吳建軍 ,鄒 劍 ,馬致潔 ,徐 愿 ,鞏仔鵬 ,劉學偉
1. 國家自然科學基金委員會 醫(yī)學科學部 十處,北京 100085
2. 浙江中醫(yī)藥大學藥學院,浙江 杭州 310053
3. 暨南大學藥學院,廣東 廣州 511443
4. 首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院 藥學部,北京 100050
5. 中日友好醫(yī)院 中醫(yī)風濕病科,北京 100029
6. 貴州醫(yī)科大學藥學院 貴州省藥物制劑重點實驗室 省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室 民族藥與中藥開發(fā)應用教育部工程研究中心,貴州 貴陽 550004
本文總結了2005—2023 年國家自然科學基金(Natural Science Foundation of China,NSFC)中藥學科中獲得資助的中藥多糖相關項目的總體情況,對資助項目的主要研究內容和研究熱點進行梳理,分析中藥多糖的研究現狀和存在的問題,旨在為從事中藥多糖的科研人員提供借鑒和參考。
2005—2023 年,NSFC 中藥和中西醫(yī)學科(2005—2009 年為生命科學部九處,2010—2013 年為醫(yī)學科學部八處,2014—2023 年醫(yī)學科學部十處),共資助中藥多糖相關的NSFC 項目290 項,資助率占中醫(yī)藥領域總資助總項目的1.44%,資助總經費為10 649 萬元,占中醫(yī)藥領域項目總資助總經費的1.27%。
從資助年份分析(圖1),2005—2014 年間,中藥多糖的NSFC 資助項目數保持總體穩(wěn)定增長的趨勢,2015 年和2016 年均處于較低值,2017~2022年保持平穩(wěn)的趨勢,2023 年獲資助29 項,處于歷史最高峰。
圖1 2005—2023 年“中藥多糖”相關的NSFC 項目資助情況Fig. 1 Funding status of TCM polysaccharide-related research projects funded by NSFC from 2005 to 2023
從項目類別分析(圖1),除2005 年1 個重點項目,2006、2010、2013 和2021 年各有1 個專項基金項目,2008 年1 個國際(地區(qū))合作與交流項目,2012 年1 個國家杰出青年科學基金項目,2015 年1個應急管理項目,2018 年1 個海外及中國港澳學者合作研究基金項目外,其余獲資助的研究類項目均集中在面上項目(92 項)、青年科學基金項目(119 項)、地區(qū)科學基金項目(70 項)3 個項目類別。
從項目代碼選擇分析(圖2),H3202 中藥鑒定和H3217 中藥毒理方向沒有中藥多糖相關項目,提示了多糖在中藥鑒定方面研究的相對缺乏以及具有良好的生物安全性;除了其余代碼均有分布,其中H3203 中藥藥效物質方向最多,共58項,占 20.07%,提示越來越多的多糖被發(fā)現是中藥發(fā)揮效應的活性物質基礎;中藥藥理方面,H3212 中藥抗炎與免疫藥理、H3210 中藥抗腫瘤藥理和H3211 中藥內分泌與代謝藥理分別為32、25、23 項,為中藥多糖項目選擇最多的3 個藥理方向,提示了中藥多糖的藥理研究熱點主要集中在抗炎、免疫調節(jié)與抗腫瘤、內分泌與代謝等。
圖2 2005—2023 年獲NSFC 資助“中藥多糖”相關項目的代碼選擇情況Fig. 2 Selecting code status of TCM polysaccharide-related research projects funded by NSFC from 2005 to 2023
