羊偽結核棒狀桿菌的分離鑒定及部分生物學特性分析

宋 艷,袁永豐,錢虹宇,李鑫燦,羅洪艷,王芝英,周作勇

(西南大學動物醫(yī)學院,重慶 402460)

偽結核棒狀桿菌(Corynebacteriumpseudotuberculosis,Cp)為一種革蘭陽性的兼性細胞內寄生菌,可感染多種動物和人并引起慢性炎癥性疾病,如馬潰瘍性淋巴管炎、羊干酪樣淋巴結炎(caseous lymphadenitis,CLA)、牛乳腺炎和人壞死性淋巴結炎等[1],其中以Cp感染羊引起的CLA最為常見。Cp感染山羊可造成多個方面的危害,包括降低生產性能、引起繁殖障礙、在羊體表及內臟器官形成膿腫而影響銷售,以及Cp通過乳汁排出對食用羊奶的人群具有潛在危害等[2]。此外,因為Cp對外界環(huán)境的抵抗力強,且感染病程長,發(fā)病過程緩慢,一旦在羊場感染,則很難清除,是世界公認的難以防治的傳染病之一[1-2]。羊CLA呈全世界分布,廣泛流行,據世界動物衛(wèi)生組織(OIE)統(tǒng)計,全球至少有64個國家確認有該病存在[3]。本病在意大利羊群中的血清陽性率為21.85%[4],巴西東北地區(qū)為30.3%[5],韓國為57.3%[6]。近年來,我國關于Cp感染山羊的報道日益增多,陜西[7]、四川[8]、重慶[9]、云南[10]、福建[11]等多個省市均有該病原感染的報道,其從膿腫樣本中的分離率為39.22%～100.00%。本文通過對所采集的山羊體表淋巴結膿腫病料進行Cp分離及病原特性研究,以明確重慶和貴州發(fā)病羊場Cp感染情況,為該病原防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及小鼠

營養(yǎng)瓊脂購自AOBOX公司;細菌微量生化鑒定管購自青島海博生物技術有限公司;PremixTaq購自TaKaRa公司;核酸染料購自SBS賽百盛公司;藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司;腦心浸出液(BHI)肉湯、萘啶酸、磷霉素鈉購自Solarbio公司。昆明系小鼠購自重慶萊彼特生物科技有限公司。

1.2 引物設計

參考偽結核棒狀桿菌的cp40基因序列(OL347 712.1)設計檢測引物:上游引物SF: 5′-ATGCATAATTCTCCTCHATCAGTC-3′,下游引物SR: 5′-TTATCTAGAACCAGTTGGCTTTCC-3′, 擴增片段為1 140 bp。其余基因,包括編碼延伸因子(fusA)、磷脂酶D(pld)、鐵攝取和調節(jié)相關毒力(因子FagA和FagB)、細菌σ因子(SigE)、小菌毛蛋白(SpaC)、鋅依賴的超氧化物歧化酶(SodC)、蛋白激酶G(PknG)、神經氨酸酶(NanH)和寡肽透過酶(OppB、OppD、OppF)的檢測引物均按文獻設計[9],由上海百力格生物技術服務有限公司合成。

1.3 病料采集方法

對重慶市3個羊場(江津區(qū)、涪陵區(qū)和秀山縣各1個),以及貴州省獨山縣1個羊場患膿腫的山羊采樣,首先對膿腫部位皮膚用碘伏消毒,進而以無菌手術刀片切開皮膚,擠出膿汁或干酪樣物質,收集于滅菌離心管中,低溫送至實驗室,進行病原分離培養(yǎng)。

1.4 細菌分離鑒定

將膿腫樣本接種在含5%兔血瓊脂平板上,37 ℃培養(yǎng)48 h。將疑似Cp的菌落接種在BHI液體培養(yǎng)基(磷霉素濃度為200 μg·mL-1,萘啶酸濃度為4 μg·mL-1)中震蕩培養(yǎng)24 h,再次進行三區(qū)劃線純化。將分離菌接種生化試驗管進行葡萄糖、木糖、甘露醇、麥芽糖、甲基紅、氧化酶和硝酸鹽還原的生化試驗。勾取單菌落至肉湯中培養(yǎng),以該菌液作為模板,以Cp的fusA基因特異性引物進行PCR擴增鑒定是否為Cp[9]。

