防風(fēng)中1 個(gè)新多糖的結(jié)構(gòu)及免疫調(diào)節(jié)活性研究

何新陽(yáng)，范海濤, ，孫 萌，李 潔，夏 青，姜艷艷, ，劉 斌,

1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488

2. 北京電子科技職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院，北京 100176

3. 齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）生物研究所，山東 濟(jì)南 250103

4. 國(guó)家中醫(yī)藥管理局“中藥經(jīng)典名方有效物質(zhì)發(fā)現(xiàn)”重點(diǎn)研究室，北京 102488

防風(fēng)SaposhnikoviaeRadix為傘形科植物防風(fēng)Saposhnikoviadivaricata(Turcz.) Schischk.的干燥根，其性味辛、甘、微溫，具有祛風(fēng)解表、勝濕止痛的功效[1]，可治療風(fēng)濕痹痛、風(fēng)疹瘙癢、破傷風(fēng)等疾病，是臨床常用中藥，也是多個(gè)常用中成藥的主要組成藥味，如玉屏風(fēng)顆粒、防風(fēng)通圣顆粒、童康顆粒。防風(fēng)中含有多糖、色原酮、香豆素、揮發(fā)油等化學(xué)成分，常用于治療免疫相關(guān)疾病，如過(guò)敏性鼻炎、慢性支氣管炎、過(guò)敏性哮喘、腎病等[2-6]。其中，多糖是防風(fēng)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的主要有效成分?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，防風(fēng)總多糖可有效改善過(guò)敏性鼻炎大鼠行為學(xué)及鼻黏膜病理形態(tài)，顯著促進(jìn)水通道蛋白5（aquaporin 5，AQP5）表達(dá)[7]，防風(fēng)總多糖經(jīng)硫酸酯化可直接調(diào)控腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[8]；從防風(fēng)總多糖中分離得到的均一多糖SDNP-2 對(duì)巨噬細(xì)胞的免疫抑制有明顯的拮抗作用[9]，防風(fēng)均一多糖SDPs 能清除ABTS 自由基，對(duì)H2O2氧化損傷的RAW264.7 細(xì)胞具有保護(hù)作用[10]。

課題組前期對(duì)防風(fēng)多糖的免疫調(diào)節(jié)活性開展了系統(tǒng)研究。斑馬魚實(shí)驗(yàn)顯示，防風(fēng)總多糖能使斑馬魚的免疫細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)目顯著增加，有抗炎、抗感染的作用[11]；小鼠碳粒廓清實(shí)驗(yàn)表明，防風(fēng)總多糖能顯著提高小鼠免疫器官的臟器指數(shù)和免疫球蛋白含量，增強(qiáng)機(jī)體非特異性免疫；從防風(fēng)總多糖中分離得到的均一多糖SP800201 能顯著提高細(xì)胞的增殖和吞噬能力，對(duì)免疫抑制的斑馬魚模型、RAW264.7 巨噬細(xì)胞模型均有免疫調(diào)節(jié)作用[12]。