通過對2005—2023年NSFC資助中藥多糖項目的統(tǒng)計分析得知,除了1 項國家杰出青年科學基金項目不涉及具體研究方向,其余獲得資助的289 個項目中,有240 項是對中藥多糖的“活性及作用機制”方向進行研究,占83.04%;有21 項是“構效關系”方向,占7.27%;有12 項是“吸收或代謝”方向,占4.15%;剩余16 項是其他方向,占5.54%。
中藥多糖“活性及作用機制”的資助項目研究包括免疫調節(jié)與抗腫瘤(共103 項,占42.92%),調節(jié)糖脂代謝及改善糖尿病并發(fā)癥(共36 項,占15.00%),神經系統(tǒng)保護及調節(jié)作用(共21 項,占8.75%),保肝(共22 項,占9.17%),改善心血管疾病及血液系統(tǒng)疾?。ü?7 項,占7.08%),保護腸道(共12 項,占5.00%),以及作用于腎(共7項,占2.92%)、肺(共5 項,占2.08%)、皮膚(共4 項,占1.67%)、生殖系統(tǒng)(共4 項,占1.67%)、抗病毒(共4 項,占1.67%)、眼(共2 項,占0.83%)、骨(共2 項,占0.83%)、胃(共1 項,占0.41%)等方面(表1)。
由于在設計指標體系的過程中,默認指標層因素都是同等重要,因此,在同一因素層下的各指標因素都具有相同的權重,這也說明他們具有相同的影響力,例如對企業(yè)有形資源能力而言,固定資產情況、現金資源充足度、市場占有度、員工數量、員工素質以及網站注冊會員數都具有相同程度的影響力,其他指標層各因素權重結果分析以此類推。
多糖類成分作為中藥中一類不可忽視的化學成分,越來越多的多糖被發(fā)現可以通過不同的機制發(fā)揮各種生物活性,提示中藥多糖具有非常廣闊的開發(fā)前景。但是在項目研究過程中,也存在多糖純度測定及結構表征不充分,研究模型不合理,量效系不明確以及機制研究不到位等一系列問題。需要承認的是,現階段多糖的研究水平明顯落后于同是水溶性大分子的蛋白質。因此,研究人員需借助現代科技手段,開發(fā)多糖研究的新關鍵技術,進而充分利用我國豐富的中藥多糖資源,從而推動中藥多糖的現代化研究。
多糖的構效關系是指多糖的化學結構,包括一級結構和高級結構,與其生物活性的關系?;谫Y助項目研究結果,發(fā)現中藥多糖生理活性,與其相對分子質量、單糖組成、糖苷鍵類型、支化程度及高級結構等結構特征密切相關。例如,大黃多糖(資助號30973914)通過作用于巨噬細胞甘露糖受體(macrophage mannose receptor,MMR)發(fā)揮免疫調節(jié)作用,作用強弱與其所含甘露糖含量、空間暴露程度有關,降低相對分子質量大小更有利于暴露更多的甘露糖殘基,從而增強其通過MMR 發(fā)揮免疫調節(jié)作用。黑果枸杞葉多糖LRLP3(資助號81703817)在不同程度失去支鏈阿拉伯糖基后,其免疫調節(jié)活性降低甚至消失,說明阿拉伯糖基支鏈是LRLP3 發(fā)揮免疫活性的結構基礎。含有阿拉伯半乳聚糖(arabinogalactan,AG)基糖鏈的I 型聚鼠李半乳糖醛酸(rhamnogalacturonan I,RG-I)結構域和聚半乳糖醛酸(homogalacturonan,HG)結構域同時構成的人參酸性果膠分子(資助號30973857),比單獨的RG-I 結構或單獨的HG 結構組成的果膠級分抗腫瘤活性好,并發(fā)現人參中性多糖主要通過調節(jié)免疫實現抗腫瘤作用,而酸性多糖既能調節(jié)免疫又能直接作用于腫瘤細胞抑制其生長, 表明各結構域單元存在協(xié)同作用。(1,4)-GlcpNAc-(1,4)-Glcp和 (1,4)-Galp糖鏈是當歸酸性多糖(資助號81173513)的抗白血病的重要活性單元,(1,2)-Manp位點和結構與活性無明顯關系,酸化后活性喪失提示當歸多糖抗白血病活性與其糖鏈高級結構密切相關。