冠突散囊菌Ec-12上清抑制小鼠的傷寒沙門菌機制的初步分析

李兆龍,孔祥瑞,林鋒強,王秀萍,趙 冉,彭小莉,陳常頌*

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所,福州 350013;2.福建省農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所,福州 350013;3.廈門市動物疫病預防控制中心,廈門 361013;4.廈門海關(guān)技術(shù)中心,廈門 361013)

冠突散囊菌(Eurotiumcristatum, EC)是散囊菌目發(fā)菌科散囊菌屬的成員,常見于較低溫和較濕環(huán)境中,其中在陳年餅狀茶葉及安化黑茶多見[1]。整個散囊菌由子囊果和菌絲組成,生長適應性強,營養(yǎng)要求低,可在普通的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)和孟加拉紅培養(yǎng)基中生長[2]。因冠突散囊菌在茯磚茶發(fā)酵過程中出現(xiàn)金黃子囊果,因此俗稱“金花”。

早期劉仲華教授團隊通過篩選及驗證,發(fā)現(xiàn)它能代謝茶葉中的氟,達到降氟功效,提升茶葉的安全性[3]。之后陸續(xù)有研究報道,冠突散囊菌發(fā)酵茶葉后釋放的木質(zhì)纖維,茶多糖,茶色素,蛋白質(zhì),氨基酸,茶多酚,咖啡堿,茶皂素及礦物質(zhì)等成分具有顯著降脂減肥和降糖功效,進一步拓展了它的藥用價值[4-5]。近幾年,冠突散囊菌的生理特征、藥理作用、臨床應用和提取工藝等方面的研究陸續(xù)開展[6]。近期的研究揭示冠散囊菌次級代謝產(chǎn)物對人乳腺癌細胞株 (MCF-7)、人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞株 (SF-268) 和人肺癌細胞株 (NCI-H460) 有較強的抑制活性[7]。冠突散囊菌發(fā)酵分泌的多糖對人類紅白血病K562細胞有一定的抑制作用[8]。冠突散囊菌與其它菌混合發(fā)酵的次級代謝產(chǎn)物對一些人的腫瘤細胞生長也有較強抑制作用[9]。此外,冠突散囊菌上清具有提高機體的免疫和抗氧化功能,抑制某些有害菌增殖等多種醫(yī)藥學價值[10]。

鼠傷寒沙門菌(SalmonellaTyphimurium)是沙門菌屬,鼠傷寒沙門菌B群的成員,其生物學特征與傷寒桿菌相似。作為一種常見的食源性致病菌,常引起人的腸道感染的重要人畜共患病原菌。鼠傷寒沙門菌主要通過污染的食物或水傳播,經(jīng)胃入腸后,在腸道內(nèi)增殖,黏附于腸黏膜上皮細胞,進而侵入固有層,引起腸炎、敗血癥和全身系統(tǒng)性疾病。

冠突散囊菌作為茶葉中常見的菌,它在提高茶葉的安全性,提升茶的色、香、味品質(zhì)方面起著重要的作用,也開展了較多的研究[11-12],但對于冠突散囊菌自身的益生特性,較少開展完整的研究。本研究從安化黑茶中分離篩選到一株菌株Ec-12,通過形態(tài)學和生長特征及 ITS rRNA 基因序列分析進行鑒定,并對其上清抑制鼠傷寒沙門活性和生長穩(wěn)定性,以及保護小鼠抵御鼠傷寒沙門感染的初步機制研究,以期為菌株Ec-12抑制鼠傷寒沙門機理研究和應用開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)、鼠傷寒沙門菌和福氏志賀菌(ShigellaCastellani)為廈門海關(guān)技術(shù)中心分離并鑒定。

1.1.2 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基(g·L-1)組成成分:馬鈴薯 200.0 g,葡萄糖 20.0 g,瓊脂 15.0 g (不加瓊脂為 PDB 培養(yǎng)基),麥芽汁培養(yǎng)基成分組成(g·L-1):麥芽膏粉130.00 g,瓊脂 15.0 g,氯霉素0.1 g,pH為5.8～6.2。