為進(jìn)一步闡明防風(fēng)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，探明其作用機(jī)制，在前期研究基礎(chǔ)上，對(duì)防風(fēng)多糖進(jìn)行系統(tǒng)分離、純化，得到新的均一多糖SP800203；采用全水解衍生化、部分酶水解、甲基化以及MS、IR、NMR 譜學(xué)等多種方法和技術(shù)，對(duì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析；運(yùn)用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、斑馬魚實(shí)驗(yàn)，研究其免疫調(diào)節(jié)活性。本研究為防風(fēng)的科學(xué)應(yīng)用和進(jìn)一步開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Bruker AVANCE-III HD700 MHz 型核磁共振儀（德國(guó)Bruker 公司）；Agilent 1200 型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司OPENLAB 工作站）；UV8000型紫外分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）；傅里葉變換紅外光譜儀（美國(guó)PerkinElmer 公司）；TD5A-WS 型高速離心機(jī)（金南儀器制造有限公司）；氮?dú)獯蹈蓛x（上海極恒實(shí)業(yè)有限公司）；ZRQ30型冷凍干燥機(jī)（天津因賽科技發(fā)展有限公司）；生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；AR224CN電子天平（美國(guó)Ohaus 公司）；TSK?G5000PWXL凝膠色譜柱（300 mm×7.8 mm）和 TSK?G3000PWXL 凝膠色譜柱（300 mm×7.8 mm），日本TSK 公司；HP-5 MS 色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm，美國(guó)Agilent 公司）；Forma 3111 型水套式CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Forma 公司）；SZX16IE204E 型體視熒光顯微鏡（美國(guó)Olympus 公司）；SPX-280B-G型博訊光照培養(yǎng)箱（上?；巧锟萍加邢薰荆籇S-200 高速組織搗碎機(jī)（江蘇江陰科研器械廠）；細(xì)胞超聲破碎儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；NanoDrop 2000 紫外分光光度計(jì)（美國(guó)ThermoFisher 公司）；C1000 Touch 梯度PCR 儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）；Light Cycler 96 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（瑞士Roche 公司）；Spectra-Max-190 型酶標(biāo)儀（美國(guó)分子儀器公司）；BT-25S 型電子分析天平（北京 Sartorius 公司）；微量移液器（德國(guó)Eppendorf 公司）；Sigma3-16P 離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司）；超低溫冰箱MOF-U3386S（日本SANYO 公司）；高壓蒸汽滅菌鍋AUTOCLAVE（日本SANYO公司）；倒置顯微鏡TE 2000-S（日本Nikon 公司）。

1.2 試劑與藥品

系列Dextran 標(biāo)準(zhǔn)品（GPC 分析標(biāo)準(zhǔn)，相對(duì)分子質(zhì)量為1.2×104、2.5×104、5.0×104、8.0×104、2.7×105、4.1×105，美國(guó)Sigma aldrich 公司）；單糖標(biāo)準(zhǔn)品D-甘露糖、L-鼠李糖、D-半乳糖、D-葡萄糖醛酸（上海金穗生物科技有限公司）、L-阿拉伯糖（天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）、D-半乳糖醛酸（北京金泰宏達(dá)生物科技有限公司）、D-葡萄糖（天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司）；長(zhǎng)春瑞濱（NVB，批號(hào)A19GB145811，HPLC 質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，上海源葉生物科技有限公司）；鹽酸左旋咪唑（LH，批號(hào)C10715718，上海麥克林生化科技有限公司）；中性紅（NR，批號(hào)BCBC9975，美國(guó)Fluka 公司）；蘇丹黑B（SBB，批號(hào)MKBV5357V，美國(guó)Sigma公司）；NO 檢測(cè)試劑盒（批號(hào)S0021S，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α ， TNF-α ）、 白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6 試劑盒（批號(hào)RK00027、RK00006、RK00008，美國(guó) ABclonal 公司）；RAW264.7 巨噬細(xì)胞（國(guó)家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享平臺(tái)）；DMEM 高糖培養(yǎng)基（美國(guó)Hyclone 公司）；胎牛血清（澳洲AusGeneX 公司）；CCK-8 試劑盒（美國(guó)Genview 公司）；中性紅（德國(guó)Sigma 公司）；色譜純甲醇和乙腈（美國(guó)Fisher 公司），其余試劑均為分析純。

防風(fēng)飲片購(gòu)自河北華草晟中藥材公司，批號(hào)2018050601，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)張媛教授鑒定為傘形科防風(fēng)屬植物防風(fēng)S.divaricata(Turcz.) Schischk.的干燥根，藥材標(biāo)本（SD201801）存放于北京電子科技職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院211 實(shí)驗(yàn)室。

1.3 動(dòng)物

免疫細(xì)胞熒光標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因Tg（lyz：DsRed）系斑馬魚和野生型AB 系斑馬魚，由山東省科學(xué)院生物研究所藥物篩選重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，按照明暗14 h/10 h，（28.0±0.5）℃飼養(yǎng)，每天定時(shí)定量喂食，選用健康斑馬魚雌雄比例2∶2 于產(chǎn)卵缸中配對(duì)產(chǎn)卵，收取受精卵用于實(shí)驗(yàn)。BALB/c 雄性小鼠，3～5周齡，體質(zhì)量（20±2）g，購(gòu)于斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)SCXK（京）2019-0010，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物房，動(dòng)物倫理審查編號(hào)為BUCM-4-2020110606-4179，12 h 晝夜循環(huán)，室溫恒定在22～24 ℃，相對(duì)濕度為55%～65%。