清熱類中藥多糖(資助號818729772)的單糖組成多樣和多分支的結構特點與其抗補體活性相關,并且酸性多糖中糖醛酸含量對抗補體活性有重要作用。蠐螬多糖(資助號81473329)中1,3-Galp、α-D-1-GalpA、1,6-Galp殘基的存在可明顯增加與半乳凝素-1(galectin-1,Gal-1)的親和作用,(1,4)-2-去氧-Glcp-(1,6)-2-去氧-半乳雜聚糖具有顯著的Gal-1 抑制作用,該抑制作用與 (1,6)-2-去氧- Galp物質的量比含量呈正相關,而與多糖中Ara、Man、Glc、Fuc、Xyl 的含量及其高級結構無關,并且發(fā)現糖殘基的硫酸酯化和羧甲基化修飾對Gal-1 的抑制無增強作用。具有RGⅠ型結構特征的脹果甘草果膠多糖GiP-B1(資助號81360626)參與免疫調節(jié)作用的結構區(qū)域主要是α-D-GalpA 聚糖區(qū)和Rha-GalpA 聚糖區(qū),中性糖支鏈對其活性也有一定的影響。麻黃多糖ESP-B2、ESP-B3、ESP-C1、ESP-C2、ESP-C3、ESP-C4 和ESP-C5(資助號30973870)中糖醛酸的含量、相對分子質量、單糖組成都基本相當,而體外脾細胞增殖抑制作用明顯不同,表明除了糖醛酸的含量、相對分子質量、單糖組成影響多糖活性外,糖鏈的分支結構與活性之間也存在密切的關系。而多糖的分支與活性的關系并不是一種簡單的線性關系,分支度適中的多糖往往具有較高的活性,而分支度過高或過低的多糖其活性都有限。
可以明確的是,中藥多糖的化學結構特征能夠影響其生物活性有無及強弱,但鑒于多糖化學結構的異常復雜性,大量活性多糖結構并未得到完全闡明,導致關于其結構與活性的具體構效關系的研究并不深入,成為中藥多糖研究的薄弱環(huán)節(jié)。因此,多糖化學結構,包括初級結構和高級結構的研究仍是中藥多糖研究的一個重要內容。隨著后續(xù)多糖化學結構解析新技術、新方法的出現,多糖的構效關系研究必將得到更加清晰的闡明。
盡管多糖的口服吸收方式及代謝途徑尚未形成定論,但一直處于不斷研究與探索之中,從資助項目研究成果中可得知,多糖口服吸收方式主要存在下列3 種途徑。
2.3.1 以完整分子的形式通過腸黏膜被直接吸收項目81872994 中,研究人員采用放射性同位素99mTc 標記了太子參均一多糖PHP,并證實多糖標記物以完整分子通過腸粘膜吸收進入體循環(huán)。
2.3.2 被小腸派氏結上的M 細胞以內吞方式進行吸收 項目81703798 中,研究結果發(fā)現3 個不同相對分子質量的醋柴胡活性均一多糖VBCP1-4、VBCP3-4、VBCP5-1 可能通過小腸派氏結上的M 細胞以內吞途徑進行吸收。
2.3.3 經腸道菌群酵解后被吸收利用 黃芪多糖APS(資助號81673662)干預后,小鼠腸道菌群結構發(fā)生改變,代謝物乙酸和2-羥基丁酸的含量增加。薜荔果多糖FPLP(資助號81803794)通過調節(jié)腸道菌群,進而提高其代謝產物肉豆蔻油酸水平,進而發(fā)揮改善糖脂代謝的作用。麥冬多糖MDG-1(資助號81173516)調節(jié)小鼠腸道菌群結構,并提高腸道、糞便及尿液中的短鏈脂肪酸的含量,均提示這些多糖被腸道菌群發(fā)酵成包括短鏈脂肪酸、長鏈脂肪酸等在內的各種代謝產物,通過腸道吸收后發(fā)揮各種生物活性。
與中藥多糖的“活性與作用機制”研究相比,其“吸收與代謝”的研究非常缺乏,而揭示多糖的吸收方式,分布特點和代謝途徑能夠為活性多糖的篩選,藥效模型的建立以及多糖藥物的臨床研究提供重要的科學依據。因此,在后續(xù)的研究過程中,需多加關注中藥多糖“吸收與代謝”方面的研究。
