、MYB[6]、U6 啟動(dòng)子[7]等多個(gè)與質(zhì)量和抗性相關(guān)的基因。遺憾的是，由于忍冬穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化效率極低，很多基因只能在體外或異源植株中驗(yàn)證功能，缺乏直接的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

病毒誘導(dǎo)的基因沉默具有操作簡(jiǎn)便、研究周期短、不需遺傳轉(zhuǎn)化等優(yōu)點(diǎn)，已在多種單、雙子葉植物中廣泛應(yīng)用[8-9]。它基于植物對(duì)病毒基因復(fù)制的防御機(jī)制，綜合植物病毒的非轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)性侵染、植物的免疫應(yīng)答及細(xì)胞RNAi 沉默機(jī)制于一體，可以簡(jiǎn)易快速且高效的沉默靶向基因，極大地方便了植物基因功能的反向遺傳學(xué)研究[10-11。與傳統(tǒng)的基因功能分析方法相比，病毒誘導(dǎo)的基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）能夠在侵染植物當(dāng)代對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行沉默和功能分析，無(wú)需開(kāi)發(fā)穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子，并且具有沉默單個(gè)或多個(gè)基因家族成員的潛力[12]。

在多種植物中，黃瓜花葉病毒（Cucumbermosaic virus，CMV）已被應(yīng)用于VIGS 體系的開(kāi)發(fā)，包括本生煙草[13]、菠菜[14]、馬鈴薯[15]、香蕉[16]和玉米[17]等。Wang 等[18]基于天然玉米感染CMV 株，開(kāi)發(fā)了一套CMV 玉米北京分離物（ZMBJ-CMV）的高效病毒誘導(dǎo)基因VIGS，為玉米快速高效的基因功能研究提供了工具。Tasaki 等[19]開(kāi)發(fā)了一種基于香蕉感染CMV分離物CMV 20 的VIGS 系統(tǒng)，并為香蕉開(kāi)發(fā)了一種高效的農(nóng)桿菌接種方法，高感染率和延長(zhǎng)的沉默將為加速香蕉的功能基因組研究提供寶貴的工具。VIGS已成功用于多種藥用植物性狀功能基因的挖掘，VIGS系統(tǒng)將會(huì)在更多的植物物種，尤其是在那些難以通過(guò)轉(zhuǎn)基因方法分析的藥用植物中得以應(yīng)用[20-22]，成為后基因組時(shí)代作物基因功能研究的重要技術(shù)手段。

八氫番茄紅素脫氫酶（phytoene desaturase，PDS）是類(lèi)胡蘿卜素合成途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶。沉默表達(dá)PDS基因后，類(lèi)胡蘿卜素合成途徑受阻，進(jìn)而導(dǎo)致葉綠素被光氧化降解，植株呈現(xiàn)白化現(xiàn)象[23-24]。因此，PDS基因被作為報(bào)告基因在VIGS 沉默體系中普遍應(yīng)用。然而，有關(guān)忍冬VIGS 的研究目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究以忍冬PDS（LjPDS）基因?yàn)榍腥朦c(diǎn)，通過(guò)從忍冬中克隆PDS基因，利用生物信息學(xué)分析軟件對(duì)其進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分析，構(gòu)建了VIGS 體系，驗(yàn)證并優(yōu)化了VIGS 處理忍冬的沉默效果，為開(kāi)展忍冬關(guān)鍵基因功能研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料

選用山東中醫(yī)藥大學(xué)培育的忍冬新品種‘華金2 號(hào)’幼苗，由山東中醫(yī)藥大學(xué)蒲高斌教授鑒定為忍冬L.japonicaThunb.。多糖多酚植物RNA 提取試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser 和TB Green Premix Ex Taq II 均購(gòu)自TaKaRa 公司；C58C1菌株購(gòu)自上海唯地生物技術(shù)有限公司；引物合成和測(cè)序均由鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司負(fù)責(zé)。

2 方法

2.1 樣品的處理

其在組培室中播種并培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：溫度23 ℃，光強(qiáng)度110 μmol/(m2·s)，光循環(huán)16 h 光照/8 h 黑暗，濕度60%。適合開(kāi)發(fā)VIGS 載體的病毒在植物中應(yīng)具有高傳染性，但癥狀輕微或無(wú)癥狀。為此選用了Wang 等[18]改造CMV 基因組RNA1、RNA2 和RNA3 重組構(gòu)建后的ZMBJ-CMV VIGS 載體，該載體由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病理學(xué)系周濤研究組提供，載體最適合的插入片段大小為100～300 bp。