2 方法與結(jié)果

2.1 防風(fēng)多糖的提取、分離、純化

將干燥的防風(fēng)藥材（3 kg）切成小段，10 倍量水（30 L）煎煮2 次，每次1.5 h，濾過(guò)，合并濾液。以Sevag 試劑脫蛋白，經(jīng)紫外可見分光光度計(jì)掃描后在280 nm 處無(wú)明顯吸收峰。濾液加95%乙醇水混合至乙醇濃度為60%，靜置，濾過(guò)。上清液加95%乙醇水混合至乙醇濃度為80%，靜置，濾過(guò)。取沉淀，以乙醇（400 mL）、丙酮（400 mL）、乙醚（400 mL）洗滌3 次，即得粗多糖SP80。經(jīng)DEAE-纖維素陰離子交換色譜柱，以水、線性梯度氯化鈉溶液（0～2 mol/L）洗脫，洗脫曲線見圖1，在0.2 mol/L氯化鈉溶液濃度下洗脫得到SP8002。經(jīng)Sephadex G-75 柱純化，以0.01%氯化鈉溶液洗脫，即得防風(fēng)多糖SP800203。

2.2 防風(fēng)多糖SP800203 的結(jié)構(gòu)表征

2.2.1 相對(duì)分子質(zhì)量分布及糖醛酸含量 采用高效分子排阻色譜法（high performance size exclusion chromatography，HPSEC）考察均一性。以系列Dextran 為標(biāo)準(zhǔn)品，加NaCl 溶液，以0.45 μm 濾膜濾過(guò)，即得標(biāo)準(zhǔn)品溶液，供試品溶液同上述方法制備。經(jīng)TSK?凝膠色譜柱，分別以0.01% NaCl 溶液、0.02 mol/L 磷酸鹽緩沖溶液、0.025 mol/L 硼酸緩沖溶液洗脫，HPLC 檢測(cè)，通過(guò)GPC 軟件對(duì)多糖的相對(duì)分子質(zhì)量分布進(jìn)行擬合[13-14]（圖2），結(jié)果表明防風(fēng)多糖SP800203 相對(duì)分子質(zhì)量約為7.14×104，均一性良好。采用間羥基聯(lián)苯法對(duì)防風(fēng)多糖SP800203的糖醛酸含量進(jìn)行分析，以GalA 為標(biāo)準(zhǔn)品，以吸光度（A）為縱坐標(biāo)（Y），GalA 含量為橫坐標(biāo)（X），制備標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3），將多糖A值代入回歸方程，即得防風(fēng)多糖SP800203 的糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75.73%。

圖2 SP800203 的HPLC-SEC 標(biāo)準(zhǔn)曲線和相對(duì)分子質(zhì)量分布圖Fig. 2 HPLC-SEC standard curve and molecular weight distribution of SP800203

圖3 SP800203 的糖醛酸分析標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 3 Standard curve for uronic acid analysis of SP800203

圖4 單糖標(biāo)準(zhǔn)品 (A) 和SP800203 (B) PMP 衍生化產(chǎn)物的HPLC 圖譜Fig. 4 HPLC spectrum of PMP derivatization products of monosaccharide standards (A) and SP800203 (B)

