茯苓多糖在秀麗隱桿線蟲中的抗氧化和抗衰老作用及其作用機制

宋禎彥，黃亞琦#，王也彤，鄧 嘉，甄達貴，譚年花，成紹武*

1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院 中西醫(yī)結(jié)合心腦疾病防治湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410208

2. 靖州苗族侗族自治縣質(zhì)量計量檢驗檢測中心，湖南 懷化 418400

衰老是以生物機能的下降和適應(yīng)性、抵抗力的減退為特征的退行性生理過程，其中氧化應(yīng)激損傷與衰老密切相關(guān)[1]。正常情況下機體維持著“氧化-抗氧化”之間的動態(tài)平衡，但這種平衡可隨著年齡增長被打破，伴隨年齡增長的是自由基過剩和（或）抗氧化劑的缺失，進而導(dǎo)致生物膜結(jié)構(gòu)被破壞、細胞器功能出現(xiàn)障礙，蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等生物大分子物質(zhì)出現(xiàn)損傷[2]。在機體衰老的有氧代謝中，自由基增加或抗氧化劑缺失使得細胞毒性增加和機體抗氧化能力下降，這種變化將造成生物膜、氨基酸鏈及DNA 分子結(jié)構(gòu)的不可逆損害，誘發(fā)機體衰老相關(guān)退行性疾病的產(chǎn)生，加速衰老進程[3]。

秀麗隱桿線蟲是研究機體衰老基本機制的絕佳模型，因其具有壽命短、細胞模式簡單、繁殖迅速、后代數(shù)多、行為反應(yīng)模式穩(wěn)定、結(jié)果靈敏可靠等特點，可表現(xiàn)出具有一系列類似于哺乳動物的衰老特征[4]。線蟲中高達60%～80%的基因與人類基因組具有同源性，為人類遺傳分析提供了有利條件。其中BZIP 結(jié)構(gòu)域蛋白1（protein skinhead-1，skn-1）與哺乳動物的核因子E2 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2）蛋白在功能上具有一致性，可在體內(nèi)發(fā)揮相似的抗氧化應(yīng)激作用[5]。

Kelch 樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）/Nrf2 通路是體內(nèi)氧化還原平衡的細胞防御機制和重要調(diào)控途徑[6]。Keap1 是Nrf2 的主要負調(diào)節(jié)因子，生理狀態(tài)下可介導(dǎo)Nrf2 的泛素化及降解。在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，Keap1通過氧化還原反應(yīng)被修飾，構(gòu)象發(fā)生變化，從而與Nrf2 解離。Nrf2 被激活進入細胞核內(nèi)，與肌肉腱膜纖維肉瘤（musculoaponeurotic fibrosarcoma，MAF）結(jié)合為異質(zhì)二聚體后，啟動抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response elements，ARE），增加細胞對于氧化應(yīng)激的抵抗力，并減少細胞凋亡以提高存活率，從而恢復(fù)內(nèi)穩(wěn)態(tài)。已有研究證明，Nrf2 活性水平與物種壽命之間存在正向相關(guān)，且會隨著年齡的增長而逐漸降低[7-8]。

為實現(xiàn)健康老齡化，衰老醫(yī)學(xué)將目標投向衰老相關(guān)疾病的早期干預(yù)和預(yù)防，其中干細胞移植、促進抗衰老因子表達、中醫(yī)治療、針灸、膳食補充劑等最新治療方法的研究，為衰老相關(guān)疾病的治療提供了新的方向[9]。中醫(yī)藥因其宏觀辯證，用藥精當(dāng)，不良反應(yīng)較少，逐漸得到國際認可，在抗衰老研究與治療中發(fā)揮越來越重要的作用。常用藥食兩用傳統(tǒng)中藥茯苓為多孔菌科真菌茯苓Poriacocos(Schw.) Wolf 的干燥菌核。茯苓性味甘、平、淡，歸心、肺、脾、腎經(jīng)，具有利水滲濕、和胃健脾、寧心安神的功效。茯苓自古為延年益壽佳品，在《神農(nóng)本草經(jīng)》中謂其“久服安魂養(yǎng)神，不饑延年?！爆F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，茯苓具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫功能、保肝健脾、鎮(zhèn)靜安神、利水消腫、抗炎抑菌、抗衰老、抗突變等多方面的藥理作用[10-11]。目前，從茯苓中已成功分離提取出茯苓多糖、三萜類、甾醇類、揮發(fā)油類、蛋白質(zhì)等成分，其中茯苓多糖作為茯苓的主要生物活性成分之一，具有抗氧化、抗衰老、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抑菌、保肝及抗癌等生物學(xué)功能[12-14]。茯苓作為當(dāng)歸芍藥散的主要成分之一，已被證明對衰老相關(guān)疾病阿爾茨海默癥具有較好的療效[12-13]。因此茯苓的主要成分茯苓多糖將在延緩衰老和預(yù)防衰老方面的表現(xiàn)出巨大的潛力。本研究基于科學(xué)理論支持和相關(guān)研究基礎(chǔ)，構(gòu)建線蟲模型，揭示茯苓多糖通過調(diào)控skn-1 信號通路延緩衰老的分子機制，進一步證明中藥在延緩衰老中的價值，并為藥食同源理念提供新依據(jù)。