2.2 LjPDS 基因片段的克隆

根據(jù)課題組前期的‘華金2 號(hào)’全基因測(cè)序結(jié)果，使用Primer 6.0 選取同源性較高的片段設(shè)計(jì)LjPDS基因的特異性引物（表1）。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

RNA提取步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。提取的RNA經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。使用TAKARA 公司的PrimeScripTM RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒，將合格的RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以上述cDNA 為模板，使用北京聚合美生物科技有限公司2×M5 HiPer plus Taq HiFi PCR mix 高保真Taq 酶mix 進(jìn)行PDS基因擴(kuò)增，PCR 擴(kuò)增體系：2×M5 HiPer plus Taq HiFi PCR mix 10 μL、上引物0.5 μL、下引物0.5 μL、cDNA 1 μL 和ddH2O 8 μL。PCR 擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，57 ℃30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)32 次；72 ℃終延伸5 min；4 ℃保存。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，確定條帶的正確性和單一性。然后使用膠回收試劑盒進(jìn)行PCR 產(chǎn)物回收，回收步驟參考說(shuō)明書(shū)?；厥债a(chǎn)物與pMD18-T 載體按照說(shuō)明書(shū)的步驟和方法進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化到DH5α 感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)抗性篩選后，挑取陽(yáng)性單菌落，用引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，并將陽(yáng)性菌落送至鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司測(cè)序。

2.3 LjPDS 蛋白生物信息學(xué)分析

將LjPDS基因的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析。 首先在 NCBI 在線(xiàn)軟件 ORF finder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）分析基因的開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF）和翻譯出的蛋白序列；通過(guò)NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)的在線(xiàn)軟件blast（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）尋找與LjPDS 蛋白序列相似的其他物種的PDS 蛋白序列并下載；DNAMAN 6.0 軟件對(duì)不同物種PDS 蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)分析，找出相對(duì)保守的結(jié)構(gòu)域；通過(guò)MEGA X 軟件對(duì)LjPDS 蛋白與其他物種PDS 蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析。

2.4 VIGS 載體的構(gòu)建方法

將測(cè)序正確的大腸桿菌提取質(zhì)粒，采用限制性?xún)?nèi)切酶KpnI、XbaI同時(shí)對(duì)該質(zhì)粒和pCMV201-2bN81質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切。將酶切后的目的片段和pCMV201-2bN81載體回收，利用T4 連接酶進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中。經(jīng)抗性篩選后，挑取陽(yáng)性單菌落，用載體引物進(jìn)行PCR 檢測(cè)。參考Wang 等[18]實(shí)驗(yàn)方法，成功連入插入片段的pCMV201-2bN81重組質(zhì)粒經(jīng)PCR 擴(kuò)增得到的產(chǎn)物大小為431 bp 插入片段長(zhǎng)度，未能成功插入片段的pCMV201-2bN81質(zhì)粒經(jīng)PCR 擴(kuò)增得到的產(chǎn)物大小約為431 bp。PCR 程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃、30 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)30次；72 ℃終延伸10 min。將正確插入的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌土壤桿菌C58C1。

2.5 農(nóng)桿菌接種

將攜帶有 pCMV101 、 pCMV201-2bN81、pCMV201-2bN81:LjPDS、pCMV301 的根癌土壤桿菌C58C1 在帶有卡那霉素（質(zhì)量濃度為50 μg/mL）和利福平（質(zhì)量濃度為25 μg/mL）的LB 培養(yǎng)基中28 ℃、180 r/min 震蕩培養(yǎng)36 h。再以1∶100 的比例取新鮮菌液接種于20 mL LB 液體培養(yǎng)基中，使根癌土壤桿菌的A600值在0.6～1.0。4 000 r/min 離心10 min 收集菌體，棄上清液。使用10 mmol/L 氯化鎂（MgCl，天津市鼎盛鑫化工有限公司）、10 mmol/L MES 水合物（MES，上海麥克林生化科技有限公司）、100 μmol/L 乙酰丁香酮（AS，上海麥克林生化科技有限公司），加入ddH2O 至100 mL 組成的侵染緩沖液，將重懸洗滌后的菌體吸光度（A）調(diào)整至A600＝1.0。室溫靜置誘導(dǎo)至少3 h。