2.2.2 單糖組成 采用HPLC 法分析PMP 全水解衍生化后的樣品[15-17]。取L-阿拉伯糖標(biāo)準(zhǔn)品1.0 mg，以水300 μL 溶解，加0.3 mol/L NaOH 溶液、0.3 mol/L PMP 甲醇溶液各400 μL，置烘箱70 ℃保持1 h。冷卻，加0.3 mol/L HCl 溶液400 μL，以三氯甲烷600 μL 萃取3 次。取水液，以0.45 μm 濾膜濾過(guò)，即得單糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液。同法制成半乳糖、葡萄糖等其他單糖的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。取防風(fēng)多糖SP800203 2 mg，加2 mol/L TFA 溶液2 mL，置烘箱115 ℃水解6 h，減壓回收溶劑至殘?jiān)鼰o(wú)明顯酸味，以水300μL 溶解，同標(biāo)準(zhǔn)品制備方法制備供試品溶液。經(jīng)C18色譜柱分離，以乙腈-4.5% NaAc 溶液（78∶22）洗脫，檢測(cè)并對(duì)比供試品與標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖（圖4）即得防風(fēng)多糖SP800203 的單糖組分為鼠李糖（Rha）、半乳糖（Gal）、阿拉伯糖（Ara）和半乳糖醛酸（GalA），物質(zhì)的量比為2.8∶6.7∶6∶84.5。

2.2.3 寡糖片段 采用部分酶水解的方法水解防風(fēng)多糖SP800203，采用ESI-MSn技術(shù)對(duì)水解產(chǎn)物進(jìn)行分析。取防風(fēng)多糖SP800203 1 mg，加50 μg/mL 果膠酶溶液1 mL，40 ℃水浴處理30 min。取酶解液0.3 mL，加甲醇0.9 mL，離心。取上清液，以0.45μm濾膜濾過(guò)，即得供試品溶液。經(jīng)ESI-MSn檢測(cè)，通過(guò)解析母離子的二級(jí)質(zhì)譜，結(jié)合裂解規(guī)律并參考相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[18-20]，推斷多糖酶水解產(chǎn)物中的寡糖片段，見表1。m/z325.0（C12H21O10，[Gal－Rha－H]-）的二級(jí)質(zhì)譜出現(xiàn)m/z163.0（C6H11O5，[Rha－H]-）峰，表明多糖中含有寡糖片段Gal-Rha；m/z339.1（C12H19O11，[GalA－Rha－H]-）的二級(jí)質(zhì)譜出現(xiàn)m/z163.2（C6H11O5，[Rha－H]-）峰，表明多糖中含有寡糖片段GalA-Rha；m/z341.0（C12H21O11，[Gal－Gal－H]-）的二級(jí)質(zhì)譜出現(xiàn)m/z178.7（C6H11O6，[Gal－H]-）峰，表明多糖中含有寡糖片段Gal-Gal；m/z354.8（C12H19O12，[GalA－Gal－H]-）的二級(jí)質(zhì)譜出現(xiàn)m/z179.1（C6H11O6，[Gal－H]-）峰，表明多糖中含有寡糖片段GalA-Gal；m/z369.1（C12H17O13，[GalA－GalA－H]-）的二級(jí)質(zhì)譜出現(xiàn)m/z192.7（C6H9O7，[GalA－H]-）峰，表明多糖中含有寡糖片段 GalA－GalA；m/z383.1（C13H19O13，[GalAOMe－GalA－H]-）的二級(jí)質(zhì)譜出現(xiàn)m/z193.0（C6H9O7，[GalA－H]-）峰，表明多糖中含有寡糖片段GalAOMe－GalA；m/z559.1（C19H27O19，[GalAOMe－GalA－GalA－H]-）的二級(jí)質(zhì)譜出現(xiàn)m/z383.2（C13H18O13，[GalAOMe－GalAH]-）峰和m/z193.0（C6H9O7，[GalA－H]-）峰，表明多糖中含有寡糖片段GalAOMe－GalA－GalA。

表1 部分酶水解產(chǎn)物中寡糖片段的ESI-MS/MS 峰值以及對(duì)應(yīng)的寡糖片段Table 1 Peak lists in ESI-MS/MS spectra of oligosaccharides by partial enzymatic hydrolysis and their deduced fragments