1 材料

1.1 線蟲

所有線蟲品系和菌株均購自美國隱桿線蟲遺傳中心（Caenorhabditis Genetics Center，CGC），包括野生型N2、CB1370［daf-2（e1370）］、DA116［eat-2（ad1116）］、EU1［skn-1（zu67）］、LD1（ldIs7［skn-1b/c:GFP＋rol-6（su1006）］）和埃希氏大腸桿菌OP50（Escherichiacoli）。

1.2 藥品與試劑

靖州茯苓（批號2022081201）由靖州苗族侗族自治縣質(zhì)量計量檢驗檢測中心提供并經(jīng)甄達貴副高級工程師鑒定為多孔菌科真菌茯苓P.cocos(Schw.)Wolf 的干燥菌核；葡萄糖標準品（批號PHR1000）購自美國 Sigma-Aldrich 公司；百草枯（批號M106760）購自上海阿拉丁公司；鹽酸左旋咪唑（批號L8230）購自北京索萊寶科技有限公司；活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測試劑盒（批號S0033S）購自碧云天生物工程有限公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號0521751）購自蘇州近岸蛋白質(zhì)科技股份有限公司；快速抗體染料法定量 PCR 預(yù)混液（批號MQ10401S）購自莫納生物科技有限公司。

1.3 儀器

Medifuge?小型臺式離心機（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；Cytation3 多功能酶標儀（美國BioTek公司）；T100TM型qRT-PCR 儀（美國Bio-Rad 公司）；Axio Vert.A1 倒置熒光顯微鏡（德國Zeiss 公司）。

2 方法

2.1 茯苓多糖的提取和鑒定

參考李曉潔等[15]的研究方法，挑選色澤均勻、無霉斑的茯苓塊于50 ℃烘箱中烘干，經(jīng)粉碎機粉碎后過50 目篩得茯苓粉，封存，備用。取1 g 茯苓粉，按照不同料液比1∶50（g∶mL），加入0.6 mol/L的NaOH 溶液，在恒溫水浴鍋中進行浸提1.0 h，浸提后的溶液用0.5 mol/L 的HCl 中和，8 000 r/min 離心10 min，取沉淀。將沉淀放入透析袋中，在水中透析7 d，透析完畢后，離心出盡可能多的水，最后通過真空冷凍干燥得到茯苓多糖。使用葡萄糖標準品，采用酶標儀于490 nm 最大吸收波長處測定吸光度（A）值，繪制多糖濃度（x）與A值（y）的標準曲線。配制0.1 mg/mL 茯苓多糖溶液，測定茯苓多糖含量[16]。

2.2 線蟲與大腸桿菌OP50 培養(yǎng)條件

在所有實驗中，用堿性次氯酸鹽處理受精的雌雄同體[17]，使線蟲同步。將實驗線蟲保存在含有大腸桿菌OP50 的線蟲生長培養(yǎng)基（NGM）板上培養(yǎng)，溫度為20 ℃。

2.3 毒理實驗

將同期化L4 期野生型N2 線蟲轉(zhuǎn)移到含有不同質(zhì)量濃度（10、20、40、80、160、320、640、1 280 μg/mL）的茯苓多糖和空白含菌培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。培養(yǎng)48、72 h 后觀察線蟲存活情況。以鉑絲輕碰觸秀麗線蟲后10 s 無反應(yīng)判斷線蟲死亡。意外死亡、逃逸（爬壁干燥死亡）、囊袋蟲、內(nèi)部孵育[18]線蟲，剔除判斷。