1.5 細菌致病性試驗

將15只昆明系小鼠隨機分成5組,每組3只,體重為24～28 g。每個區(qū)縣隨機選擇1株Cp(XS2、JJS-4、GZ-5和FL-2-5)在血平板劃線培養(yǎng),挑取單菌落至1 mL BHI肉湯中培養(yǎng)24 h,按每只小鼠腹腔注射0.2 mL菌液(含1.25×107CFU),對照組注射等量生理鹽水,觀察小鼠發(fā)病及死亡情況。

1.6 毒力基因PCR檢測

以ATCC19410為對照,采用菌液PCR方法檢測Cp毒力基因,針對每個毒力基因的PCR反應體系:PremixTaq12.5 μL,毒力基因上、下游引物各1.0 μL,培養(yǎng)Cp菌液2.0 μL,ddH2O 8.5 μL,總體積25.0 μL。反應條件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 40 s,60 ℃ 40 s,72 ℃ 40 s,共30個循環(huán);72 ℃ 2 min。最后對PCR產物用1%的瓊脂糖電泳檢測。

1.7 藥物敏感性試驗及耐藥基因檢測

分別吸取培養(yǎng)至1.5×108CFU·mL-1的Cp菌液200 μL,均勻涂布于血瓊脂平板上,將藥敏紙片置于培養(yǎng)基的適當位置,37 ℃培養(yǎng)48 h,測量并記錄抑菌圈大小,參考美國臨床標準CLSI判定藥敏結果。采用NCBI′s AMRFinderPlus進行Cp全基因組的耐藥基因分析,發(fā)現在Cp菌中主要有2種耐藥基因:氨基糖苷O-磷酸轉移酶APH(3′)-IIa(aph(3′)-IIa)和廣譜A類β內酰胺酶TEM-116(blaTEM-116)。設計aph(3′)-IIa和blaTEM-116特異性引物(aph3-F: 5′-GGAAGGGACTGGCTGCTA-3′和aph3-R: 5′-GCGCGCCTTGAGCCTGGC-3′,預計擴增片段270 bp;blaTEM116-F:5′-ATCGGAGG-ACCGAAGGAG-3′和blaTEM116-R:5′-TTTATCAGC-AATAAACCA-3′; 預計擴增片段279 bp),檢測所分離菌株中耐藥基因攜帶水平。

1.8 細菌fusA測序及序列分析

將fusA的PCR擴增產物送至擎科生物公司進行雙向測序,拼接序列后提交至GenBank。分析所獲得CpfusA序列的相似度,每個羊場選擇一株菌fusA序列,同時在NCBI上選取國內外源自山羊、綿羊、馬、水牛等宿主且已經有明確生物型信息的CpfusA序列,羊生物型(biotypeovis)包括CP001809、NC_017301、CP01079、NC_017301、NZ_CP012695、NZ_CP015100和NZ_MDWN01000001,馬生物型(biotypeequi)包括CP003082、CP012022、NC_017307、NC_017730和NC_017945,以及潰瘍棒狀桿菌(C.ulcerans)、白喉棒狀桿菌(C.diphtheriae)的fusA序列,用DNAstar Lasergene 7.1.0 進行相似度分析,以結核分支桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)的fusA序列為外群,用Clustal X 1.83程序進行序列對位排序,利用MEGA 4.0構建系統(tǒng)進化樹。