1.1.3 主要試劑和儀器 主要試劑有瓊脂、酵母提取物、葡萄糖和蛋白胨等,購自上海一研生物科技有限公司(上海);安化黑茶購自福建省泉州市安溪縣茶城(泉州);PCR引物合成及測序,福州博尚生物工程有限公司(福州)。細菌基因組DNA提取試劑盒購北京百泰克生物技術(shù)有限公司(DP7121,北京),TaqPCR Mix購自中科瑞泰(北京)生物科技有限公司 和 DNA Marker購自上海嶸崴達實業(yè)有限公司(上海)。恒溫培養(yǎng)箱,上海左樂儀器有限公司(LRH-350F,上海);恒溫振蕩培養(yǎng)箱,江蘇太倉市華美生化儀器廠(THZ96A,太倉);PCR 儀,BIO-RAD美國伯樂(T100,美國);電泳儀,廣州威佳科技有限公司(CBMN-7,廣州);掃描電鏡,蔡司場發(fā)射掃描電鏡(GeminiSEM 360,德國)。

1.1.4 實驗動物 7日齡BALB/c小鼠30只,購自福建吳氏實驗室動物中心。

1.2 方法

1.2.1 冠突散囊菌的分離與篩選 2022 年 6 月從安化黑茶采集含冠突散囊菌孢子,于福建省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所實驗室進行菌株分離及后續(xù)試驗。在無菌操作室,使用滅菌鑷子,鑷取滅菌的10 μL TIP頭,TIP尖頭沾取少量滅菌水,然后用TIP尖頭刮取安化黑茶中間的冠突散囊菌孢子,連TIP頭一起放至1.5 mL馬鈴薯葡萄糖肉湯(PDB)培養(yǎng)基的離心管,封口膜密閉,置恒溫振蕩培養(yǎng)箱28 ℃、190 r·min-1振蕩培養(yǎng)2 h,分別稀釋成10-2、10-3和10-4的懸浮液,吸取80 μL不同濃度稀釋液涂布于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基平板,溫度28 ℃,濕度45%,恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d,挑取不同單菌落劃線純化。

1.2.2 冠突散囊菌EC-12 的鑒定

1.2.2.1 形態(tài)特征觀察:挑取馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基平板上菌株,并將它重新劃線接種于PDA平板,28 ℃ 培養(yǎng) 3 d,對菌落形態(tài)進行觀察。

1.2.2.2 分子生物學鑒定:使用PBS清洗去除培養(yǎng)基,將初步處理的Ec-12菌液,應用細菌基因組DNA 提取試劑盒提取菌株Ec-12的基因組 DNA,以提取的基因組 DNA 為模板,利用真菌擴增的通用引物ITS3F 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)、ITS3R(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)的ITS rRNA 基因進行 PCR 擴增。PCR 反應體系:2×TaqPCR Mix 12.5 μL,ITS3-F(10 μmol·L-1)1.0 μL,ITS3-R (10 μmol·L-1) 1.0 μL,DNA 模板 1.5 μL,ddH2O 9.5 μL。PCR 反應條件:98 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,35 個循環(huán);72 ℃ 10 min。PCR 擴增產(chǎn)物送福州博尚生物科技有限公司進行純化測序。根據(jù)測序結(jié)果,在GenBank數(shù)據(jù)庫下載相關(guān)菌株的ITS rRNA基因序列,利用MEGA 7.0軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 生長特性分析 取之前分離驗證的冠突散囊菌Ec-12株,接種于PDA平板上活化2～3 次,待菌長出黃色囊殼后,用接種環(huán)挑取少量黃色囊殼至5 mL滅菌雙蒸水,振搖均勻,使用細菌計數(shù)法(取一定體積的樣品細菌懸液置于細菌計數(shù)板的計數(shù)池內(nèi),用顯微鏡觀察計數(shù))使得孢子懸浮液濃度為108CFU·mL-1。取2%孢子懸浮液,接種至PDB培養(yǎng)基中,28 ℃、190 r·min-1搖床培養(yǎng)7 d。每隔12 h取出培養(yǎng)瓶,將培養(yǎng)液用濾紙過濾,然后105～110 ℃烘至恒定質(zhì)量。以時間為橫坐標,菌體干質(zhì)量為縱坐標,繪制菌的生長曲線。