2.2.4 糖殘基類型 采用改良Hakomori 法[21-22]對(duì)防風(fēng)多糖SP800203 進(jìn)行甲基化分析，采用GC-MS法測(cè)定經(jīng)水解、乙?；蟮募谆a(chǎn)物，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[9,23-24]及CCRC（Complex Carbohydrate ResearchCenter，CCRC）數(shù)據(jù)庫(kù)，推斷多糖中的糖殘基類型。取防風(fēng)多糖SP800203 5.0 mg，加D2O 5 mL、碳化亞胺200 mg，以0.01 mol/L DCl 溶液調(diào)pH 至4.7，室溫靜置2 h。加2 mol/L NaBD4溶液0.5 mL，室溫靜置1 h。透析24 h，內(nèi)液冷凍干燥，備用。重復(fù)操作3 次，即得還原多糖。取還原多糖，充氮?dú)夂竺苋?，加甲基亞磺酰甲基鈉溶液1 mL，超聲波冰浴處理30 min，取出，室溫避光靜置12 h。置冰水浴，充氮?dú)?，加CD3I 1 mL，超聲波冰浴處理1 h。淬滅反應(yīng)，減壓回收溶劑，干燥。殘?jiān)铀? mL，以三氯甲烷1 mL 萃取3 次，合并三氯甲烷液，減壓回收溶劑，干燥，備用。重復(fù)操作3 次，即得多糖甲基化產(chǎn)物。取多糖甲基化產(chǎn)物以2 mol/L 三氟乙酸（TFA）溶液2 mL 溶解，110 ℃水解2 h，減壓回收溶劑至殘?jiān)鼰o(wú)明顯酸味。加4% NaBH4溶液1.5 mL，置恒溫箱30 ℃保持4 h。加醋酸至無(wú)氣泡，減壓回收溶劑至殘?jiān)鼰o(wú)明顯酸味，置真空干燥箱55 ℃保持 4 h。加無(wú)水吡啶、乙酸酐各1 mL，置恒溫箱70 ℃保持4 h。室溫靜置12 h，減壓回收溶劑，干燥，殘?jiān)蛹状? mL 溶解，重復(fù)操作3 次，置真空干燥箱55 ℃保持4 h。室溫靜置12 h，加三氯甲烷1.2 mL，以0.45 μm 濾膜濾過(guò)，即得供試品溶液。經(jīng)HP-5 色譜柱，以GC-MS 分析（圖5），程序升溫，起始溫度100 ℃，保持5 min，以5 ℃/min 速度升高至270 ℃；進(jìn)樣量1 μL，EI 電離源，源電壓70 eV，二級(jí)質(zhì)譜碰撞能12 eV；即得糖殘基類型（表2）。

表2 SP800203 的糖殘基類型分析結(jié)果Table 2 Analysis of sugar residue types for SP800203

圖5 SP800203 經(jīng)甲基化分析的GC-MS 圖Fig. 5 GC-MS spectrum of SP800203 analyzed by methylation

2.2.5 糖苷鍵連接方式 采用IR、NMR 的分析方法，歸屬各C、H 信號(hào)及C、H 相關(guān)信號(hào)，推斷糖苷鍵的連接方式。

取防風(fēng)多糖SP800203 適量，與溴化鉀粉末研磨均勻，壓片，置傅里葉變換紅外光譜儀紅外掃描（400～4 000 cm-1）。顯示有O-H 伸縮振動(dòng)特征吸收峰（3 398 cm-1），C-H 伸縮振動(dòng)特征吸收峰（2 946、2 903 cm-1），C=O 伸縮振動(dòng)特征吸收峰（1 742 cm-1），C-H 變角振動(dòng)特征吸收峰（1 412、1 331、1 236 cm-1），C-O 伸縮振動(dòng)特征吸收峰（1 101 cm-1），β-型糖苷鍵特征吸收峰（915 cm-1），α-型糖苷鍵特征吸收峰（832 cm-1）。

為了得到箱梁翼緣板的準(zhǔn)確正應(yīng)力，將預(yù)應(yīng)力加在兩腹板上的點(diǎn)10位置處，如圖1所示，兩根鋼束的預(yù)應(yīng)力合力大小均為300 N。在ANSYS中利用LINK8單元模擬預(yù)應(yīng)力作用，通過(guò)賦予初始應(yīng)變得到所需預(yù)應(yīng)力。研究初期，也曾用等效荷載加在同一位置處，提取的結(jié)果和用LINK8單元算出來(lái)的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，最后發(fā)現(xiàn)誤差較小，說(shuō)明用LINK8單元模擬縱向預(yù)應(yīng)力筋是準(zhǔn)確的。跨中施加的集中荷載P亦可模擬車輪荷載作用下在跨中的等效集中力。