2 結 果

2.1 Cp分離鑒定

從重慶市江津區(qū)、涪陵區(qū)和秀山縣,以及貴州省獨山縣發(fā)病山羊中共采集40份膿腫樣本,獲得23分離菌(重慶江津、涪陵、秀山和貴州獨山縣所各分離獲得11、1、10和1株菌),分離率為57.5%。分離菌在血瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)后出現1 mm大小,白色、不透明、干燥的菌落,接種環(huán)易將其在平板上推動,大部分菌株在血瓊脂培養(yǎng)基出現β型溶血環(huán)。革蘭染色鏡檢可見呈藍紫色、球桿狀細菌。選擇部分菌株進行生化試驗,結果顯示葡萄糖、麥芽糖和甲基紅試驗結果為陽性,而木糖、甘露醇、氧化酶和硝酸鹽還原試驗結果為陰性,其結果符合《伯杰氏細菌鑒定手冊》中Cp的生化特征。經Cp的fusA特異性引物PCR檢測,所有分離菌均檢測到fusA基因(圖1)。綜上,23株分離菌經鑒定為Cp。

M. 2000bp DNA相對分子質量標準;1. ATCC19410;2. FL-2-5; 3. GZ-5; 4～13. XS1、2、3、5、6、8、9、10、11、14;14～24. JJS-2、3、4、5、6、7、8、9、14、15、16;黑色箭頭指fusA基因M. 2000 bp DNA marker;1. ATCC19410;2. FL-2-5; 3. GZ-5; 4-13. XS1, 2, 3, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 14;14-24. JJS-2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 16; The black arrow refers to the fusA gene

2.2 毒力基因PCR檢測

對23株Cp菌株毒力基因PCR檢測顯示,所分離的Cp中均攜帶pld、FagA、FagB、SigE、SpaC、SodC、PknG、NanH、OppB、OppD、OppF和cp40基因。

2.3 對小鼠的致病性分析

致病性分析顯示,不同地區(qū)的偽結核棒狀桿菌分離株對小白鼠致病情況不一致,其攻毒后死亡時間為 40～138 h,其中秀山分離株(XS-2)致病力最強,在48 h內全部死亡,其次為江津分離株(JJS-4)和貴州分離株(GZ-5),所有小鼠均在64 h內死亡,最后為涪陵分離株(FL-2-5),攻毒小鼠在138 h內死亡。攻毒后小鼠表現為精神不振、被毛粗亂、扎堆、飲欲食欲減退和活動減少等。剖檢發(fā)現,死亡時間在 48 h 內通常表現為臟器的出血腫脹,而死亡時間超過 48 h 的小鼠通?？梢娕K器多有膿腫(圖2)。

A. Cp感染40 h死亡小鼠的肺有出血(黃色箭頭);B. Cp感染138 h死亡小鼠腸壁上有膿腫(紅色箭頭)A. Lung bleeding of mice died 40 h after Cp infection (yellow arrow); B. Abscesses on the intestinal wall of mice died 138 h after Cp infection (red arrow)

2.4 藥敏試驗及耐藥基因檢測

藥敏試驗顯示,不同地區(qū)分離的Cp其敏感性藥物不完全一致。整體上,所分離Cp對頭孢拉定、丁胺卡那和多西環(huán)素敏感率最高,達95.65%(22/23),其次為青霉素、氨芐西林、四環(huán)素、萬古霉素和環(huán)丙沙星,敏感率為91.30%(21/23),但對呋喃唑酮100%耐藥,對新霉素和卡那霉素耐藥率為82.61%(19/23),對慶大霉素的耐藥率為69.57%(表1)。耐藥基因檢測發(fā)現,所分離Cp菌株中aph(3′)-IIa和blaTEM-116攜帶率分別為0和4.35%(1/23)。對應藥敏試驗結果,發(fā)現檢出blaTEM-116的Cp對β內酰胺類抗生素青霉素和氨芐西林具有耐藥性。