2.4 壽命實驗

將L4 期N2 線蟲轉(zhuǎn)移到含（10、20、40 μg/mL）茯苓多糖組和空白組的含菌培養(yǎng)皿中，每組50 只。為了確保藥物在整個實驗過程中不失效，每天將線蟲轉(zhuǎn)至新的培養(yǎng)皿，并使用鉑金絲輕輕刺激，記錄存活線蟲數(shù)量，持續(xù)到最后1 條線蟲死亡[19]。

2.5 抗逆性實驗

為檢測對百草枯的抗性，將L4 期N2 線蟲分組同上，每組50 只，處理3 天后進行氧化應(yīng)激處理，則將其移至含有10 mmol/L 百草枯的培養(yǎng)皿，此時記為第0 天，每12 小時記錄線蟲存活數(shù)量及死亡數(shù)量，直至最后1 條線蟲死亡[20]。為評價對紫外和高溫的抗性，將L4 期N2 線蟲分組同“2.4”項，每組40 只。將各組線蟲分別轉(zhuǎn)移至未加OP50 的NGM培養(yǎng)皿中，紫外應(yīng)激處理是置于超凈臺中開蓋紫外燈光照射2 h，高溫應(yīng)激處理則將其置于35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中開蓋靜置2 h，然后將線蟲分別轉(zhuǎn)入對應(yīng)濃度的含菌培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)，每天記錄存活線蟲的數(shù)量，持續(xù)到最后1 條線蟲死亡[19]。

2.6 脂褐素分析

將L4 期N2 線蟲分別轉(zhuǎn)移到含（10、20 μg/mL）茯苓多糖各1 組，40 μg/mL 茯苓多糖和空白組各2組的含菌培養(yǎng)皿中，每組20 只，處理7 d 后將1 組空白組和1 組40 μg/mL 茯苓多糖組的線蟲挑到含10 mmol/L 百草枯的培養(yǎng)皿中，其余組不變，12 h后，將線蟲挑至含2%瓊脂糖凝膠的載玻片上，用10μL 濃度為10 mmol/L 的鹽酸左旋咪唑溶液麻醉后，壓片。在倒置熒光顯微鏡下進行觀察，Image-Pro Plus 軟件定量分析熒光強度[20]。

2.7 生理機能實驗

2.7.1 吞咽頻率測定 將L4 期N2 線蟲分組同“2.4”項，每組50 只，此時記為第0 天。分別在給藥培養(yǎng)后的第3、6、9、12 天，每組選取生長狀態(tài)良好且狀態(tài)相近的5 條線蟲移至無OP50 的NGM培養(yǎng)皿中，適應(yīng)1 min 后，觀察并記錄30 s 內(nèi)單條線蟲吞咽泵完成跳動的次數(shù)。線蟲攝取食物主要通過吞咽泵完成，當(dāng)其吞咽泵分別向上和向下各進行1 次跳動，即為完成1 次跳動[21]。

2.7.2 蟲體擺動頻率測定 每組選取生長狀態(tài)良好且狀態(tài)相近的5 條線蟲觀察并記錄蟲體擺動狀況，向載玻片上滴加M9 溶液10 μL，每次隨機挑取1 只線蟲置于M9 溶液中，使其在M9 溶液中適應(yīng)1 min，然后記錄線蟲蟲體30 s 內(nèi)擺動的次數(shù)，將其頭部和尾部擺動到同一側(cè)的線蟲運動被計為1 次擺動[22]。

2.7.3 生殖測定 將L4 期N2 線蟲分組同“2.4”項，每組5 條。每板1 條，為方便統(tǒng)計產(chǎn)卵數(shù)量，采用直徑35 mm 培養(yǎng)皿。每天同一時間將成蟲轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)基繼續(xù)產(chǎn)卵，連續(xù)轉(zhuǎn)4 d（產(chǎn)卵高峰期）。所有含有蟲卵的培養(yǎng)皿置于20 ℃培養(yǎng)箱中，待發(fā)育至幼蟲期即培養(yǎng)2 d 后計數(shù)各組子代的數(shù)目[21]。