1.2.4 冠突散囊菌Ec-12株培養(yǎng)基和增殖時間篩選 挑取1個1 cm大小的冠突散囊菌囊殼,分別置接種至100 mL的PDB、麥牙汁發(fā)酵培養(yǎng)基中,28 ℃、190 r·min-1條件下培養(yǎng) 5 d。根據(jù)前述的生長特性測定菌絲體的質(zhì)量。將菌株Ec-12株置于PDB培養(yǎng)基中培養(yǎng),分別 在 2、3、4、5、6 和 7 d 收集發(fā)酵上清液,12 000 r·min-1離心 20 min 后進行過濾,獲得不同時間段的無菌發(fā)酵液,參考初始培養(yǎng)基篩選中的方法分析不同無菌發(fā)酵液對鼠傷寒沙門菌抑制作用。

1.2.5 冠突散囊菌Ec-12株上清的抑菌譜測定 采用瓊脂擴散法測定Ec-12株上清抑菌活性。先配制LB營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基200 mL,121 ℃滅菌20 min,滅菌稍冷卻后傾注20 mL培養(yǎng)基置于10 cm預先滅菌平板,置無菌操作臺凝固并吹干冷凝水,然后放置冰箱4 ℃過夜。隔日分別取0.5 mL新增殖的金黃色葡萄球菌、福氏志賀菌和鼠傷寒沙門菌107CFU·mL-1(預試驗結(jié)果證實,107CFU·mL-1的對象菌效果較為明顯),加入LB營養(yǎng)瓊脂平板,再用滅菌玻璃推棒,在平板表面均勻涂布,菌液以平板上無液體流淌為宜。然后用滅菌打孔器在制備好的平板上垂直打出6個孔,6個孔分布要均勻,距邊15 mm,用滅菌牙簽將瓊脂塊挑出。然后采用火焰封底為每個孔在酒精燈火焰下烤10 s,進行封底。接著在在每個孔注入20 μL冠突散囊菌Ec-12株發(fā)酵液上清,置37 ℃培養(yǎng)6 h,觀察并用游標卡尺測量抑菌圈直徑的變化。

1.2.6 冠突散囊菌Ec-12株上清的抑制鼠傷寒沙門菌穩(wěn)定性測定

1.2.6.1 酸堿穩(wěn)定性:取15 mL冠突散囊菌Ec-12株上清,用l mol·L-1HCl和l mol·L-1NaOH分別調(diào)節(jié)pH為1.3、3.3、5.3、6.3、7.3、9.3,反應12 h后以鼠傷寒沙門菌作為指示菌,冠突散囊菌Ec-12株上清為對照,參照上節(jié)瓊脂擴散法測定Ec-12株抑菌活性,重復3次,根據(jù)抑菌圈直徑變化評估冠突散囊菌Ec-12株上清抑菌的酸堿穩(wěn)定性。

1.2.6.2 熱穩(wěn)定性:取15 mL冠突散囊菌Ec-12株上清于35、50、65、80、95、110 ℃分別處理1 h后,以鼠傷寒沙門菌作為指示菌,發(fā)酵原液為對照,照上節(jié)瓊脂擴散法測定Ec-12株抑菌活性,重復3次。根據(jù)抑菌圈直徑變化考察其抑菌的熱穩(wěn)定性。

1.2.6.3 紫外穩(wěn)定性:取15 mL冠突散囊菌Ec-12株上清,放置25 W紫外燈下,距離35 cm,分別照射2、4、6、8、10、12 h,以鼠傷寒沙門菌作為指示菌,照上節(jié)瓊脂擴散法測定Ec-12株抑菌活性,重復3次。根據(jù)抑菌圈直徑變化考察其抑菌的紫外光穩(wěn)定性。

1.2.7 冠突散囊菌Ec-12株上清的抑制鼠傷寒沙門菌掃描電鏡觀察 Ec-12株在28 ℃ 下增殖120 h,2 000 r·min-1離心取上清,按1%的添加劑量,加入新增殖的鼠傷寒沙門菌(濃度107CFU·mL-1)37 ℃ 180 r·min-1震蕩培養(yǎng)6 h,然后從對照組和Ec-12上清處理組分別取0.5 mL 鼠傷寒沙門菌菌液,離心并用PBS洗3次,將菌體再分別加入0.5 mL戊二醛固定,然后將樣品固定在石墨帶上,并在每個樣品上涂上大約 24.5 nm 的薄金涂層,隨后在掃描電子顯微鏡獲得高分辨率圖像。