表1 Cp的藥敏試驗結果

2.5 Cp測序及序列分析

將23株Cp的fusA基因PCR擴增產物進行測序并提交GenBank,獲得登錄號:ON969140～ON969162。相似度分析顯示,除JJS-8 (ON969141)與其他Cp的相似度為99.9%,所獲得Cp的fusA序列間相似度為100%。因此每個場選擇1株Cp的fusA序列進一步分析,發(fā)現本次獲得Cp與羊生物型Cp(biotypeovis)的fusA序列相似度為99.8%～99.9%,與馬生物型Cp(biotypeequi)相似度為98.9%～99.2%,與潰瘍棒狀桿菌(C.ulcerans)相似度為94.0～94.3%,與白喉棒狀桿菌(C.diphtheriae)相似度為91.5%～91.7%。多序列比對顯示,羊生物型和馬生物型Cp的fusA差異位點主要在924 bp(羊A/馬C)、927 bp(羊C/馬T)、972 bp(羊G/馬A)、1 113 bp(羊C/馬G)、1 149 bp(羊C/馬T)、1230 bp(羊T/馬G),而與其他羊生物型Cp相比,本次分離Cp的fusA基因序列差異點主要位于第1 389 bp處,所獲得的序列該位點堿基為T,而其余Cp在該位點為C。氨基酸編碼分析顯示,僅在第371位氨基酸有差異,羊生物型為天冬氨酸(D),而馬生物型為谷氨酸(E)?；趂usA的系統(tǒng)進化分析顯示,除去外群,棒狀桿菌共分為四個分支,分別為Cp羊生物型(biotypeovis)、Cp馬生物型(biotypeequi)、潰瘍棒狀桿菌(C.ulcerans)和白喉棒狀桿菌(C.diphtheriae),本研究所分離Cp聚類到Cp羊生物型(biotypeovis),提示所分離獲得的Cp生物型為羊型(圖3)。

枝上數字為Bootstrap 1 000次重復抽樣百分比,三角形表示本研究獲得的Cp fusA基因序列The numbers on the branches representing the bootstrap values of 1 000 samples, and the triangle representing the fusA gene sequences of Cp obtained in this study

3 討 論

Cp是引起綿羊、山羊等反芻動物膿腫病的主要病原之一,在眾多診斷該病原感染的方法中,從膿腫樣本中分離出偽結核棒狀桿菌是最直接和最可靠的方法。本研究采用分離菌的菌落特征、染色特點并結合其延伸因子編碼基因fusA的特異性引物進行PCR鑒定。發(fā)現所采集的山羊體表膿腫樣本中Cp的分離率為57.5%(23/40),高于我國西南地區(qū)(39.22%,40/102)[9],以及墨西哥(35.63%,57/160)[12]、印度拉吉斯坦(51.9%,14/27)[13]報道的該病原分離率,而低于四川(65%,13/20)[8]、陜西(100%,9/9)[7]、埃及(90.07%,254/282)[14]報道的Cp分離率。致病力檢測表明,所分離的Cp具有較強的致病力。以上結果表明,Cp仍然是重慶和貴州部分羊場引發(fā)山羊體表膿腫的重要病原,急需引起當地養(yǎng)殖戶和相關部門的重視。