2.8 突變體線蟲應(yīng)激與壽命實驗

選取同期化L4 期daf-2、eat-2、skn-1 3 種突變體線蟲和N2 野生型線蟲轉(zhuǎn)移到含有40 μg/mL 茯苓多糖的藥物組和空白組的含菌培養(yǎng)皿中，每組50 條，按照“2.5”項下方法進行抗氧化應(yīng)激實驗[22]。選取L4 期skn-1 突變體線蟲和L4 期N2 線蟲分組同上，每組50 條，按照“2.4”項下方法進行壽命實驗。

2.9 線蟲skn-1 綠色熒光蛋白的細胞定位檢測

選取L4 期skn-1b/c:GFP 線蟲轉(zhuǎn)入2 組含有40 μg/mL 茯苓多糖的藥物組和2 組空白組的含菌培養(yǎng)基中，每組50 條，處理7 d 后將1 組空白組和1 組40 μg/mL 茯苓多糖的藥物組轉(zhuǎn)至含10 mmol/L 百草枯的培養(yǎng)基培養(yǎng)，其余組不變，處理12 h 后，每組各取40 條線蟲將線蟲挑至含2%瓊脂糖凝膠的載玻片，用10 μL 濃度為10 mmol/L 的鹽酸左旋咪唑溶液麻醉后，壓片。在倒置熒光顯微鏡下進行觀察。計取skn-1 綠色熒光蛋白全部和部分進入腸道細胞核以及未進入腸道細胞核的線蟲的數(shù)目，并拍照保存。高表達表示在線蟲的從頭到尾大部分腸道細胞核中都能觀察到強烈的skn-1b/c:GFP 信號；中表達表示在線蟲的頭和尾部的腸道細胞核中能觀察到skn-1b/c:GFP 信號或者在所有腸核中都觀察到微弱的skn-1b/c:GFP 信號；低表達表示在線蟲的頭部至尾部幾乎檢測不到skn-1b/c:GFP 信號，用Image-Pro Plus 軟件處理圖像并進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析[23]。

2.10 qRT-PCR 實驗

將L4 期N2 線蟲分組及處理同“2.6”項，每組100 只，按照試劑盒說明書提取線蟲RNA，測定濃度后進行逆轉(zhuǎn)錄，采用SYBR Green 染料法在Realtime qPCR 儀上進行擴增，反應(yīng)程序為95 ℃、5 min，95 ℃、30 s，58 ℃、30 s，40 個循環(huán)。以GAPDH為參比基因，采用2-ΔΔCt法進行數(shù)據(jù)分析。抗氧化基因谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶4（glutathione S-transferase 4，gst-4）、gst-7、超氧化物歧化酶3（superoxide dismutase-3，sod-3）、熱休克蛋白16.2（heat shock protein Hsp-16.2，hsp16.2）引物序列（表1）參照Wang 等[23]的研究。同時選取L4 期skn-1 突變體線蟲分組及處理同“2.9”項，采用上述同樣處理后檢測各基因的表達水平。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

2.11 ROS 水平檢測

將L4 期N2 線蟲分組及處理同“2.6”項，每組30 只，用M9 緩沖液收集各組線蟲并清洗后，放入含有200 μL PBS 緩沖液的EP 管中，在冰上超聲破碎后，4 ℃、12 000 r/min 離心，取上清，移入黑色96 孔板中每個孔中（每組平行3 孔，每孔加入50μL 上清液），再加入50 μL 提前稀釋好的100 μmol/L H2DCF-DA 熒光探針，設(shè)置不加線蟲和DCFH-DA溶液的空白組，只加線蟲不加DCFH-DA 溶液的對照組，將加樣后的96 孔黑板室溫避光孵育30 min，酶標儀檢測熒光，每5 分鐘讀1 次數(shù)，讀60 min，激發(fā)光為485 nm，發(fā)射光為528 nm，測定熒光強度，從而確定ROS 水平[19]。同時選取L4 期skn-1突變體線蟲分組及處理同“2.9”項，采用上述同樣處理后檢測ROS 水平。

2.12 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗結(jié)果采用Prism GraphPad 8統(tǒng)計軟件分析，生存曲線實驗結(jié)果采用Log-Rank 檢驗進行分析，其余實驗采用方差分析進行兩組間比較。