將誘導(dǎo)后的分別攜帶有pCMV101、pCMV201-2bN81:LjPDS、pCMV301 的農(nóng)桿菌分別以1∶1∶1 的比例混合，用1 mL 不帶針頭的注射器浸潤(rùn)接種生長(zhǎng)適合的忍冬幼苗葉片背面。設(shè)置3 個(gè)處理組：野生型忍冬為空白對(duì)照組（CK）、空載體注射為陰性對(duì)照組（pCMV201-2bN81）、含PDS基因的重組載體注射為實(shí)驗(yàn)組（pCMV201-2bN81:LjPDS），每組10 株，平行測(cè)定3 次。注射后放置23 ℃黑暗培養(yǎng)2 d，之后正常光照培養(yǎng)。

2.6 測(cè)定指標(biāo)

采集接種病毒15 d 后有明顯白化表型癥狀的忍冬葉片（接種葉上一葉），提取葉片總RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用SYBR Green 法進(jìn)行qRTPCR，分析PDS的相對(duì)表達(dá)量。選用忍冬Actin基因（NTU60495）為內(nèi)參基因[4]，并設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物（表1）。相對(duì)表達(dá)量按照2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算，數(shù)據(jù)以±s表示，使用SPSS 軟件分析結(jié)果，顯著性P＜0.05、0.01。使用GraphPad prism 軟件進(jìn)行作圖。

為驗(yàn)證LjPDS沉默后葉綠素的變化情況，分別取CK 和沉默處理組的等位葉3 組，測(cè)定葉綠素和類(lèi)胡蘿卜素含量，方法參考胡黎[25]實(shí)驗(yàn)。

葉綠素a 含量＝13.95×A665nm－6.88×A649nm

葉綠素b 含量＝24.96×A649nm－7.32×A665nm

葉綠素總含量＝葉綠素a＋葉綠素b

葉綠素的含量＝（葉綠素的含量×提取液體積×稀釋倍數(shù)）/樣品鮮質(zhì)量

類(lèi)胡蘿卜素含量＝(1 000×A470nm－2.05×葉綠素a 含量－114.8×葉綠素b 含量)/245

2.7 VIGS 體系的優(yōu)化

2.7.1 菌液吸光度 采用葉片注射法，將3 種不同A值（A600＝0.6、0.8、1.0）的農(nóng)桿菌注入植株葉片，置于23 ℃黑暗處理24 h 后，轉(zhuǎn)移至光照16 h，黑暗8 h，23 ℃繼續(xù)培養(yǎng)，每次處理21 株幼苗，重復(fù)3 次。

2.7.2 接種方法 處理1，在子葉期，用無(wú)針頭注射器吸取接種液，注入植株子葉背面，置于23 ℃黑暗處理24 h 后，轉(zhuǎn)移至光照16 h，黑暗8 h，23 ℃繼續(xù)培養(yǎng)，每次處理21 株幼苗，重復(fù)3 次。處理2，在子葉期，先用注射法接種，再將幼苗真空浸潤(rùn)法進(jìn)行處理，在真空壓力為0.60 MPa 條件下靜止2 min，置于23 ℃黑暗處理24 h 后，轉(zhuǎn)移至光照16 h，黑暗8 h，23 ℃繼續(xù)培養(yǎng)，每次處理21 株幼苗，重復(fù)3 次。

當(dāng)植株出現(xiàn)光漂白現(xiàn)象后，統(tǒng)計(jì)光漂白植株數(shù)量，并計(jì)算VIGS 沉默株率。以白化植株出現(xiàn)的百分率標(biāo)記為VIGS 的沉默株率。

植株沉默株率＝白化株數(shù)/轉(zhuǎn)化總株數(shù)

3 結(jié)果與分析

3.1 LjPDS 基因片段克隆

首先，本研究對(duì)LjPDS基因片段進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到1 條135 bp 的目的條帶（圖1），條帶大小符合預(yù)期。經(jīng)測(cè)序，結(jié)果顯示PDS序列和參考序列一致，說(shuō)明該條帶是目標(biāo)靶基因。

圖1 忍冬LjPDS PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig. 1 Result of PCR amplification of LjPDS gene