1.2.8 冠突散囊菌Ec-12株上清的抑制鼠傷寒沙門菌試驗 取7日齡BALB/c小鼠30只,分為空白組、試驗組和對照組3組,每組各10只,公母各半。空白組灌服等量PDB培養(yǎng)基的上清。對照組灌服0.5 mL新增殖的鼠傷寒沙門菌(濃度107CFU·mL-1)。試驗組灌服0.5 mL新增殖的鼠傷寒沙門菌(濃度107CFU·mL-1)4 h后,緊接著灌服3次冠突散囊菌Ec-12株上清,每次1 mL,中間間隔8 h。對照組則灌服3次的PDB培養(yǎng)基的上清。每次也是1 mL,中間間隔8 h。觀察并記錄小鼠腹瀉及死淘率。取兩組小鼠的結(jié)腸,4%多聚甲醛內(nèi)固定24 h,然后按HE、PAS和Tunel染色試驗操作規(guī)程進行梯度脫水。脫水結(jié)束后,對結(jié)腸組織進行石蠟包埋,按5 μm厚度切片,接著進行脫蠟然后分別用蘇木素、伊紅染色、PAS和Tunel染色,脫水透化封片,再置顯微鏡下觀察并記錄。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)分析采用 Excel 2017、SPSS19.01和GraphPad Prism 9.0.0(121) 軟件進行。PAS和Tunel染色差異性分析使用Image J軟件進行。

2 結(jié) 果

2.1 冠突散囊菌菌株Ec-12的鑒定

2.1.1 冠突散囊菌菌株Ec-12的形態(tài)及生理生化特征 菌株Ec-12在PDA培養(yǎng)基上生長良好,菌絲呈放射狀生長(圖1A),24 h后菌絲顏色呈深黃色(圖1B),菌落直徑近0.5 cm。72 h菌絲顏色呈褐色,之前周邊的淡黃色開始出現(xiàn)黑褐化(圖1C),再持續(xù)培養(yǎng)菌落顏色全部變成褐色。菌株Ec-12在PDB液體培養(yǎng)基上生長時起24 h,可見小個的絮狀菌絲,隨著震蕩培養(yǎng)時間的延長,菌絲的團狀越大,成散花狀分布于PDB(圖1D)。將菌液接種至加工好的商品紅茶,28 ℃培養(yǎng)120 h,可見茶葉中長出金色的冠突散囊菌孢子囊,20倍的顯微鏡下,可見散花狀的金色冠突散囊菌孢子囊(圖1E)。

A. 生長24 h;B. 生長48 h; C. 生長72 h;D. 菌株Ec-12在PDB培養(yǎng)基中生長;E. 菌株 Ec-12接種至散茶中生長120 h(10×20倍的光學顯微鏡)A. Grow for 24 h; B. Grow for 48 h; C. Grow for 72 h; D. strain Ec-12 was grown in PDB medium; E. Ec-12 was inoculated and grown in loose tea for 120 h

2.1.2 冠突散囊菌Ec-12株的 ITS rRNA 基因序列分析 提取冠突散囊菌Ec-12株基因組 DNA,以其為模板,利用真菌的通用引物對其ITS rRNA 基因序列進行擴增和測序,獲得長度為 1 300 bp 的序列,并提交至GenBank 數(shù)據(jù)庫,登錄號為 OM567391。在 NCBI數(shù)據(jù)庫中經(jīng) BLAST比對后,發(fā)現(xiàn)菌株 Ec-12的ITS rRNA 基因序列與Aspergillussp、Aspergilluscristastus和Eurotiumsp菌等多個菌株的ITS rRNA 基因序列相似度在 97%以上。選擇部分曲霉菌ITS rRNA基因序列,利用 MEGA 7.0 軟件中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明,菌株Ec-12與Aspergillussp及Eurotiumsp有一定差別,且處于一個新的分支(圖2)。結(jié)合形態(tài)和生理生化特征,將菌株Ec-12鑒定為新Eurotiumsp。

分支處數(shù)值表示 bootstrap 值;括號后的數(shù)值為 GenBank 登錄號;標尺代表進化距離 Values at branch represent bootstrap; values in parentheses are GenBank accession number; ruler represents evolutionary