除了上述3 個主要研究方向,關于多糖在中藥中積累的分子調控機制研究、多糖糖譜技術用于中藥種質資源評價研究,中藥多糖的冷凍干燥變化規(guī)律研究,中藥多糖在功能醫(yī)藥材料中的應用研究均有所涉及。例如,項目30500653、81360611、82204569 和82304680 分別對寧夏枸杞、鐵皮石斛、黨參和白及中多糖成分積累的分子機制進行研究,為闡明枸杞多糖、鐵皮石斛多糖、黨參多糖和白及多糖的生物合成機理以及藥材的道地性品質形成規(guī)律提供科學依據。項目81603230 通過對金線蓮基原植物及其近緣種多糖的結構特征和生物活性進行分析,建立金線蓮多糖特征圖譜組,進而對金線蓮的品質進行評價,該研究為以富含多糖的中藥材品質評價的研究提供了新思路。項目30672671 以黃芪多糖、枸杞多糖和三角河蚌多糖為研究對象,對其在冷凍干燥過程中的內在規(guī)律進行了探索性研究,并提出提高中藥多糖類成分共晶點溫度或共熔點溫度的方法提高凍干速率、縮短凍干周期、降低凍干成本的科學假說。項目81160521和81303231 均以白及多糖為研究對象,為其在藥用輔料與生物材料方面的應用進行研究。
通過對2005—2023年NSFC中藥多糖資助項目的關鍵詞繪制云圖(圖3),以了解資助項目的主要研究熱點,結果發(fā)現項目關鍵詞中頻次最高的5 個詞匯分別是“多糖”(45 次)、“黃芪多糖”(37 次)、“腸道菌群”(29 次)、“枸杞多糖”(18 次)、“當歸多糖”(14 次)。
圖3 2005—2023 年獲NSFC 資助“中藥多糖”相關項目的關鍵詞詞云Fig. 3 Keyword cloud of TCM polysaccharide-related research projects funded by NSFC from 2005 to 2023
黃芪多糖是中藥多糖研究的最大熱點。黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge. var.mongholicus(Bge.) Hsiao 或膜莢黃芪A.membranaceus(Fisch.) Bge.的干燥根,是常用補中益氣中藥,具有健脾補中、升陽舉陷、益衛(wèi)固表的功效。研究表明,黃芪中含有多糖、皂苷、黃酮、氨基酸等多種化學成分,其中,黃芪多糖是黃芪主要的活性成分之一[5]?;贜SFC 已資助黃芪多糖的相關項目研究成果發(fā)現,黃芪多糖在免疫調節(jié)與抗腫瘤、改善糖脂代謝、保肝、改善腸道疾病、糖尿病心肌保護、改善慢性腎衰竭等方面的活性已被明確,并且相關機制已被初步闡明。此外,也存在部分黃芪多糖和其他分子聯(lián)合應用的研究,例如黃芪多糖和大黃素聯(lián)合抗乙肝病毒(資助號30472266),黃芪多糖和小檗堿聯(lián)合調控脂肪細胞游離脂肪酸外溢(資助號30672735)以及聯(lián)合改善胰島素抵抗(資助號81603351)等。
腸道菌群是指定植在機體腸道內并長期與機體相互依存的數以萬億計的微生物群。大多中藥多糖不能被人類基因組中編碼的酶降解,而腸道菌群能夠分泌相關的多糖降解酶,對多糖的降解、吸收及代謝發(fā)生影響,多糖同時參與調節(jié)腸道菌群的結構,最終產生多種多樣的生理活性[6-7]?;贜SFC 已資助相關項目中,中藥多糖關于腸道菌群的研究主要集中在腸道菌群介導的中藥多糖的生物活性以及促進其他化學成分吸收代謝兩方面。腸道菌群介導的中藥多糖生物活性包括影響“腸-肝”軸、“腸-腦”軸、“腸-胃”軸、“腸-肺”軸、“腸-腎”軸及“腸-骨”軸等多個方面;腸道菌群介導的中藥多糖促進其他化學成分吸收代謝方面,例如人參多糖(資助號81274068 和81373946)通過調控腸道菌群進而促進人參皂苷的體內吸收利用,提示了腸道菌群既可介導中藥多糖發(fā)揮多種生理活性,也可促進中藥多糖與中藥小分子的發(fā)揮整體協(xié)同作用。