3 結(jié)果

3.1 茯苓多糖提取物多糖含量和毒性檢測

葡萄糖標準曲線線性方程為y＝3.608 6x＋0.086 8（R2＝0.991 9），葡萄糖質(zhì)量濃度為0.02～0.10 mg/mL，A值與其呈良好線性關(guān)系，提取物中總多糖質(zhì)量分數(shù)為276.746 mg/g。茯苓多糖對秀麗隱桿線蟲的毒理實驗結(jié)果表明，質(zhì)量濃度在1.28 mg/mL 以下的茯苓多糖對秀麗隱桿線蟲均無毒性作用，40 μg/mL 以上的質(zhì)量濃度茯苓多糖對秀麗隱桿線蟲壽命影響無顯著差異，故選取10、20、40 μg/mL 的茯苓多糖開展后續(xù)實驗（表2）。

表2 茯苓多糖對秀麗隱桿線蟲的毒性作用Table 2 Toxic effect of Poria cocos polysaccharides on C.elegans

3.2 茯苓多糖延長秀麗隱桿線蟲的壽命并提高抗衰老能力

壽命的長短是衡量線蟲衰老最重要的指標。茯苓多糖對線蟲壽命的影響見圖1-A，在正常的實驗條件下，N2 線蟲的平均壽命為（11.420±0.635）d，在給予10、20、40 μg/mL 茯苓多糖后，平均壽命分別增加到（12.130±0.469）、（13.261±0.475）、（14.247±0.719）d。與N2 組比較，10、20、40 μg/mL茯苓多糖組的壽命分別增加 6.21%、16.12%、24.75%，壽命以茯苓多糖劑量相關(guān)性的方式增加，說明茯苓多糖具有延長成年線蟲壽命的效應(yīng)。蠕蟲的壽命與其在各種應(yīng)激源下的存活率呈正相關(guān)[24]。在紫外應(yīng)激條件下線蟲壽命如圖1-B 所示，與N2組比較，20、40 μg/mL 茯苓多糖延長了線蟲生存時間。在35 ℃熱休克條件下線蟲壽命如圖1-C 所示，N2 組平均生存時間為（4.570±0.528）d，而40 μg/mL茯苓多糖延長線蟲生存時間到（5.416±0.532）d，綜上，提示茯苓多糖能增加對紫外照射的耐受性和提高線蟲的耐熱性。

圖1 茯苓多糖延長秀麗隱桿線蟲的壽命并提高抗衰老能力 (±s, n = 50)Fig. 1 P. cocos polysaccharides extends lifespan of C. elegans and enhances anti-aging abilities (±s, n = 50)

線蟲的進食是通過頭部后端的吞咽泵跳動完成的，咽泵速在整個發(fā)育幼蟲期逐漸增加，在L4 期達到峰值，然后在衰老期間逐漸降低[22]。茯苓多糖能夠顯著提高野生型N2 成蟲給藥后第3、6、9、12 天的吞咽次數(shù)（P＜0.05、0.01、0.001，圖1-D）。觀察M9 液體中線蟲在一定時間內(nèi)的彎曲次數(shù)，可評價線蟲衰老進程[22]。茯苓多糖給藥培養(yǎng)后的第3、6、9、12 天線蟲彎曲次數(shù)均高于N2 組（P＜0.05、0.01、0.001，圖1-E）。線蟲的產(chǎn)卵數(shù)量是反映線蟲生理能力強弱的一個重要指標[20]。各質(zhì)量濃度的茯苓多糖均對線蟲的產(chǎn)卵數(shù)量無顯著影響（圖1-F），說明藥物質(zhì)量濃度并不影響線蟲正常繁殖。綜上，提示茯苓多糖能夠延緩野生型N2 線蟲的衰老進程，增強抗衰老能力，其中40 μg/mL 茯苓多糖干預(yù)后效果最顯著。

3.3 茯苓多糖降低秀麗隱桿線蟲脂褐素和ROS 的含量，促進抗氧化基因表達

隨著機體的老化，細胞的新陳代謝被破壞，產(chǎn)生大量自由基，可能與不飽和脂肪酸發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致脂褐素的產(chǎn)生[25]。如圖2-A、B 所示，與N2 組比較，20、40 μg/mL 茯苓多糖組線蟲體內(nèi)的脂褐素?zé)晒鈴姸蕊@著降低（P＜0.001），提示茯苓多糖能減輕衰老過程中的脂褐素生成。在正常衰老過程中會不斷產(chǎn)生ROS，ROS 具有很強的氧化能力，因此ROS被認為是引起衰老的主要原因[26]。本實驗采用H2DCF-DA 熒光探針法檢測茯苓多糖對線蟲內(nèi)源性ROS 水平的影響。如圖2-D 所示，與N2 組比較，40 μg/mL 茯苓多糖處理后N2 線蟲內(nèi)源性ROS水平顯著降低（P＜0.01），而較低的ROS 水平可能與提高抗氧化應(yīng)激能力和延長壽命相關(guān)。在生理條件下，采用qRT-PCR 檢測N2 線蟲中抗氧化基因gst-4、gst-7、sod-3和hsp-16.2的mRNA 表達。如圖2-C 所示，與N2 組比較，40 μg/mL 茯苓多糖干預(yù)后gst-4、gst-7表達水平顯著升高（P＜0.01）。gst-4的轉(zhuǎn)錄激活通常被用來考察skn-1 活性[27]。