2.1.3 冠突散囊菌Ec-12株生長特性分析 冠突散囊菌Ec-12株在初始12 h生長較為緩慢,菌絲體的干物質(zhì)量較低,在24 h后,冠突散囊菌Ec-12株開始適應生長環(huán)境,吸收培養(yǎng)基中的碳源等營養(yǎng)物質(zhì),促使無性孢子迅速萌發(fā)生長,使得前菌絲體干物質(zhì)的量成倍增加,在恒溫震蕩培養(yǎng)近84 h,菌絲體的干物質(zhì)的量達到了峰值0.058 g·mL-1(見圖3)。然后隨著培養(yǎng)時間的延長,新產(chǎn)生菌絲體的干物質(zhì)量則開始下降,到196 h時,新菌絲體干質(zhì)量則只有0.002 g·mL-1。

圖3 冠突散囊菌Ec-12株不同生長時間菌絲體的干物質(zhì)量的變化Fig.3 Changes in dry mass of mycelium at different growth times of EC-12 strain

2.2 菌株Ec-12上清的抑菌試驗

之前研究報道,冠突散囊菌可提高人體免疫功能、抗氧化和抑菌等多種的醫(yī)藥學價值,為驗證菌株Ec-12對食物中常規(guī)有害菌的抑制作用。本研究通過瓊擴試驗開展冠突散囊菌抑菌作用驗證,結(jié)果證實冠突散囊菌Ec-12株可以抑制金黃色葡萄球菌、福氏志賀菌和鼠傷寒沙門菌。其中尤以抑制鼠傷寒沙門菌作用最為明顯(圖4A～C),抑菌圈達到(10.4±1.5) mm,相較金黃色葡萄球菌[(8.3±1.2) mm]和福氏志賀菌的抑菌圈[(7.9±2.1) mm]差異顯著(P<0.05)(表1)。提取菌株Ec-12上清加入新培養(yǎng)的鼠傷寒沙門菌液,培養(yǎng)6 h后,取1 mL菌液進行掃描電鏡觀察,結(jié)果發(fā)現(xiàn)處理組箭頭標注處出現(xiàn)明顯菌體變形,且覆蓋顆粒狀物質(zhì)。而對照組的鼠傷寒沙門菌液菌體結(jié)構(gòu)完整,菌體外層光滑,菌體形態(tài)完整。提示提取菌株Ec-12上清對致病的鼠傷寒沙門菌抑制作用明顯。

表1 冠突散囊菌Ec-12株對 3種不同食品源的致病菌的拮抗作用

A. 金黃色葡萄球菌;B. 鼠傷寒沙門菌;C. 福氏志賀菌;D.對照組(鼠傷寒沙門菌);E.處理組(冠突散囊菌Ec-12株上清處理后鼠傷寒沙門菌), 處理組箭頭標注處明顯菌體變形,且覆蓋顆粒狀物質(zhì)A. Staphylococcus aureus; B. Salmonella Typhimurium; C. Shigella flexneri; D. Control group (Salmonella Typhimurium); E. Treatment group (Salmonella Typhimurium treated with supernatant of crown-cyst Ec-12 strain), there is obvious bacterial deformation at the arrow mark of the treatment group, and covered with granular materials

圖5 菌株Ec-12抑制鼠傷寒沙門菌引起小鼠的腹瀉率變化Fig.5 Changes in diarrhea rate in mice caused from Salmonella Typhimurium inhibition by Ec-12 strain

圖6 菌株Ec-12抑制鼠傷寒沙門菌引起小鼠的致死率變化Fig.6 Changes in diarrhea rate in mice caused from Salmonella Typhimurium inhibition by Ec-12 strain

2.3 菌株Ec-12上清的抑菌穩(wěn)定性

2.3.1 酸堿穩(wěn)定性 冠突散囊菌株Ec-12的上清經(jīng)不同pH酸堿處理,均表現(xiàn)出較強的抑制活性,在酸性較低時,冠突散囊菌株Ec-12的上清表現(xiàn)出的抑制活性更強,抑菌圈直徑達(10.4±1.1) mm,比對照組(未加酸處理時的上清)還大,這可能是因為酸性對鼠傷寒沙門菌的抑制作用的疊加引起。在pH為9.3時,抑菌圈直徑達(9.3±1.3) mm,明顯大于對照組,這個結(jié)果可能是過高堿性的pH對鼠傷寒沙門菌的增殖起到抑制作用。當pH在5.3～7.3的范圍內(nèi)時,抑菌圈直徑為10.0 mm與未處理組并沒有明顯的變化。說明冠突散囊菌株Ec-12的上清在不同的pH值條件下都表現(xiàn)了較強的抑菌作用,抑菌物質(zhì)具有一定的耐酸堿能力。