枸杞為茄科植物寧夏枸杞LyciumbarbarumL.的干燥成熟果實,是常用的一味補益類的中藥,具有滋補肝腎、益精明目的功效。研究表明,枸杞中含有多糖、類胡蘿卜素、酚酸、黃酮等多種化學成分。其中,多糖被認為是枸杞果實中的主要生物活性成分[8]。NSFC 已資助枸杞多糖的相關項目,均是基于枸杞的傳統(tǒng)應用,對枸杞多糖的免疫調節(jié)與抗腫瘤、神經系統(tǒng)保護、改善生殖系統(tǒng)功能以及改善視網膜損傷及保護視神經等活性以及枸杞多糖積累調控機制展開研究。
當歸為傘形科植物當歸Angelicasinensis(Oliv.)Diels 的干燥根,是常用的一味補血類的中藥,具有補血和血、調經止痛、潤腸通便的作用,被稱為“血中圣藥”。研究表明,當歸中含有多糖、揮發(fā)油、黃酮類、有機酸類等多種化學成分,其中,多糖是當歸發(fā)揮造血作用的主要活性成分[9]。NSFC 已資助當歸多糖的相關項目,均是圍繞當歸多糖促進正常造血以及改善鐵代謝障礙性貧血的活性及其機制進行研究,明確了當歸多糖是當歸發(fā)揮補血功能的活性物質基礎,同時也為當歸補血的中醫(yī)理論提供了現代科學內涵。
從資助項目的研究成果可以看出,我國的中藥多糖研究仍存在不少挑戰(zhàn)。
在歷年資助的中藥多糖類項目中,不少中藥多糖的化學結構并未被表征清楚,即便部分多糖的化學結構被表征,但其中絕大多數也僅局限于一級結構,這將導致該課題結論的科學性和可重復性存在一定的風險。多糖化學結構表征最大的難點在于其結構的復雜性導致其解析的繁瑣性。多糖是自然界中存在的結構最復雜的一類高分子聚合物,其結構可分為一級、二級、三級和四級結構。其中,一級結構稱為初級結構,二級、三級和四級結構稱為高級結構。多糖的一級結構包括:相對分子質量,單糖組成的種類和比例,各單糖殘基的鏈接方式,各單糖殘基之間的連接順序,各糖苷鍵的異頭異構形式以及各糖殘基上羥基被取代情況。多糖的二級結構是指多糖主鏈間形成的有規(guī)則的構象,不涉及側鏈的空間排布;多糖的三級結構和四級結構是指以二級結構為基礎,由于糖單位之間的非共價相互作用,導致二級結構在有序的空間里產生的有規(guī)則的構象。此外,組成天然多糖常見的單糖種類大約有20 多種,這就導致天然多糖結構的無限可能性。盡管現在通過化學結合儀器分析的方法,已能夠基本實現對多糖化學結構的表征,但仍存在復雜繁瑣、耗費時間長、無法微量化分析等困難?;诙嗵墙Y構的異常復雜性帶來的結構表征上的困難,導致其制備過程,質量控制,結構修飾及合成,以及后續(xù)的構效關系研究也充滿巨大的挑戰(zhàn)性。
現有的中藥多糖分離純化技術是以離子交換凝膠色譜和凝膠滲透色譜為基本步驟,存在耗時長,得率低等缺點,不適于大規(guī)模制備。因此,開發(fā)高效簡便、快速精準、自動化分析和微量化分析程度高的多糖結構表征的關鍵技術,開發(fā)新型的分離材料,將會使得多糖的制備過程,質量控制,結構修飾及合成和構效關系研究變得更加便捷,進而能夠極大地推動中藥多糖類藥物的基礎性研究和產業(yè)創(chuàng)新。
口服是中藥多糖最常見的給藥方式,多糖具有相對分子質量大、親水性強、多帶電、穩(wěn)定性差等特點,導致多糖不易透過腸道上皮細胞被吸收入血。因此,多糖口服后如何被吸收利用,以原型形式還是降解后形式被吸收利用,吸收程度如何、分布狀況如何、代謝水平如何、排泄及轉化途徑如何等問題,仍缺乏明確的認識。在部分資助項目利用體外模型評價多糖活性中,直接以多糖作用于細胞模型,進而對多糖的活性進行評價和篩選,這是存在問題的。由于多糖的吸收和代謝過程未知,導致多糖是以原型或是代謝物的形式進入體內未知,并且是否能夠接觸到靶細胞也并不清楚,非常容易產生假陽性或假陰性的結果。因此,建立符合多糖生物學特點的活性評價模型,包括動物模型、組織模型、細胞模型、受體模型、計算機虛擬模型等,都需要在明確多糖吸收與代謝途徑的前提下,才能更可靠地評價多糖活性,以及全面闡明多糖的藥理作用機制。