取防風(fēng)多糖SP800203 30 mg，以D2O 0.6 mL溶解，冷凍干燥，重復(fù)操作3 次。以D2O 0.6 mL 溶解，于44.85 ℃進(jìn)行NMR 分析，記錄1H-NMR、13CNMR、1H-1H COSY、HSQC 和HMBC 圖譜。在防風(fēng)多糖SP800203 的1H-NMR 譜中（圖6），δH5.50～4.70 顯示糖的H-1（端基氫）信號(hào)，δH4.70～3.05 顯示糖的非端基氫信號(hào)；δH5.10 為吡喃型阿拉伯糖的H-1 信號(hào)，δH5.43 為呋喃型阿拉伯糖的H-1信號(hào)，δH4.72 為→3) Rhap(1→的H-1 信號(hào)，δH5.29為→2) Galp(1→的H-1 信號(hào)，δH5.24 為→2)GalAp(1→的H-1 信號(hào)，δH5.03 為→3) Galp(1→的H-1 信號(hào)，δH5.08 為→4) GalAp(1→和→2,3) GalAp(1→重疊的H-1 信號(hào)；δH4.47、4.44 為→2) Galp(1→亞甲基的氫信號(hào)，δH4.46、4.39 為→3) Galp(1→亞甲基的氫信號(hào)，δH1.40 為→3) Rhap(1→甲基的氫信號(hào)。

圖6 SP800203 的1H-NMR 譜 (A) 和13C-NMR 譜 (B)Fig. 6 1H-NMR spectrum (A) and 13C-NMR spectrum (B) of SP800203

在防風(fēng)多糖SP800203 的13C-NMR 譜中（圖6），δC104.0～95.0 顯示糖的C-1（端基碳）信號(hào)，δC82.0～60.0 顯示糖環(huán)上的碳信號(hào)；δC95.4 為呋喃型阿拉伯糖的C-1 信號(hào)，δC100.8 為吡喃型阿拉伯糖的C-1 信號(hào)，δC99.4 為→3) Rhap(1→的C-1 信號(hào)，δC103.4 為→2,3) GalAp(1→的C-1 信號(hào)，δC103.3為→4) GalAp(1→的C-1 信號(hào)，δC103.2 為→3) Galp(1→的C-1 信號(hào)，δC102.4 為→2) Galp(1→的C-1信號(hào)，δC102.6 為→2) GalAp(1→的C-1 信號(hào)；δC19.8 為→3) Rhap(1→的C-6（甲基碳) 信號(hào)，δC173.9 附近為糖醛酸的C-6（羰基碳）信號(hào)。

在防風(fēng)多糖SP800203 的1H-1H COSY 譜中（圖7），δH/H5.43/3.93 為Araf(1→的H-1/H-2 相關(guān)信號(hào)，δH/H5.10/4.09 為Arap(1→的H-1/H-2 相關(guān)信號(hào)，δH/H4.72/4.09為→3) Rhap(1→的H-1/H-2相關(guān)信號(hào)，δH/H5.24/4.52 為→2) GalAp(1→的H-1/H-2 相關(guān)信號(hào)，δH/H5.29/4.11 為→2) Galp(1→的H-1/H-2 相關(guān)信號(hào)，δH/H5.03/3.07為→3) Galp(1→的H-1/H-2相關(guān)信號(hào)，δH/H5.08/3.86 為→4) GalAp(1→的H-1/H-2 相關(guān)信號(hào)，δH/H5.08/4.58 為→2,3) GalAp(1→的H-1/H-2 相關(guān)信號(hào)；δH/H4.74/4.09 為→3) Rhap(1→的H-2/H-3相關(guān)信號(hào)，δH/H4.58/4.13 為→2,3) GalAp(1→的H-2/H-3 相關(guān)信號(hào)，δH/H4.52/4.11 為→2) GalAp(1→的H-2/H-3 相關(guān)信號(hào)，δH/H4.34/4.11 為→2) Galp(1→的H-2/H-3 相關(guān)信號(hào)。