3.2 LjPDS 生物信息學(xué)分析

本課題組前期研究已獲得LjPDS全長(zhǎng)序列。PDS全長(zhǎng)1 458 bp，通過(guò)NCBI 在線(xiàn)軟件ORF finder 分析，該基因的ORF 為1 458 bp，編碼485個(gè)氨基酸。利用MEGA X 軟件對(duì)LjPDS 蛋白與其他物種PDS 蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析。結(jié)果顯示（圖2），可以看出LjPDS 與圖中的植物同源性都較高。利用DNAMAN 軟件將‘華金2 號(hào)’PDS 蛋白序列與其他幾個(gè)物種PDS 蛋白序列進(jìn)行多序列對(duì)比，見(jiàn)圖3。黑色陰影表示非常保守的區(qū)域，灰色陰影表示相對(duì)保守的區(qū)域。圖中黑色陰影標(biāo)記氨基酸序列占大部分，PDS 蛋白序列（XP_034916536.1）與獼猴桃Actinidiachinensis（ PSS26226.1 ）、 芝 麻Sesamumindicum（ XP_011087837.1 ）、 大 豆Glycinemax（XP_003524753.1）、赤小豆Vignaumbellata（XP_047182202.1）和番茄Solanumlycopersicum（XP_004232522.1）蛋白序列的相似度分別為74.95%、70.70%、70.52%、70.78%和69.61%，說(shuō)明忍冬LjPDS 與其他幾個(gè)物種PDS 氨基酸序列同源性非常高，其在進(jìn)化發(fā)育相對(duì)保守。

圖2 不同物種PDS 蛋白遺傳進(jìn)化關(guān)系的分析Fig. 2 Genetic evolutionary relationship analysis of PDS proteins in different species

3.3 VIGS 載體的構(gòu)建

將雙酶切后的目的片段與載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。使用載體引物PCR 檢測(cè)陽(yáng)性菌斑，成功連入插入片段的pCMV201-2bN81重組質(zhì)粒經(jīng)PCR 擴(kuò)增得到的產(chǎn)物大小為431 bp+插入片段長(zhǎng)度（圖4），條帶大小符合預(yù)期，說(shuō)明VIGS 載體構(gòu)建成功，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖4 陽(yáng)性克隆菌落鑒定Fig. 4 Identification of positive clonal colony

3.4 qRT-PCR 檢測(cè)PDS 基因沉默效果

利用農(nóng)桿菌將pCMV201-2bN81:LjPDS載體侵染忍冬幼苗葉片，發(fā)現(xiàn)當(dāng)忍冬植株P(guān)DS基因被沉默后，植株葉片出現(xiàn)褪綠，白化表型，而陰性對(duì)照植株（侵染空載體）表型則沒(méi)有變化（圖5），初步說(shuō)明VIGS 載體構(gòu)建成功。

圖5 VIGS 瞬時(shí)沉默表達(dá)LjPDS 的忍冬植株表型Fig.5 Phenotypes of L. japonica plants expressing LjPDS with transient silencing by VIGS

為進(jìn)一步確定PDS基因的沉默效率，本研究采用qRT-PCR 技術(shù)檢測(cè)PDS基因的表達(dá)量。結(jié)果表明，與野生型忍冬相比，實(shí)驗(yàn)組3 個(gè)單株葉片中PDS基因在忍冬體內(nèi)的表達(dá)量顯著降低，沉默效率高達(dá)80%（圖6）。

圖6 LjPDS 基因的沉默效果檢測(cè)Fig. 6 Detection of silencing efficiency of LjPDS gene

3.5 沉默LjPDS 基因忍冬葉片色素含量降低

通過(guò)對(duì)CK 和沉默LjPDS基因有明顯白化現(xiàn)象的忍冬葉片，研究進(jìn)一步測(cè)定了CK 和白化忍冬葉片中葉綠素及類(lèi)胡蘿卜素含量，發(fā)現(xiàn)沉默LjPDS會(huì)使忍冬葉片葉綠素和類(lèi)胡蘿卜素的含量降低，其降低的程度較為顯著（圖7）。

圖7 沉默LjPDS 葉綠素和類(lèi)胡蘿卜素量降低Fig. 7 Lower chlorophyll and carotenoid contents in silent LjPDS