通過分析歷年資助的中藥多糖類項目成果,得知多糖的口服吸收方式存在下列3 種途徑:(1)以完整分子的形式通過腸粘膜被直接吸收;(2)被小腸派氏結上的M 細胞以內吞方式進行吸收;(3)經腸道菌群酵解后被吸收利用。盡管現階段,關于多糖吸收與代謝途徑的研究取得了一點進展,但是不可否認仍需要進一步深入和完善。例如,(1)常用放射性同位素和熒光標記多糖分析多糖的吸收途徑,標記后多糖的穩(wěn)定性如何,檢測到的信號源自多糖原型還是代謝裂解后的片段不能確定,標記是否改變了多糖的高級構型進而影響了吸收方式值得商榷。(2)派氏結的發(fā)育與腸道菌群密切相關,而派氏結內吞多糖是否受腸道菌群的影響并不清楚。(3)腸道菌群為中藥多糖的吸收代謝研究打開了一扇窗,但也存在一些問題。比如,現有最常用的16S RNA 基因測序技術評估復雜菌群的功能有限;腸道菌群的個體差異以及不同時期和不同環(huán)境的動態(tài)演變過程,都對分析造成了巨大的不穩(wěn)定性;整個消化道的菌群組成各不相同,僅對糞便或結腸內容物的菌群進行分析,并不能充分解釋腸道菌群的變化。因此,隨著中藥多糖研究的不斷深入,我們應該了解到其中存在的局限性和不足,進而能夠更好地進行改進。
自古至今,中藥湯劑是中藥第一大劑型,湯劑采用的水提法將會極大地促進中藥多糖類成分的溶出,然而現在關于中藥化學成分的研究熱點均集中于醇溶性的小分子成分,往往忽略了水溶性的多糖類成分,甚至將多糖類成分直接當做無效成分進行去除。近些年來,多糖能夠作為一類單獨的物質基礎進而發(fā)揮多樣的生物活性已經被認可,但中藥多糖與其他中藥小分子之間是否具有整體協(xié)同作用以及具有怎樣的整體協(xié)同作用還并不清楚。項目81274068 和81373946 研究發(fā)現,人參多糖可通過調節(jié)腸道菌群,進而促進包括人參皂苷Rb1、Rc、Re、Rg1、Rd、20(S)-Rg3、20(S)-Rg2等在內的人參皂苷的生物利用度。項目82304692 基于“麥冬均一多糖ORP-1 與魯斯可皂苷元RUS 互作形成的軛合物是協(xié)同貢獻麥冬抗炎藥效的重要物質基礎”的科學假說展開研究。非多糖相關項目81303239 和81603256 均發(fā)現中藥在水煎過程中,有效成分間自組裝形成超分子后會發(fā)生聚集沉降現象,形成自沉淀,即中藥微粒系統(tǒng)。中藥多糖都帶有大量包括羥基、羧基、氨基在內等親水性基團,在煎煮過程中極有可能與小分子之間受各種次級鍵介導,發(fā)生分子識別和自組裝,進而聚集形成中藥微粒。中藥微粒具有怎樣的生物活性,能否促進生物利用度低的小分子吸收代謝?能否影響小分子成分的分布?能否增加不穩(wěn)定成分的穩(wěn)定性?能否降低有毒成分的毒性等均不清楚。因此,揭示中藥多糖與中藥小分子的整體協(xié)同作用,是全面闡明中藥多糖功能的重要補充,同時也能為進一步揭示中藥整體觀的科學內涵提供依據。
雖然我國中藥多糖研究存在不少挑戰(zhàn),但值得肯定的是,經過這些年不斷資助,我國儲備了一批中藥多糖研究相關的科研人才,中藥多糖研究的技術水平得到不斷提高,并取得了若干中藥多糖相關的研究成果。黨的十八大以來,黨中央把中醫(yī)藥工作擺在更加重要的位置,因此,進一步深入開展中藥多糖化學及其生物學方向的研究,努力提高中藥多糖研究的基礎水平和技術手段,促使我國多糖領域的科研水平達到世界領先水平,將為我國中醫(yī)藥傳承創(chuàng)新發(fā)展事業(yè)做出重要貢獻。
利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突