圖2 茯苓多糖降低秀麗隱桿線蟲脂褐素和ROS 的含量，促進抗氧化基因表達 (±s, n = 50)Fig. 2 P. cocos polysaccharides reduces lipofuscin and ROS levels, promotes expression of antioxidant genes in C. elegans(±s, n = 50)

3.4 茯苓多糖誘導(dǎo)秀麗隱桿線蟲抗氧化應(yīng)激，減少損傷

利用百草枯建立氧化損傷模型，該模型會誘導(dǎo)線蟲產(chǎn)生大量的ROS，ROS 是一種高活性氧分子，可誘導(dǎo)遺傳毒性和生理損傷，破壞抗逆性的先天機制，可能導(dǎo)致DNA 損傷、基因表達改變、細胞信號紊亂、脂質(zhì)過氧化和蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)失衡，最終導(dǎo)致細胞衰老和死亡[28]。如圖3-A 所示，與模型組比較，20、40 μg/mL 茯苓多糖在氧化應(yīng)激條件下能延長線蟲壽命，提高其抗氧化應(yīng)激能力。在氧化應(yīng)激條件下測定脂褐素，與模型組比較，40 μg/mL 茯苓多糖在氧化應(yīng)激條件下能顯著降低線蟲體內(nèi)脂褐素?zé)晒鈴姸龋≒＜0.001，圖3-B、C）。同時在氧化應(yīng)激條件下，與模型組比較，40 μg/mL 茯苓多糖組線蟲體內(nèi)抗氧化相關(guān)基因gst-4、gst-7表達水平均顯著升高（P＜0.01、0.001，圖3-D）。ROS 的生成與氧化損傷密切相關(guān)，如圖3-E 所示，與模型組比較，在氧化應(yīng)激條件下40 μg/mL 茯苓多糖處理的N2 線蟲體內(nèi)ROS 水平顯著降低（P＜0.01）。綜上提示，茯苓多糖能延長線蟲在氧化應(yīng)激狀態(tài)下的壽命，具有抗氧化活性，茯苓多糖能減少線蟲氧化應(yīng)激狀態(tài)下ROS的產(chǎn)生，調(diào)控抗氧化基因抑制內(nèi)源性ROS 產(chǎn)生可能與茯苓多糖的抗氧化活性相關(guān)。

圖3 茯苓多糖誘導(dǎo)秀麗隱桿線蟲抗氧化應(yīng)激并減少損傷 (±s, n = 40)Fig. 3 P. cocos polysaccharides induces antioxidant stress in C. elegans and reduce damage (±s, n = 40)

3.5 茯苓多糖誘導(dǎo)秀麗隱桿線蟲體內(nèi)的氧化應(yīng)激抗性需要skn-1

利用與衰老相關(guān)的胰島素信號通路daf-2 突變體線蟲、飲食限制信號通路eat-2 和skn-1 轉(zhuǎn)錄因子skn-1 突變體線蟲，探究茯苓多糖在體內(nèi)的抗氧化作用途徑[23]。如圖4 所示，40 μg/mL 茯苓多糖可以延長氧化應(yīng)激下胰島素樣受體β 亞基（insulin-like receptor subunit beta，daf-2）和神經(jīng)元乙酰膽堿受體亞基eat-2（neuronal acetylcholine receptor subunit eat-2，eat-2）突變體線蟲的壽命，但不能延長skn-1 突變體線蟲的壽命。而在生理情況下40 μg/mL 茯苓多糖能延長N2 線蟲壽命，但不能延長skn-1 突變體線蟲的壽命，提示茯苓多糖延長線蟲壽命與調(diào)控skn-1 信號通路抗氧化有關(guān)，而非daf-2 和eat-2 途徑介導(dǎo)。