3.6 VIGS 體系的優(yōu)化

不同寄主植物中基因沉默的效率及成功率存在差異，為了更好地評(píng)價(jià)VIGS 的沉默株率，本研究比較不同農(nóng)桿菌菌液（A600＝0.60、0.80 和1.00）及不同的接種方法對(duì)忍冬PDS基因沉默株率的影響。結(jié)果顯示，一定范圍內(nèi)農(nóng)桿菌接種（A值為0.60～1.00）對(duì)VIGS 效率影響不明顯，當(dāng)農(nóng)桿菌菌液A600＝0.80 時(shí)，PDS基因的沉默比例最高，為50.79%，農(nóng)桿菌A600＝0.60 和A600＝1.00時(shí)沉默比例分別為44.44%和49.20%。結(jié)果如圖8所示，注射法和注射真空浸潤(rùn)法的沉默比例分別為50.79%和66.66%，可以采用注射真空浸潤(rùn)法提高沉默效率。

圖8 農(nóng)桿菌不同接種吸光度 (A) 及不同接種方法 (B) 對(duì)LjPDS 基因沉默株率的影響Fig. 8 Effects of different inoculation absorbances (A) and different inoculation methods (B) of Agrobacterium tumefaciens on silencing rate of LjPDS gene

4 討論

目前尚未發(fā)現(xiàn)可靠的遺傳轉(zhuǎn)化體系、基因沉默體系和基因敲除體系，能夠使忍冬植物的再生和遺傳穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。然而，能夠分析忍冬的重要基因功能將是進(jìn)一步表征植物的重要前提。因此，本研究利用生物信息學(xué)分析和PCR 技術(shù)構(gòu)建VIGS 載體，以期建立忍冬VIGS 體系，為研究忍冬關(guān)鍵基因的功能奠定基礎(chǔ)。

1、2、3 號(hào)分別為沉默組3 個(gè)單株葉片PDS基因表達(dá)量，***P＜0.01 水平上存在顯著差異，下圖同。

1, 2, 3 were the expression levels ofPDSgene in the leaves of three single plants in the silencing group, respectively,***P＜ 0.01 indicates a significant difference at the level, same as below.

本研究通過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)忍冬科植物中PDS基因高度同源，進(jìn)而利用其保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)引物并成功克隆出用PDS基因片段，并利用酶切連接的方法構(gòu)建了VIGS 載體，轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌并侵染忍冬葉片，出現(xiàn)白化現(xiàn)象，qRT-PCR 結(jié)果發(fā)現(xiàn)VIGS 沉默株系中PDS基因表達(dá)量顯著降低。綜上，VIGS 體系可在忍冬中成功地發(fā)揮作用，成功地沉默了忍冬PDS基因，并獲得PDS基因沉默的忍冬植株。Li 等[26]建立了1個(gè)基于CMV 的VIGS 系統(tǒng)，可以有效的沉默玉米基因，克服了目前玉米VIGS 病毒感染率低、沉默維持時(shí)間短的局限性。董婷婷[27]以CMV-Fny 侵染性克隆為基礎(chǔ)，構(gòu)建2b 缺失突變載體pCB301-Fny2-2b del，完成對(duì)水芹CMV-Fny 侵染性克隆的改造，改造好的載體成功沉默水芹PDS基因。

VIGS 具有不依賴(lài)遺傳轉(zhuǎn)化，接種方便，沉默效率高的優(yōu)勢(shì)，但由于VIGS 依賴(lài)于轉(zhuǎn)錄后基因沉默和轉(zhuǎn)錄基因沉默以及沉默信號(hào)的全身傳遞，不同個(gè)體、器官和組織的沉默程度不同，沉默的起始時(shí)間和持續(xù)時(shí)間也可能因個(gè)體和物種而異，因此，還需要進(jìn)一步研究體系優(yōu)化，使其沉默效率更加高效。盡管如此，但開(kāi)發(fā)的VIGS 方法可用于執(zhí)行反向遺傳方法以鑒定未知的基因功能，且實(shí)驗(yàn)處理組較對(duì)照組也有極顯著差異，這表明本方法可以用于大規(guī)?；虺聊潭参锊牧系闹苽?，VIGS 可以快速有效地用于分析忍冬中的基因功能。VIGS 的成功建立可以消除組織培養(yǎng)的需要，為研究忍冬的基因功能提供有效的方法，加速忍冬功能基因組研究的進(jìn)程。為研究忍冬基因功能引入新途徑，提供創(chuàng)新的忍冬種質(zhì)資源。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突