2.3.2 熱穩(wěn)定性 冠突散囊菌株Ec-12的上清經(jīng)過不同溫度的熱處理,均表現(xiàn)較強的抑菌作用。在室溫時抑菌圈是(10.1±2.2) mm,隨著處理冠突散囊菌株Ec-12的上清溫度的升高,其抑菌作用稍有減弱,50 ℃時(10.1±1.4) mm,65 ℃時(9.9±3.1) mm,80 ℃(10.1±1.5) mm,95 ℃(9.8±2.5) mm,其中經(jīng)110 ℃熱處理的發(fā)冠突散囊菌株Ec-12的上清對鼠傷寒沙門菌的抑菌圈直徑為對照組的96.03%(降低幅度為3.97%)。因此,說明熱處理對冠突散囊菌株Ec-12的上清的抑菌作用影響不大,抑菌物質(zhì)具有一定的熱穩(wěn)定性。

2.3.3 紫外光穩(wěn)定性 冠突散囊菌株Ec-12的上清經(jīng)過不同時間紫外光照射后,隨著照射時間的延長其抑菌作用減弱,抑菌圈直徑從9.9 mm逐漸下降到9.6 mm,其中經(jīng)12 h紫外光照射處理的冠突散囊菌株Ec-12的上清對鼠傷寒沙門菌的抑菌圈直徑為對照組的96.9%,下降了3.1%。該結(jié)果表明紫外光照射對冠突散囊菌株Ec-12的上清存在一定影響,但并不是影響其抑菌鼠傷寒沙門菌增殖活性的主要因素,該結(jié)果在一定層面證實冠突散囊菌株Ec-12的上清在紫外光照射的條件下能夠相對穩(wěn)定地保持抑菌活性。

2.4 菌株Ec-12上清減少小鼠腹瀉率和致死率

為了進一步驗證冠突散囊菌Ec-12對鼠傷寒沙門菌的抑制作用,本研究選取7日齡BALB/c小鼠30只,分為空白組、試驗組和對照組三組,每組各10只,公母各半。結(jié)果發(fā)現(xiàn),空白組小鼠未見腹瀉及死亡,采食及飲水正常。試驗組小鼠只在開始12 h,2只出現(xiàn)輕微的腹瀉癥狀,隨著冠突散囊菌Ec-12上清的持續(xù)灌服,小鼠不再出現(xiàn)腹瀉,精神狀態(tài)正常。而對照組出現(xiàn)腹瀉嚴重,持續(xù)至試驗結(jié)束(圖 5)。從小鼠死淘率結(jié)果可看出,試驗組只出現(xiàn)1只死亡,而對照組出現(xiàn)6只死亡,死淘率高(圖 6)。此外,結(jié)合HE結(jié)果,對照組的小鼠結(jié)腸的絨毛出現(xiàn)嚴重的脫落和斷裂,隱窩破壞明顯;而試驗組則結(jié)腸的絨毛只出現(xiàn)輕微的影響,隱窩未見明顯影響(圖7B),說明冠突散囊菌Ec-12株上清對鼠傷寒沙門菌引起腹瀉及發(fā)病有一定的作用。

2.5 菌株Ec-12上清緩解了鼠傷寒沙門菌對小鼠腸道黏膜損傷

為了進一步驗證冠突散囊菌Ec-12上清對小鼠傷寒沙門菌的抑制作用,本研究通過結(jié)腸HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn),對照組的小鼠結(jié)腸的絨毛出現(xiàn)嚴重的脫落和斷裂,隱窩的破壞明顯(圖7B)。而試驗組則結(jié)腸的絨毛只出現(xiàn)輕微的影響,隱窩未見明顯影響(圖7C)。PAS染色結(jié)果表明冠突散囊菌Ec-12株上清明顯增加結(jié)腸黏蛋白含量(圖 7E～G),與對照組相比,差異顯著(P<0.05)(圖7A③)。和空白組相比,呈下降的趨勢,但差異不明顯(P>0.05)。結(jié)腸的Tunel染色結(jié)果表明,與對照組相比,冠突散囊菌Ec-12株上清明顯減少結(jié)腸細胞的凋亡率,差異顯著(P<0.05)。和空白組相比,呈下降的趨勢,但差異不明顯(P>0.05)(圖8)。