本研究發(fā)現91.30%以上的Cp對頭孢拉定、青霉素和環(huán)丙沙星等多種抗生素敏感,但有82.61%的Cp對卡那霉素和新霉素耐藥,69.57%的菌株對慶大霉素有耐藥性。關于Cp藥物敏結果的報道差異較大,如魏宇辰等[7]報道Cp對慶大霉素、環(huán)丙沙星敏感率達100%,但對青霉素耐藥或中度敏感。徐志豪等[8]報道,Cp對慶大霉素和青霉素的耐藥率分別達90.00%和95.00%,說明不同地區(qū)分離的Cp藥物敏感性差異較大。本次分離的Cp對卡那霉素和慶大霉素的耐藥率,遠高于本實驗室前期研究結果(10.53%的Cp對卡那霉素耐藥,7.89%的Cp對慶大霉素耐藥),提示即使在相近地區(qū),不同養(yǎng)殖場中分離的Cp對抗生素的敏感性也有較大差異,這可能與不同羊場用藥習慣有關。此外,本研究發(fā)現所有的Cp分離株對呋喃唑酮完全耐藥,這與Li等[9]報道類似,深入發(fā)掘研究該病原對呋喃唑酮耐藥的基因將有利于該病原的防治。關于Cp耐藥基因相關研究極少,TEM是超廣譜β內酰胺酶(ESBLs)主要的耐藥基因型[15],其中TEM-116由Jeong等[16]首次在大腸桿菌和肺炎克雷伯菌臨床分離株中檢測到,本文在國內首次從Cp臨床分離株中檢測出blaTEM-116,且該菌對β內酰胺類抗生素青霉素和氨芐西林具有耐藥性,提示該基因的存在可能與Cp菌株對β內酰胺類抗生素耐藥有關。IIa型氨基糖苷類3′-O-磷酸轉移酶(APH(3′)-IIa)是一種常見的細菌抗氨基糖苷類抗生素的酶[17],主要存在于革蘭陽性菌中,雖然本研究發(fā)現Cp對氨基糖苷類的卡那霉素和慶大霉素耐藥率較高,但并未檢測出aph(3′)-IIa耐藥基因,其原因是否與Cp中可能存在其他類別的氨基糖苷類耐藥基因有待進一步研究。

毒力基因的PCR檢測結果表明,所有分離菌株中均攜帶有pld、FagA、FagB、OppB、OppD、OppF、SodC、SpaC、pknG、NanH、sigE、cp40這些毒力或假定毒力基因,與Li等[9]的研究結果相似。而Guerrero等[12]報道在98.2%的菌株中檢測到FagB基因,Aquino等[18]研究顯示FagC的檢出率為99.40%,FagD的檢出率為95.23%,表明不同地區(qū)的Cp分離菌株毒力基因攜帶情況不完全一致。此外,本研究表明,即使是具有相似的毒力基因譜,其致病力也不完全相同,其原因是否與這些菌株攜帶了其他不同的毒力基因,或同種毒力基因的表達水平不同有關尚待進一步研究。

根據硝酸鹽還原酶試驗結果將Cp分為兩個生物型,其中分離自馬和牛的Cp通常為馬生物型(biotypeequi,硝酸鹽還原陽性),而分離自綿羊和山羊的Cp為羊生物型(biotypeovis,硝酸鹽還原陰性)[19],本研究生化試驗顯示所檢測菌株硝酸鹽還原試驗為陰性,說明分離菌為羊生物型。研究發(fā)現延長因子P(elongation factor P)編碼基因(fusA)表達穩(wěn)定,可作為定量分析Cp基因表達的內參[20]。此外,基于Cp管家基因fusA單獨或聯(lián)合其他管家基因dnaK、infB、groeL1和leuA的進化分析,有助于了解Cp的分子特征[9,21]。Li等[9]構建了基于fusA和16S rRNA的Cp系統(tǒng)進化樹,發(fā)現利用fusA而不是16S rRNA,可以有效將Cp羊生物型和馬生物型區(qū)分開,本文與Li等的研究結果一致,結合所分離的Cp硝酸鹽還原試驗陰性的結果,說明所分離的Cp均為羊生物型(biotypeovis)菌株。此外,本文進一步比對了羊生物型和馬生物型fusA基因序列及編碼氨基酸的差異,發(fā)現其堿基差異位點主要在第924、927、972、1 113、1 149和1 230 bp處,而氨基酸序列僅在第371位點有差異,提示雖然羊生物型和馬生物型Cp的核苷酸差異位點較多,但對其編碼蛋白功能可能影響不大,這些不同位點堿基改變與Cp出現羊生物型和馬生物型分化的關系及具體機制還有待進一步研究。綜上,本研究明確了引起重慶和貴州部分羊場發(fā)生體表淋巴結膿腫的Cp病原特點,為防控該病提供了參考資料。

4 結 論

偽結核棒狀桿菌是引起重慶和貴州部分羊場發(fā)生體表淋巴結膿腫的主要病原,本研究明確其部分生物學特性,為防控該病原提供了參考資料。