圖7 SP800203 的1H-1H COSY 譜Fig. 7 1H-1H COSY spectrum of SP800203

在防風(fēng)多糖SP800203 的HSQC 譜中（圖8），δC/H95.4/5.43 為Araf(1→的C-1/H-1 相關(guān)信號(hào)，δC/H100.8/5.10 為Arap(1→的C-1/H-1 相關(guān)信號(hào)，δC/H99.4/4.72 為→3) Rhap(1→的C-1/H-1 相關(guān)信號(hào)，δC/H102.6/5.24 為→2) GalAp(1→的C-1/H-1 相關(guān)信號(hào)，δC/H102.4/5.29 為→2) Galp(1→的C-1/H-1 相關(guān)信號(hào)，δC/H103.2/5.03 為→3) Galp(1→的C-1/H-1 相關(guān)信號(hào)，δC/H103.3/5.08 為→4) GalAp(1→的C-1/H-1相關(guān)信號(hào)，δC/H103.4/5.08 為→2,3) GalAp(1→的C-1/H-1 相關(guān)信號(hào)。具體碳?xì)湎嚓P(guān)信號(hào)歸屬見表3。

表3 SP8002031H-NMR 和13C-NMR 的信號(hào)歸屬Table 3 1H- and 13C-NMR chemical shift assignments of SP800203

圖8 SP800203 的HSQC 譜Fig. 8 HSQC spectrum of SP800203

在防風(fēng)多糖SP800203 的HMBC 譜中（圖9），δC/H73.3/5.24 為→2,3) GalAp(1→的C-3 和→2)GalAp(1→的H-1 相關(guān)信號(hào)，表明在多糖中存在→2)GalAp(1→3) GalAp(2) (1→結(jié)構(gòu)片段的重復(fù)單元；δC/H81.4/5.24 為→3) Galp(1→的C-3 和→2) GalAp(1→的H-1 相關(guān)信號(hào)，表明在多糖中存在→2) GalAp(1→3) Galp(1→結(jié)構(gòu)片段的重復(fù)單元；δC/H81.5/5.10為→2) GalAp(1→的C-2 和Arap(1→的H-1 相關(guān)信號(hào)，表明在多糖中存在Arap(1→2) GalAp(1→結(jié)構(gòu)片段的重復(fù)單元；δC/H81.5/5.08 為→2) GalAp(1→的C-2 和→2,3) GalAp(1→的H-1、→2) GalAp(1→的C-2 和→4) GalAp(1→的H-1 相關(guān)信號(hào)，表明在多糖中存在→2,3) GalAp(1→2) GalAp(1→和→4) GalAp(1→2) GalAp(1→結(jié)構(gòu)片段的重復(fù)單元；δC/H73.3/5.08 為→2,3) GalAp(1→的C-3 和→4)GalAp(1→的H-1 相關(guān)信號(hào)，表明在多糖中存在→4)GalAp(1→3) GalAp(2) (1→結(jié)構(gòu)片段的重復(fù)單元；δC/H81.4/5.03 為→3) Galp(1→的C-3 和→3) Galp(1→的H-1 相關(guān)信號(hào)，表明在多糖中存在→3) Galp(1→3) Galp(1→結(jié)構(gòu)片段的重復(fù)單元；δC/H80.0/5.03 為→3) Rhap(1→的C-3 和→3) Galp(1→的H-1 相關(guān)信號(hào)，表明在多糖中存在→3) Galp(1→3) Rhap(1→結(jié)構(gòu)片段的重復(fù)單元；δC/H103.4/4.58 為→2,3) GalAp(1→的 C-2 和→2,3)GalAp(1→的H-1 相關(guān)信號(hào)，表明在多糖中存在→2,3)GalAp(1→2) GalAp(3) (1→結(jié)構(gòu)片段的重復(fù)單元；δC/H102.6/4.58 為→2,3) GalAp(1→的C-2 和→2)GalAp(1→的H-1 相關(guān)信號(hào)，表明在多糖中存在→2)GalAp(1→2) GalAp(3) (1→結(jié)構(gòu)片段的重復(fù)單元；δC/H102.6/4.52 為→2) GalAp(1→的C-2 和→2)GalAp(1→的H-1 相關(guān)信號(hào)，表明在多糖中存在→2)GalAp(1→2) GalAp(1→結(jié)構(gòu)片段的重復(fù)單元；δC/H102.6/4.51 為→4) GalAp(1→的C-4 和→2) GalAp(1→的H-1 相關(guān)信號(hào)，表明在多糖中存在→2) GalAp(1→4) GalAp(1→結(jié)構(gòu)片段的重復(fù)單元；δC/H95.4/4.51 為→4) GalAp(1→的C-4 和Araf(1→的H-1 相關(guān)信號(hào)，表明在多糖中存在Araf(1→4) GalAp(1→結(jié)構(gòu)片段的重復(fù)單元；δC/H99.4/4.13 為→2,3)GalAp(1→的C-3 和→3) Rhap(1→的H-1 相關(guān)信號(hào)，表明在多糖中存在→3) Rhap(1→3) GalAp(2)(1→結(jié)構(gòu)片段的重復(fù)單元。以上糖殘基信號(hào)歸屬及連接關(guān)系見表4。