圖4 茯苓多糖誘導(dǎo)秀麗隱桿線蟲體內(nèi)的氧化應(yīng)激抗性需要skn-1 (±s, n = 40)Fig. 4 P. cocos polysaccharides require skn-1 for induction of oxidative stress resistance in C. elegans (±s, n = 40)

3.6 茯苓多糖通過skn-1 信號通路誘導(dǎo)氧化應(yīng)激抵抗

skn-1 是哺乳動物抗氧化酶調(diào)節(jié)基因Nrf2 在秀麗隱桿線蟲的同源基因，可促進線蟲氧化應(yīng)激抵抗力，幫助延長長壽[29]。為進一步檢測skn-1 活性，檢測了skn-1b/c:GFP 線蟲中skn-1 的核定位情況，結(jié)果顯示40 μg/mL 茯苓多糖明顯促進了skn-1 的入核（P＜0.05，圖5-A、B）；在氧化應(yīng)激條件下，40 μg/mL 茯苓多糖也能促進skn-1 的入核（P＜0.05，圖5-C），提示skn-1 的入核激活下游轉(zhuǎn)錄發(fā)揮抗氧化作用。skn-1/Nrf2 信號通路在秀麗隱桿線蟲衰老過程中起著至關(guān)重要的作用[30]。為了確定茯苓多糖是否通過這一機制發(fā)揮作用，分析了skn-1 突變體線蟲中g(shù)st-4、gst-7、sod-3和hsp16.2的mRNA 表達。結(jié)果顯示，在skn-1 突變體線蟲中，40 μg/mL茯苓多糖干預(yù)后skn-1 轉(zhuǎn)錄因子下游的抗氧化基因gst-4、gst-7、sod-3和hsp16.2的表達水平均無明顯差異（圖5-D），而在氧化應(yīng)激條件下茯苓多糖對skn-1 轉(zhuǎn)錄因子下游的抗氧化基因gst-4、gst-7、sod-3和hsp16.2的表達也均無明顯影響（圖5-E），說明茯苓多糖的抗氧化活性可能與調(diào)控skn-1 轉(zhuǎn)錄因子及其下游的抗氧化基因gst-4、gst-7有關(guān)。進一步提示茯苓多糖可能通過skn-1 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控下游抗氧化基因gst-4和gst-7來延長N2 線蟲壽命。為研究ROS 的減少是否與skn-1/Nrf2 信號通路有關(guān)，使用skn-1 突變體線蟲進行研究，發(fā)現(xiàn)40 μg/mL 茯苓多糖處理后內(nèi)源性ROS 水平?jīng)]有顯著性（圖5-F），說明茯苓多糖降低線蟲內(nèi)源性ROS 水平可能是由skn-1 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的。而在氧化應(yīng)激條件下，40 μg/mL 茯苓多糖處理SKN-1 突變體線蟲后內(nèi)源性ROS 水平也沒有顯著性（圖5-G），提示線蟲降低ROS 的產(chǎn)生可能是由skn-1 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的。綜上，茯苓多糖能延長線蟲壽命，其機制可能是通過調(diào)控skn-1 轉(zhuǎn)錄因子提高抗氧化能力從而減少內(nèi)源性ROS 的產(chǎn)生。

圖5 茯苓多糖通過skn-1 信號通路誘導(dǎo)氧化應(yīng)激抵抗 (±s, n = 50)Fig. 5 P. cocos polysaccharides induce oxidative stress resistance via skn-1 signaling pathway (±s, n = 50)

4 討論

中藥多糖發(fā)揮抗氧化作用主要體現(xiàn)在清除自由基和調(diào)控抗氧化酶或氧化酶活性2 方面?，F(xiàn)代研究表明，茯苓多糖是高效的抗氧化劑，可通過破壞反應(yīng)鏈，清除羥自由基、過氧化氫、超氧陰離子、一氧化氮等易誘導(dǎo)細胞氧化損傷的自由基，緩解機體氧化應(yīng)激反應(yīng)，同時茯苓多糖可有效提高超氧化物歧化酶、谷胱甘肽還原酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶等抗氧化酶的活性，增加谷胱甘肽水平，限制脂質(zhì)過氧化和超氧陰離子的產(chǎn)生，降低氧化損傷，茯苓多糖為茯苓發(fā)揮抗氧化的主要藥效基礎(chǔ)，具有保護生物膜和延緩衰老的作用[31-32]。本研究發(fā)現(xiàn)，從茯苓中提取的茯苓多糖在秀麗隱桿線蟲中具有顯著的抗衰老活性。茯苓多糖處理后N2 線蟲的脂褐素、吞咽次數(shù)、蟲體擺動次數(shù)和對紫外輻射以及熱應(yīng)激抵抗能力等衰老指標顯著提高，壽命顯著延長，體現(xiàn)出顯著的抗衰老作用。