A. 腸道結(jié)構(gòu)統(tǒng)計指標(***. P<0.05);B～D. HE染色;E～G. PAS染色;B、E. 對照組(對照組灌服鼠傷寒沙門菌);C、F.菌株Ec-12上清灌服組(試驗組為灌服鼠傷寒沙門菌后又灌服菌株Ec-12上清組);D、G.空白組(空白組為只灌服等量PBS)A. Statistical indicators of intestinal structure (***. P<0.05); B-D. HE staining; E-G. PAS staining; B, E. Control group (received Salmonella Typhimurium); C, F. Supernatant irrigation treated group of strain Ec-12 (experimental group received Salmonella Typhimurium and Ec-12 strain); D, G. Mock group (the equal amount of PBS was administered) 圖7 菌株Ec-12抑制鼠傷寒沙門菌引起小鼠腸道顯微結(jié)構(gòu)變化Fig.7 Inhibition of Salmonella Typhimurium by strain Ec-12

A. 對照組(對照組灌服鼠傷寒沙門菌);B.菌株Ec-12上清灌服組(試驗組為灌服鼠傷寒沙門菌后又灌服菌株Ec-12上清組);C.空白組(空白組為只灌服等量PBS);D. 結(jié)腸細胞的凋亡率(***. P<0.05) A. Control group (received Salmonella Typhimurium); B. Supernatant irrigation treated group of strain Ec-12 (experimental group received Salmonella Typhimurium and Ec-12 strain); C. Mock group (the equal amount of PBS was administered); D. Apoptosis rate of colon cells (***. P<0.05)

3 討 論

冠突散囊菌俗稱“金花菌”常見于茯磚茶。而金花的實質(zhì)就是冠突散囊菌第一層閉囊殼呈現(xiàn)出來的金黃色[13]。早期蔡正安等[14]模擬茯磚茶成型工藝和發(fā)花工藝,用非黑茶茶類和藥用植物枝葉為發(fā)花基質(zhì)材料,在未接種冠突散囊菌的條件下成功發(fā)出“金花”試驗。近幾年報道認為,大部分冠突散囊菌菌株可在改良查氏培養(yǎng)基和馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基中生長,且其最適宜生長和產(chǎn)子囊孢子的溫度是25～35 ℃,pH值接近5[15]。此外,周楊艷等[16]認為在液態(tài)培養(yǎng)條件下,冠突散囊菌在添加黑茶湯培養(yǎng)基中生長較好。本研究發(fā)現(xiàn)菌株Ec-12在PDA培養(yǎng)基和28 ℃條件下生長良好,Ec-12菌株的黃色囊殼在24 h顏色開始變深呈金黃色,且在PDB液態(tài)培養(yǎng)時,未加黑茶茶湯,生長良好。此外,冠突散囊菌在恒溫震蕩培養(yǎng)近84 h,菌絲體的干物質(zhì)量達到了鋒值。隨著培養(yǎng)時間的延長,新產(chǎn)生菌絲體的干物質(zhì)量則開始下降,至196 h時,新菌絲體干物質(zhì)量達新低。研究認為后期菌絲體干物質(zhì)量減少,也可能是由于菌絲體自溶造成。上述Ec-12菌株生長條件驗證試驗結(jié)果皆表明,Ec-12菌株生長穩(wěn)定性較好,具有應用于生產(chǎn)的潛力。該結(jié)果為后續(xù)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供一定參考。