表4 SP800203 HBMC NMR 信號(hào)歸屬及糖殘基連接關(guān)系Table 4 HMBC NMR spectral data and connected relations of residues of SP800203

圖9 SP800203 的HMBC 譜Fig. 9 HMBC spectrum of SP800203

結(jié)合以上測(cè)定結(jié)果，可以推測(cè)防風(fēng)多糖SP800203 的結(jié)構(gòu)見圖10。

圖10 SP800203 的結(jié)構(gòu)式 (R1 和R2 為多糖支鏈)Fig. 10 Putative structure of SP800203 (R1 and R2 mean branches in polysaccharide)

2.3 防風(fēng)多糖SP800203 免疫調(diào)節(jié)活性

表5 SP800203 對(duì)巨噬細(xì)胞NO、TNF、IL-1β 和IL-6 含量的影響Table 5 Effects of SP800203 on content of NO, TNF, IL-1β and IL-6

2.3.2 防風(fēng)多糖SP800203 對(duì)斑馬魚免疫細(xì)胞的影響 參照文獻(xiàn)方法[11]，以免疫細(xì)胞熒光標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg（lyz：DsRed）和野生型AB 系斑馬魚為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，選用長(zhǎng)春瑞濱誘導(dǎo)免疫低下模型，分別通過(guò)熒光和中性紅染色法檢測(cè)空白組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、給藥組斑馬魚體內(nèi)免疫細(xì)胞密度和巨噬細(xì)胞數(shù)目，結(jié)果見表6。與空白組相比，模型組（免疫低下模型）的免疫細(xì)胞密度、巨噬細(xì)胞數(shù)目顯著降低；與模型組相比，防風(fēng)多糖SP800203 各濃度組免疫細(xì)胞密度、巨噬細(xì)胞數(shù)目顯著上升，具有一定的免疫調(diào)節(jié)活性。

3 討論

防風(fēng)多糖SP800203 為自防風(fēng)中分離得到的新的均一多糖，相對(duì)分子質(zhì)量約為7.14×104，糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75.73%，由鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖和半乳糖醛酸組成，單糖物質(zhì)的量比為2.8∶6.7∶6∶84.5。主鏈由半乳糖醛酸聚合而成，通過(guò)β、α 糖苷鍵相連，2 條支鏈分別由阿拉伯糖、半乳糖醛酸、半乳糖、鼠李糖，以及阿拉伯糖、半乳糖醛酸、半乳糖聚合而成，二者分別通過(guò)β、α 糖苷鍵與主鏈相連。采用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和斑馬魚實(shí)驗(yàn)研究防風(fēng)多糖SP800203的免疫調(diào)節(jié)活性，結(jié)果顯示，防風(fēng)多糖SP800203 能夠顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放NO、TNF-α、IL-1β 和IL-6，使免疫細(xì)胞密度、巨噬細(xì)胞數(shù)目顯著上升，有一定的免疫調(diào)節(jié)活性。該結(jié)果豐富了防風(fēng)多糖的研究成果，為闡明防風(fēng)多糖免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)，為防風(fēng)的進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突