在衰老的支持細胞中存在著多種改變，如ROS水平升高、炎癥狀態(tài)、DNA 受損、自噬受損、線粒體功能障礙等[33]。其中，氧化應(yīng)激和炎癥是中心環(huán)節(jié)。在本研究中，茯苓多糖處理線蟲后在氧化應(yīng)激條件下的存活時間顯著延長，脂褐素表達明顯下降，線蟲體內(nèi)ROS 水平顯著降低，說明茯苓多糖可能通過降低ROS 水平來調(diào)控秀麗隱桿線蟲抗衰老。

據(jù)報道，細胞對氧化應(yīng)激的防御反應(yīng)受到許多轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)，包括skn-1 和daf-16[34-35]。茯苓多糖可以延長氧化應(yīng)激條件下daf-2、eat-2 2 種突變體線蟲的壽命，僅skn-1 突變體線蟲壽命未得到改善。結(jié)果表明，胰島素信號傳導(dǎo)（daf-2）、熱量限制（eat-2）與茯苓多糖的抗氧化活性無關(guān)。由外源性氧化劑或環(huán)境條件引起的ROS 生成和清除失衡被稱為氧化應(yīng)激，以秀麗隱桿線蟲死亡為特征。鑒于秀麗隱桿線蟲壽命的延長通常伴隨著抗應(yīng)激能力的增強，本研究進行了抗氧化應(yīng)激和解毒基因的qRT-PCR檢測。sod-3 刺激線粒體呼吸體中的蛋白質(zhì)異構(gòu)化、活性和超氧自由基的清除[36]，gst-4 是一種谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶，可促進II 期解毒過程[37]。其表達受daf-16 和skn-1 調(diào)控[38]，gst-7 增加谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活性，參與谷胱甘肽的制造和代謝，減少ROS 水平，通過解毒氧化應(yīng)激副產(chǎn)物對抗氧化應(yīng)激[39]，hsp16.2是由hsf-1 控制的熱休克蛋白，hsf-1 轉(zhuǎn)錄因子通過控制伴侶型熱休克蛋白的表達和在熱應(yīng)激下保持蛋白穩(wěn)態(tài)來保護機體免受熱休克，hsp16.2 的增加降低了谷胱甘肽水平，增強了未折疊蛋白結(jié)合活性，提高了抗熱應(yīng)激能力[40]。在秀麗隱桿線蟲中這些抗氧化基因與skn-1/Nrf2 途徑調(diào)控有關(guān)。已有研究表明，鐵皮石斛水提物通過激活skn-1 轉(zhuǎn)錄因子延長秀麗隱桿線蟲壽命作用及機制研究[41]。本研究結(jié)果表明，茯苓多糖能誘導(dǎo)生理和氧化應(yīng)激條件下skn-1從細胞質(zhì)到細胞核的易位，并激活下游抗氧化基因gst-4 和gst-7 的表達，這可能與延長壽命有關(guān)。但茯苓多糖不能促進生理和氧化應(yīng)激情況下skn-1 突變體線蟲下游gst-4 和gst-7 表達，也不能降低ROS的水平，進一步證明茯苓多糖抗衰老的機制與調(diào)控skn-1/Nrf2 經(jīng)典抗氧化途徑有關(guān)。

綜上，茯苓多糖具有延長秀麗隱桿線蟲壽命，增強抗衰老的能力。機制研究表明，茯苓多糖可以促使skn-1 入核，上調(diào)相關(guān)抗氧化基因的表達，降低線蟲體內(nèi)活性氧自由基水平進而增強其抗氧化應(yīng)激能力，延緩衰老速度，提示其很可能是一種有前景的天然抗衰老成分，值得進一步研究。然而，在模式生物秀麗線蟲模型下的研究結(jié)果仍然是局限的，需要在哺乳動物和臨床試驗中進一步證實茯苓多糖的抗衰老效應(yīng)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突