冠突散囊菌(Eurotiumcristatum)是散囊菌目發(fā)菌科散囊菌屬的成員。有研究表明E.cristatum可用于調(diào)節(jié)血液/脂質(zhì)平衡和膽固醇代謝,增強免疫力,減輕肥胖和調(diào)節(jié)腸道菌群[17-21],作者之前的研究也發(fā)現(xiàn),攜帶有冠突散囊菌的茶葉粉,能明顯降低小鼠的高血脂質(zhì)、高糖和膽固醇[5]。李響[11]報道冠突散囊菌的次級代謝產(chǎn)物具有抑制細胞生長的作用,在抗癌、抗腫瘤的應用上有很重要的參考價值。有研究從海藻中提取分離的內(nèi)生真菌冠突散囊菌可產(chǎn)生蒽醌類化合物,具有止血、抗菌、瀉下、利尿的作用[21];有報道稱E.cristatum濾液對一些細菌或真菌菌株(如金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和稻瘟病菌)具有顯著的抑制活性[22-23]。覃金球[24]研究發(fā)現(xiàn)冠突散囊菌發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽胞桿菌等有較強的抑制作用。而鼠傷寒沙門菌是一種常導致腸道感染的重要人畜共患病的食源性致病菌,它主要通過污染的食物或水經(jīng)糞口傳播,經(jīng)胃入腸后,在腸道內(nèi)增殖,黏附于腸黏膜上皮細胞,進而侵入固有層,引起的癥狀輕至腸炎重至敗血癥和全身系統(tǒng)性播散引起的內(nèi)臟損害。本研究在體外試驗發(fā)現(xiàn)E.cristatum上清液確實能明顯抑制鼠傷寒沙門菌。且在電鏡下也觀察到Ec-12菌上清液引起鼠傷寒沙門菌變形,并在表層覆蓋一層顆粒樣物,影響了鼠傷寒沙門菌增殖。該結(jié)果與覃金球研究發(fā)現(xiàn)冠突散囊菌發(fā)酵液抑制金黃色葡萄球菌增殖是通過抑制生物膜的形成[24]有些類似,但并不完全一樣,Ec-12菌上清液主要是引起鼠傷寒沙門菌大量的變形,最終影響了它的增殖。此外,耐熱、耐酸堿及紫外穩(wěn)定性試驗也揭示,該菌株的上清在pH、溫度和紫外光的作用下,有較穩(wěn)定的抑制活性。

為了進一步揭示Ec-12菌上清液抑制小鼠的鼠傷寒沙門菌的初步機制,本研究選取7日齡BALB/c小鼠罐服試驗,發(fā)現(xiàn)Ec-12上清明顯抑制鼠傷寒沙門菌引起的腹瀉和死亡。之前的報道認為E.cristatum產(chǎn)生的代謝物能抑制B.subtilis的生長[24]。E.cristatum的代謝物,如 cristatumin A、cristatumin D 和 3-O-(aD-呋喃核糖基) 可抑制某些細菌和真菌(如枯草芽胞桿菌、和金黃色葡萄球菌)[25-30]。因此,作者推測E.cristatum菌株Ec-12上清對金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門菌和福氏志賀菌三種有害菌的抑制作用可能是由E.cristatum合成的次生代謝物引起,但詳細的抑制機理及活性物質(zhì)種類還有待后續(xù)進一步研究。

眾所周知,人體和動物的免疫系統(tǒng)逾50%位于結(jié)腸[31]。結(jié)腸作為消化吸收的尾端,既承擔吸收和分泌,又協(xié)助排糞的作用。因此,結(jié)腸紊亂會導致體內(nèi)的毒素累積,造成體臭、口臭、皮膚暗晦、皮膚過敏、發(fā)疹及色素斑等等問題。結(jié)腸的炎癥常伴隨著大量的體內(nèi)毒素累積也會加重腎臟和肝臟的負擔,進而損及其它重要器官[32-33]。因此,為了進一步揭示這種抑制作用的初步機制,作者重點對鼠結(jié)腸進行HE、PAS和Tunel染色,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ec-12上清確實能保護結(jié)腸絨毛的完整,增加結(jié)腸壁黏液蛋白的分泌,減少了結(jié)腸細胞的凋亡。腸絨毛位于小腸的上皮和固有層向腸腔隆起的指狀突起,內(nèi)含有血小板,由固有膜和上皮向腸腔面突起形成,它不僅具有吸收養(yǎng)料的作用,同時腸絨毛也起到免疫防護屏障作用,它和黏液蛋白都是黏膜免疫系統(tǒng)的一部分[34]。

4 結(jié) 論

通過本研究得出初步的抑制機制,Ec-12菌株上清一方面直接作用于鼠胃腸道內(nèi)的鼠傷寒沙門菌,破壞了鼠傷寒沙門菌結(jié)構(gòu)完整性,同時又作用于鼠的腸道,維護了腸絨毛完整,促進了結(jié)腸黏液蛋白的分泌,減少了結(jié)腸細胞的凋亡,進而降低鼠傷寒沙門菌引起的腹瀉及死亡。